Pax7 和层粘连蛋白抗体免疫荧光法鉴定骨骼肌卫星细胞

卫星细胞的精确识别对于研究其在各种生理和病理条件下的功能至关重要。本文提出了一种基于免疫荧光染色的成人骨骼肌切片卫星细胞识别的协议。

免疫荧光是一种有效的方法, 有助于识别不同的细胞类型的组织切片。为了研究所需的细胞数量, 在组织切片上应用特定细胞标记的抗体。在成年骨骼肌中, 卫星细胞 (SCs) 是促进肌肉修复和再生的干细胞。因此, 在不同的生理条件下, 对卫星细胞种群进行可视化和跟踪是十分重要的。在静止的骨骼肌中, SCs 位于基底叶片和肌纤维膜之间。在肌纤维或细胞培养中, 用于识别 SCs 的常用标记是配对盒蛋白 Pax7。本文提出了一种优化 Pax7 免疫荧光协议的骨骼肌切片, 最大限度地减少非特异染色和背景。另外还添加了一种识别基底叶片蛋白质 (层粘连蛋白) 的抗体, 以帮助识别 SCs. 类似的协议也可以用来执行双重或三重标记与 Pax7 和抗体的额外蛋白质的兴趣。

骨骼肌由多核肌肉细胞组成, 称为 myotubes, 组织在肌纤维, 通过收缩产生力量和运动。大多数骨骼肌, 除了一些头面部肌肉, 都来源于一个叫做 somite¹的临时胚胎结构。肌原细胞分层从上皮 somite 变成成细胞。成肌细胞进一步分化为 myotubes 形成多核肌纤维。上述过程称为肌, 其特点是由世俗调控的基因表达控制。肌质前体表达 Pax3 和 Pax7, 而成细胞表达 MyoD 和/或 Myf5 和肌细胞膜表达肌形成蛋白和^球蛋白2, 3.肌肉生长是一个过程中, 肌纤维变得更大, 通过加入更多的 myonuclei 到现有的纤维 (增生) 和增加肌肉纤维大小 (肥厚) 4.在肌肉生长过程中, 有一个可持续的肌细胞来源, 它们具有干细胞的特性, 可以区分和自我更新。这些细胞被称为卫星细胞的基础上, 其物理位置之间的肌膜包裹 (细胞膜的肌纤维) 和^基底叶片5。SCs 在青少年时期 (前2-3 周的产后小鼠) 大力促进肌肉生长, 但在休息的成年肌肉中成为静止的⁶。值得注意的是, 它们可以重新激活, 以应对肌肉损伤, 并分化为新的肌肉细胞, 以修复受损的肌肉⁷。

干细胞的性质使研究的 SCs 相关的基本肌肉生物学和治疗肌肉疾病的⁸。因此, 在过去几十年中, 它一直是一个激烈调查的领域。在剖析 SCs^9、10的遗传学和表遗传学方面取得了巨大进展。在¹¹的方式下开发并优化了用于隔离和识别 SCs就地的技术。免疫荧光染色可通过使用特定的抗体 (包括 Pax7) 识别 SCs。然而, 由于 SCs 的稀缺性和体积小, 结合了成人骨骼肌组织的强烈的自动荧光, 使可视化具有挑战性。在这里, 我们描述了一个免疫荧光染色协议优化的小鼠肌肉组织为 Pax7 和基于现有的方法, 斑马鱼肌肉¹²。此外, 用一个带有明显荧光的层粘连蛋白抗体来识别 SCs 所在的基底层。该议定书一贯允许在所有经过测试的生理条件和发育阶段 Pax7-positive SCs 和肌原体的可视化。

本协议以成年小鼠 (2-6 月)、胫骨前 (TA) 和伸趾肌 (EDL) 为例, 进行免疫荧光染色。所有的步骤处理小鼠和肌肉组织解剖已被批准的动物护理和使用委员会 (ACUC) 的结缔组织国立研究院/NIH。

