생체 외에서 스모 E3 리가 활동 공부 SUMOylation 분석 결과

유비퀴틴 ligases와 달리 몇 E3 스모 ligases가 확인 되었습니다. 이 수정 된 생체 외에서 SUMOylation 프로토콜 생체 외에서 재구성 분석 결과 의해 소설 스모 E3 ligases를 확인 할 수 있다.

작은 유비퀴틴-같은 한정자 (스모) 수정 신호 변환 단백질 단백질 상호 작용에 변조를 통해 주로 중재 하는 중요 한 포스트 번역 상 수정 (PTM) 이다. 유비퀴틴 수정 마찬가지로 SUMOylation E1 활성화 효소 (SAE1/SAE2), e 2-활용 효소 (Ubc9), 및 E3-리가 (즉, PIA 가족, RanBP2, 및 Pc2)을 포함 하 여 순차적 효소 캐스케이드 감독 이다. 그러나, 다른 ubiquitination, E3 리가 비 본질적인 반응 하지만 않습니다 스모 활용에 대 한 정밀도 효능을 제공. 단백질 SUMOylation 수정 기판 특정 항 체와 스모 특정 항 체와 immunoblotting vivo에서 immunoprecipitation 통해 분석 하 여 확인할 수 있습니다. 그러나, 단백질 스모 E3 리가 활동의 데모 SUMOylation 분석 실험을 사용 하 여 정제 효소, 기질, 그리고 스모 단백질의 생체 외에서 재구성을 해야 합니다. 때문에 체 외에 반응에서 일반적으로 SAE1/SAE2 및 Ubc9, 혼자 스모 활용에 대 한 충분 한, putative E3 리가 여 SUMOylation의 향상은 항상 검출 하기 쉽지. 여기, 우리는 수정 된 생체 외에서 스모 수정에서 시험관에 재구성 시스템을 사용 하 여 일관 되 게 식별 SUMOylation 프로토콜 설명 합니다. 바이러스 성 스모-2/3 E3 리가 K bZIP 촉매로 활성 정화 단계 프로토콜도 제공 됩니다. 순화 K bZIP의 SUMOylation 활동 p53, 스모의 잘 알려진 대상에 표시 됩니다. 이 프로토콜 없습니다만 사용할 수 있습니다 elucidating 소설 스모 E3 ligases, 뿐만 아니라 그들의 스모 paralog 특이성을 공개.

스모 수정 처음 단백질 안정성¹을 조절 하는 가역 포스트 번역 상 수정 (PTM)으로 확인 되었습니다. 뿐만 아니라 직접 활용, 스모도 장착할 수 비 공유 상호 작용을 통해 단백질에 스모 상호 작용 주제 (심즈)². Tyrosyl-Src 상 동 2 (SH2)를 은닉 하는 분자에 의해 인 산화의 바인딩 또는 phosphotyrosine 바인딩 (PTB) 도메인^3,4, 스모 수정 제공 위한 추가 상호 플랫폼 선택 포함 하는 SIM effector 단백질^5,6모집 신호 변환의 규칙, 이외에 transcriptional 요인과 분자를 개장 하는 chromatin의 SUMOylation 조절 유전자 식^7,8을 제공 합니다. 게놈 넓은 SUMOylation 패턴의 연구는 스모 수정은 긍정적인^9,10 또는 음수^10,11,12 전사와 관련 된 공개 규칙, SUMOylation의 paralogue 특이성 때문에 부분에서.