1. 从小鼠后肢解剖 TA/EDL 肌肉

1. 弄死在 CO₂填充的安乐死室中的鼠标在 NIH 的 ACUC 的指导下。如有需要, 执行颈椎脱位。
2. 将鼠标正面放在解剖垫上 (仰卧位)。将70% 乙醇喷洒到其腹部皮肤上。在鼠标腹部皮肤的中心水平上切开1-2 厘米的开口, 然后通过拉向鼠标脚的开口 deskin 鼠标。露出老鼠后肢的一侧。
3. 使用两个锋利的钳: 使用一把肌腱连接 ta/edl 到脚踝, 并使用另一个打破和剪切的筋膜覆盖 TA/edl。当筋膜脱落后, 使用镊子的锋利尖端, 通过在 ta/edl 肌肉下面运行尖端, 将 ta/edl 从胫骨骨中分离出来。
4. 用剪刀切断脚踝肌腱, 同时用镊子钳住。用剪刀沿从脚踝到膝盖的 ta/edl 的纵线修剪肌肉, 同时用镊子将 ta/edl 从脚踝一侧抬起。切开膝盖侧肌腱, 将整个 TA/EDL 从胫骨中分离出来。

2. 对 TA/EDL 肌肉的低温嵌入

1. 在容器中准备一个液氮浴, e. g, 一个液态氮气杜瓦瓶。把丁烷倒入一个小塑料烧杯 (大约20毫升), 半满。然后把烧杯放在液氮浴中冷冻。几分钟后, 检查丁烷是否冻结。
   注: 液氮可以用一桶干冰代替, 但冻结时间较慢。
2. 将解剖过的 TA/EDL 放置在小塑料注射器柱塞的平坦表面上。充分覆盖 TA/EDL 与几滴最佳切削温度 (O.C.T.) 化合物 (冷冻介质)。
3. 把丁烷烧杯从液氮浴中取出, 用一个温暖的物体 (e. g) 解冻表面, 剪刀柄。快速将 O.C.T. 覆盖的 TA/EDL 放到融化的丁烷中, 将组织冻结。
4. 用镊子将嵌入的组织从柱塞中分离出来, 放入1.5 毫升离心管。在处理更多的样品时, 把管子放进液氮储存。
   注: 在短期 (6 月) 内, 植入的组织可以长期保存在-80 摄氏度 (2 年) 或-20 摄氏度。

3. 恒温器切片

1. 将一滴 O.C.T. 化合物添加到恒温器标本持有者的中心。等到 O.C.T. 化合物几乎凝固。快速将嵌入的 TA/EDL 粘在 O.C.T. 化合物上, 垂直于脚踝侧向下和膝侧。
2. 将标本架装在恒温器上, 在10µm 间隔处切开组织, 在一张幻灯片上收集冰冻切片, 大约4-8 节。
3. 在室温下将部分干燥至少3小时至一夜。
   注意: 虽然在冷冻室中干燥一夜或更长时间是可以接受的, 但它必然会增加自体荧光。为取得最佳效果, 请将切片干燥0.5 小时, 然后立即进行固定和染色步骤。
4. 收集幻灯片框中的幻灯片并立即使用它们, 或将幻灯片存储在-80 °c 或-20 °c 以供以后使用。

4. 荧光染色试剂的制备

1. 准备缓冲区:
   1. 从 10x pbs 中制备2升1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs)。
   2. 在 1x PBS 中准备40毫升4% 多聚甲醛 (粉煤灰), 从16% 个粉煤灰。
   3. 准备2升 PBST: 1x PBS 与 0.1% Triton-100。
   4. 准备50毫升的 PBST: PBST 与2% 牛血清白蛋白 (BSA)。
   5. 准备10毫升的 PBST: PBST 与 2% BSA 和5% 正常山羊血清。
   6. 准备1毫升的阻断溶液。稀释 AffiniPure 片山羊抗鼠 IgG (H + L) (1:10) 在 PBST。
   7. 准备200毫升的柠檬酸1x 缓冲液。
      注意: 上面的解决方案卷足够至少5张幻灯片。卷应根据幻灯片的数量和幻灯片容器的大小进行调整。
2. 准备抗体污渍:
   1. 主要抗体 (工作浓度): 通过稀释 Pax7 单克隆小鼠抗体 (IgG1) (1-5 µg/毫升) + 层粘连蛋白多克隆兔抗体 (0.5-2 µg/毫升) + MF20 单克隆小鼠抗体 (IgG2_b) (0.5-2.5 µg/毫升) 在 PBST。
      注意: MF20 单克隆鼠标抗体 (IgG2_b) 是可选的。
   2. 二级抗体 (工作浓度): 通过稀释山羊抗小鼠 IgG1 交叉吸附二次抗体, 制备1.2 毫升二级抗体混合物, Alexa 氟 488 (0.5-2 µg/毫升) + 山羊抗兔 IgG (H + L) 高度交叉吸附二次抗体,alexa 氟加 555 (0.5-2 µg/毫升) + 山羊抗鼠 IgG2_b交叉吸附二次抗体, Alexa 氟 647 (0.5-2 µg/毫升) 在 PBST b G。
      注: Alexa 647 是可选的。

5. 免疫荧光染色步骤

1. 水化用粉煤灰固定冷冻部分。
   1. 从幻灯片框中删除一些 TA/EDL 冰冻部分幻灯片。在室温下, 在滑动夹盘中加热幻灯片。
   2. 使用液体阻挡笔 (PAP 笔) 绘制一个区域, 其中包括幻灯片上的所有冰冻部分。这个圆圈将阻止解决方案从幻灯片上流出。
   3. 把托盘带到实验室油烟机。在带圆圈区域内的幻灯片上添加300-500 µL 4% 粉煤灰, 以在室温下固定部分10分钟. 在滑动容器中, 至少 3x 5 分钟, 用 1x PBS 清洗粉煤灰。
      注意: 粉煤灰是有毒的, 是有害的废物;应小心操作, 并将其弃置在危险废物容器内。
2. 抗原检索
   1. 用200毫升柠檬酸盐缓冲填充另一个滑动容器。
   2. 将幻灯片转移到容器中。将容器与幻灯片转移到压力锅中, 在高压模式下将幻灯片煮10分钟。
   3. 用排水10分钟冷却容器. 将所有幻灯片转移到具有 PBST (200 毫升) 的新容器中, 用 PBST 冲洗幻灯片至少 3x 5 分钟。
3. 阻塞
   1. 将水浸泡的 kimwipes 放在托盘上, 以创建潮湿的环境, 以避免幻灯片的干燥。
   2. 将幻灯片移回托盘, 并在每张幻灯片上添加200µL 的阻塞解决方案。用瓶盖盖上托盘, 并让阻塞发展30分钟。
      注: Pax7 抗体是一种小鼠单克隆抗体, 因此在小鼠的肌肉组织中有不特异的结合小鼠 IgG, 创造高背景。使用 AffiniPure 的碎片山羊抗鼠 IgG (H + L) 阻止鼠标对鼠标不特异绑定。
4. 应用主要抗体。
   1. 在幻灯片容器中用 PBST 冲洗幻灯片。然后将幻灯片移回染色托盘。
   2. 在每张幻灯片上应用200µL 的主抗体组合, 用盖子覆盖托盘, 并让反应在室温下发展1小时或在4摄氏度过夜。
      注意: 在4摄氏度的隔夜反应给出最好的结果, 尽管在室温下发展反应给出了令人满意的结果。肌球蛋白 MF20 抗体可以添加到混合, 以执行三重 (Pax7, 层粘连蛋白, MF20) 标签。MF20 污渍分化的肌肉纤维。这一步也作为另一个阻断步骤与 PBST, 以减少潜在的非特异性结合的第二抗体 (山羊抗体) 在以下步骤。
5. 应用二级抗体。
   1. 用 PBST 在室温下至少 3x 5 分钟内冲洗出主要抗体。
   2. 添加200µL 的二次抗体混合到每张幻灯片, 并允许反应在室温下发展至少1小时。
      注: 对于 Pax7+Laminin, 使用山羊抗鼠 IgG1 488 和山羊抗兔 alexa 555。
      对于 Pax7+Laminin+MF20, 添加山羊抗鼠标 IgG2_b Alexa 647 在混合。
   3. 用 PBST 清洗二次抗体, 至少 3x 5min。
6. DAPI (4 ', 6-diamidino 2-苯基吲哚) 反着色和安装
   1. 稀释 DAPI (1:20,000) 在 PBST 中的滑动容器中,例如, 10 µL DAPI 200 毫升的 PBST。
   2. 将 DAPI 容器中的幻灯片着色3分钟。
   3. 用 PBST 洗净 DAPI 至少 5x 5 分钟。
   4. 装入带有安装介质的幻灯片。用盖玻片覆盖幻灯片。
      注意: DAPI 有毒、危险;应小心处理, 并在危险废物瓶中处置。