포유류 세포; 현재 변화 하는 단백질에 대 한 세 가지 주요 스모 isoforms는 스모-1, 그리고 높은 동종 스모 2와 스모-3 (스모-2/3 라고 함)¹³포함 됩니다. 스모는 대상 단백질에 ψKxD/E 합의 모티브 내 lysine (K) 잔류물에 일반적으로 활용 된다. 스모 E3 ligases에서 시뮬레이션 paralogue 특이성¹⁴에 대 한 책임은. E3 ligases의 수백을 포함 하는 ubiquitination 경로, 달리만 있었다 몇 스모 E3 ligases 식별¹⁵. 스모 E3 ligases (i) 바인딩 Ubc9, (ii) SIM 도메인 통해 스모 moiety 바인딩 (iii) 기판에 Ubc9에서 스모 전송 향상을 자신의 능력을 포함 하는 속성에 의해 정의 됩니다. E3 리가 스모 활용¹⁶, 절대적으로 필요 하지 않습니다 하지만 기판 및 스모 paralogue 특이성을 제공 합니다. 일반적으로 이후 총 기질 단백질의 작은 분수는 스모 수정 SUMOylated 단백질에서 vivo에서 의 탐지 항상 도전 이다. 따라서, 정확 하 고 재현성 분석 스모 수정의 정확한 기능을 명료 하 게 하기 위해 필요 합니다.

생체 외에서 SUMOylation 분석 결과, 기질 단백질의 SUMOylation 촉매 정화 Ubc9의 능력을 평가 하는 스모 수정¹⁷공부에 대 한 분석 결과 잘 허용된. 그러나, 대부분의 경우에서 스모 E3 리가 활동 감지 되지 않을 수 또는 검출 될 수 있다 돌연변이 스모 리가와 높은 스모 E3 리가 활동 및 낮은 기질 특이성 표준 프로토콜에 의해 Ubc9¹⁸ 의 풍부한 금액의 존재 때문에 . 순화 Ubc9의 주의 적정이이 분석 결과의 전반적인 성공에 의하여 크게 달려 있다. 생체 외에서 SUMOylation 분석 결과 여기에 설명 된 표준 SUMOylation에서 수정할 프로토콜 ( 재료의 표참조). Kaposi의 육 종 관련 herpesvirus (KSHV) 다시 활성화 하는 동안 증가 글로벌 스모 수정 관찰 SUMOylation의 업 레 귤 레이 션에 대 한 책임이 있을 수 있습니다 바이러스 성 스모 E3 리가 식별 하 라는 메시지가. 다음 바이러스 스모 E3 리가 K bZIP의 상호 작용 단백질의 소규모 상영, p53 소설 기판으로 확인 되었습니다. 이 프로토콜에서 우리 곤충 세포는 표현과 스모-2/3으로 바이러스 스모 E3 리가 K bZIP 야생-타입의 정화에 단계가 자세히 보여줍니다. E1 및 E2 효소의 감소 금액의 p53, 유명한 스모 기판의 SUMOylation를 향상 시키기 위해 정화 K bZIP의 능력 평가 됩니다. 이 수정된 SUMOylation 분석 결과 사용 하 여, 연구원은 안정적으로 정의할 수 스모 E3 리가의 능력 SUMOylate 소설 또는 알려진된 기판 단백질 SUMOylation의 연구에 기본 단계입니다. 또한,이 방법은 낮은 리가 활동 하지만 높은 기질 특이성 소설 스모 E3 ligases를 확인할 수 있습니다.