6. 荧光显微术

注: 上述免疫荧光染色协议将允许 SCs 可视化, 无论是广域荧光或共聚焦显微镜。确定 SCs 可能最初具有挑战性。下面是一些可以帮助您的建议步骤。

1. 使用 DAPI 通道和低缩放目标可视化幻灯片上的部分。
2. 从低到高切换放大倍数。要观察 SCs, 至少需要20X 的目标)。
3. 使用 488 (FITC)/555 (罗丹明) 的双过滤器立方体同时观察 Pax7 和层粘连蛋白信号, 以识别 SCs。在这一背景下, Pax7 染色的信号与噪声有较好的对比。
4. 快速将通道从 FITC 切换到 DAPI, 以正确识别 SCs。所有的 SCs 都应该 Pax7/DAPI-positive。

按照上述步骤, 可以成功地将 SCs 可视化为成人休息肌肉部分的荧光显微镜 (图 1)。虽然成人肌肉组织有强的自动荧光在某些类型的纤维, 明亮的 Alexa 系列染料能克服背景噪声和信号突出 (图 1A, B; 箭头头)。双光子共焦显微镜捕获相对较清洁的图像 (图 1B) 比宽场荧光显微镜 (图 1A)。同样的协议对幼年小鼠 (图 2A)、小鼠胚胎 (图 2B) 和受伤的成人肌肉组织 (图 3) 的肌肉组织也有很好的效果。在幼年和胚胎肌肉组织中, 有更多的活化 SCs (图 2A, 箭头) 或 Pax7-positive 肌原体 (图 2B, 箭头), 具有相对较大的细胞核;因此, 比起成年老鼠 (图 2与图 1) 相比, 更容易可视化小鼠的 SCs。在受伤的肌肉组织, 也有更多的激活 Pax7-positive SCs (图 3)。

图 1: Pax7 和层粘连蛋白荧光在小鼠成年休息肌肉组织中的图像.用 Pax7 (绿色) 和层粘连蛋白 (红色) 抗体 immunostained 成年小鼠的 TA/EDL 肌肉切片, 并用 DAPI (蓝色) 进行反染色。(A) 在广域荧光显微镜下捕获的图像。(B) 在共聚焦显微镜下捕获的图像。刻度条:50 µm 箭头: 从低自体荧光纤维中的 SCs。箭头: 来自高自体荧光纤维的 SCs。请单击此处查看此图的较大版本.

图 2: Pax7 和层粘连蛋白或 MF20 免疫荧光对小鼠肌肉组织的图像.小鼠的 TA/EDL 肌肉部分 immunostained Pax7 (绿色) 和层粘连蛋白 (红色) 或 MF20 (洋红) 抗体, 并与 DAPI (蓝色) 进行反染色。(A) 后天 8 (P8) 肌肉切片在共聚焦显微镜下捕获。(B) 胚胎日 17.5 (E17.5) 肌肉切片在广域荧光显微镜下捕获。刻度条 = 50 µm 箭头: P8 肌肉部分的 SCs (A);代表性 Pax7+ 肌原体在 E17.5 肌肉部分, 而在图像中有更多 (B)。这两幅图像都是从原始数据中修改的, 它们分别在已发布的纸张¹³ (图 3D) 和 (s图 1B) 中生成图像。请单击此处查看此图的较大版本.

图 3: Pax7 和层粘连蛋白免疫荧光在受损成人肌肉组织中的代表性图像.受伤的成人肌肉组织的 TA/EDL 肌肉部分 (损伤后7天) immunostained Pax7 (绿色) 和层粘连蛋白 (红色) 抗体, 并与 DAPI (蓝色) 反染色。图像是在共聚焦显微镜下捕获的。刻度条 = 50 µm 箭头: 在该部分中的 SCs。请单击此处查看此图的较大版本.

上述协议是基于对斑马鱼骨骼肌的 Pax7/MF20 染色方法¹²。使用的解决方案和阻止步骤是相同的或类似的。使用的抗体是相同的。调整后的步骤是基于小鼠肌肉组织和 SCs 的特点。首先, 在混合中加入层粘连蛋白抗体, 以帮助可视化和确认 SCs 的位置。在使用488/555 的双滤池时, 在显微镜下计算 SCs 的数量特别有用;这大大增强了 SC 衍生的 Pax7 信号, 脱颖而出, 从嘈杂的 autofluorescent 背景。第二, 由于使用的 Pax7 抗体是鼠标抗体, 我们添加了鼠标鼠标拦截步骤 (步骤 5.3), 以减少由于不特异的老鼠 IgG 结合的背景。第三, 抗原检索步骤 (步骤 5.2) 对 Pax7 抗体在粉煤灰固定组织中的染色具有重要的影响。

同样的协议用于小鼠 (幼崽和胚胎) 的肌肉组织 (图 2)。事实上, 与成年小鼠相比, 在幼崽中可视化 SCs 相对较容易。这可能是有益的, 首先染色的 SCs 在幼崽获得经验, 然后继续与成人肌肉组织。在每个实验中, 无主抗体的阴性控制 (步骤 5.4) 也是必要的。在石蜡切片上成功地使用了类似的协议, 并加石蜡处理步骤。然而, 石蜡切片往往有较高的自体荧光背景, 这掩盖了信号从 SCs 有相对较弱的 Pax7 表达。如果可能, 避免使用石蜡切片。同样的协议也被用于受伤的肌肉组织, 有许多 SCs, 并给出了类似的结果, 与幼犬的肌肉组织 (图 3)。

肌肉组织自发荧光是获得清洁免疫荧光结果的主要障碍¹⁴。在降低低温切片干燥时间的同时, 强烈建议使用新制备的低温切片。与其他协议¹⁵类似, 需要鼠标上的阻止步骤来进一步减少背景。

虽然广域荧光显微镜和共聚焦显微镜对通过眼片进行 SCs 可视化是有效的, 但建议采用共焦显微镜来捕捉高质量的图像。

作者没有什么可透露的。

我们感谢结缔组织国立研究院光成像部分提供显微镜和技术帮助。MF20 和 Pax7 抗体是从发展研究中获得的, 在发育研究院的主持下开发的杂交瘤银行, 由爱荷华州的爱荷华大学生物科学系维护。这项工作得到了国家卫生研究院结缔组织国立研究院的校内研究项目的支持。