1입니다. 준비의 잠재 식 구문

1. 이중 식 잠재 벡터에 K bZIP¹⁹ 의 cDNA 클로닝 하 여 스모 E3 리가 K bZIP을 정화 (재료의 표 참조)는 N 맨끝 피토 프 태그. 우리는 (벡터-태그-K-bZIP으로 프로토콜에 걸쳐 표시) octapeptide 태그를 사용 하 여 성공을 했다.
   참고: K bZIP 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 복제에 대 한 DNA 템플렛은 cDNA 역방향 doxycycline 치료²⁰다음 TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 셀에서 격리 하는 RNA에서 복사할.
   1. 전송 길이 K bZIP cDNA¹⁹ Cpo와 듀얼 식 벡터에 사이트 복제 나. Cpo 내가 소화 PCR 제품 및 3 h²¹37 ° C에서 이중 식 벡터의 1 µ g.
   2. 고²²0.8 %agarose 젤 전기 이동 법 다음 소화 DNA를 추출 합니다. 삽입 (K-bZIP) 선 및 T4 DNA 리가 제조업체의 지침에 따라 30 분 동안 16 ° C에 의해 벡터 ( 재료의 표참조).
   3. 5 µ L 추가 50 µ L DNA 결 찰의 유능한 대장균 세포 1.5 mL 튜브에 "A" ( 재료의 표참조). 30 분 동안 얼음에 넣어. 그런 다음, 45 42 ° C 물 욕조에 1.5 mL 튜브를 품 어 s 즉시 3 분 동안 얼음에 튜브를 넣어.
   4. 튜브에 600 µ L S.O.C. 매체 (0.5% (w/v) 효 모 추출 물, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 m m KCl, 20mm MgSO₄, 4% (w/v) 포도 당)을 추가 하 고 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어. 그런 다음, x 600g에 3 분 동안 실내 온도에 튜브 원심.
   5. 상쾌한 제거, 60 µ L Luria Bertani 매체와 펠 릿 resuspend (파운드, 1% (w/v) tryptone, 0.5% (w/v) 효 모 추출 물, 및 85 mM NaCl) 및 파운드 한 천 배지 100 µ g/mL 암 피 실린 포함에 확산. 16 h^23,2437 ° C에서 한 천 배지를 품 어.
   6. 1 식민지 250rpm 떨고와 100 µ g/mL 암 피 실린 및 16 h 37 ° C에서 문화를 포함 하는 5 mL 파운드 매체에 접종을 선택 합니다. 다음, 플라스 미드, 벡터-태그-K-bZIP, 제조업체의 지침에 따라 플라스 미드 추출 키트에 의해 추출 ( 재료의 표참조).
2. 태그-K-bZIP 유능한 대장균 으로 벡터 태그 K bZIP의 변형에 의해 은닉 하는 재조합 bacmid 생성 세포 "B" (재료의 표 참조).
   1. 0.2 µ g 벡터-태그-K-bZIP 플라스 미드와 100 µ L 유능한 중 1.5 mL 튜브와 30 분 대에 넣어 얼음에 대장균 세포 "B" 품 어 45 42 ° C 물 목욕에서 튜브 s 즉시 3 분 동안 얼음에 튜브를 넣어.
   2. 튜브에 S.O.C. 매체의 900 µ L을 추가 하 고 회전 50 rpm에서 37 ° C 4 h에서 품 어. 다음, 매체의 10 µ L, 추가 파운드 한 천 배지 50 µ g/mL 대, 7 µ g/mL gentamicin, 10 µ g/mL 항생물질, 100 µ g/mL galactosidase 기판, 및 40 µ g/mL 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG에 확산 S.O.C 매체의 추가 50 µ L ), 및 48 h 37 ° c.에 대 한 번호판을 품 어
   3. 5 mL 파운드 매체 50 µ g/mL 대, 7 µ g/mL gentamicin 및 10 µ g/mL 항생물질을 포함 한 백색 식민지 접종 16 h 떨고 250 rpm 37 ° C에서 품 어.
   4. 재조합 bacmid 태그 K bZIP을 은닉 하는 DNA를 분리 하 고 계량, 1 µ g / µ L²⁵의 농도에 다시 일시 중단.
3. 태그-K-bZIP 재조합 bacmid 태그-K-bZIP 6 잘 플레이트 한 우물에서 Sf9 셀에 포함 된 DNA의 transfecting 1 µ g에 의해 표현 하는 재조합 baculoviruses을 생성 합니다.
   1. 시드 2 x 10⁶ Sf9 셀 ( 재료의 표참조) 2 mL 그레이스의 곤충 매체 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 각각 1 %gentamicin 제공 6 잘 플레이트의 잘 다음 1 h 27 ° C에서 품 어.
   2. 10 %FBS, 1 %gentamicin, 및 1% 세제 C와 함께 제공 된 그레이스의 곤충 매체에서 Sf9 셀의 로그 단계 문화를 유지 ( 재료의 표참조) 140 rpm에서 궤도에 27 ° C에서. Hemocytometer 고 trypan 푸른 얼룩;를 사용 하 여 셀의 개수 세포 생존 능력 95%를 초과 한다. 매 2-3 일 (최소 밀도 ~0.5 x 10⁶ 셀/mL) 1: 3의 subcultivation 비율을 사용 하 여 셀을 유지 합니다.
   3. 2 µ L bacmid DNA를 추가 (1 µ g / µ L) 98 µ L 2 mL 튜브에 혈 청 미디어 ( 재료의 표참조)을 감소. 그런 다음 추가 4 µ L transfection 시 약 ( 재료의 표참조) 튜브를 잘 믹스. 15 분 동안 실 온에서 품 어.
   4. 각 음에이 transfection 혼합물 (104 µ L)를 추가 하 고 12-16 h 27 ° C에서 품 어.
   5. 부드러운 포부와 함께 지쳐 미디어를 제거 하 고 신선한 그레이스의 곤충 매체 10 %FBS 1 %gentamicin와 함께 제공 된의 2 개 mL를 바꿉니다. Sf9 세포는 플레이트 표면에 느슨하게 고착 하 고 부드러운 포부와 방해 하지 않을 것 이다.
4. Transfection 후 재조합 잠재를 수집 하 고 증폭 하는 추가 실험을 위해 높은 titer 주식 (P1)를 얻을 잠재.
   1. 매체, 멸 균 셀 기중 기를 사용 하 여 긁어는 Sf9 셀을 변경한 후 72 h 1.5 mL 튜브 및 10에 대 한 소용돌이에서 각 개별 우물에서는 상쾌한 수집 s.
   2. 150 x g. 3 분 4 ° C에서 원심 P0 잠재 및 1.5 mL 튜브 (각 관에 1 mL 잠재) 약 수 수집 상쾌한. -80 ° c.에 게
   3. 10 mL 그레이스의 곤충 매체에 씨앗 1 x 10⁷ Sf9 세포 10 %FBS 1% gentamicin 10 cm 배양 접시에에서 함께 제공 하 고 1 h 27 ° C에서 품 어.
   4. 재조합 baculoviruses 표현 태그-K-bZIP의 증폭에 대 한 시드 Sf9 셀을 0.5 mL P0 잠재를 추가 하 고 48 h 27 ° C에서 품 어.
   5. 최대 1 개월에 대 한 15 mL 튜브에 4 ° C에서 저장소 P1 잠재로 상쾌한을 수집 합니다.

2입니다. K-bZIP의 정화

1. 1.3.2 단계에서 설명한 대로 10 %FBS, 1 %gentamicin, 및 1% 세제 C 140 rpm에서 궤도에 27 ° C에서 제공 하는 그레이스의 곤충 매체에 Sf9 셀의 로그 단계 문화를 유지 합니다.
2. 변환의 날, 2 x 10⁶ 셀/mL의 조밀도 가진 Sf9 셀의 250 mL에 잠재 된 상쾌한 (P1)의 1 mL를 추가 합니다.
3. 떨고, 140 rpm 궤도 셰이 커에 27 ° C에서 72 h에 대 한 Sf9 셀을 품 어 다음 4 ° c.에 15 분 동안 2,740 x g에서 원심 분리 하 여 수집
4. 상쾌한을 제거 하 고 10 mL 세포의 용 해 버퍼 (20 mM HEPES pH 7.9, 0.5 M NaCl, 1% 세제 ( 재료의 표참조), 2% 글리세롤, 프로 테아 제 억제 물 칵테일) 펠 릿 세포를 lyse 및 4 ° C에서 30 분 동안 정지 믹서를 사용 하 여 50 rpm에 회전.
5. 원심 분리기 세포 lysate 15000 x g 15 분은 상쾌한 수집에서.
6. 태그-K-bZIP 정화, 항 체 태그 14 mL 폴 리 프로필 렌 튜브, 자석 구슬의 50 µ L로 세포 lysates (10 mL)를 품 어 하 고 정지 믹서를 사용 하 여 4 ℃에서 3 h 50 rpm에 회전 합니다. 30 g 원심 x 800에 구슬 작은 단백질 캡처, 다음 4 ° c.에 s 상쾌한의 대부분을 제거 하 고 다시 약 1 mL의 잔여 볼륨에 비즈를 일시에 1.5 mL 튜브에 전송.
7. 마그네틱 스탠드에 구슬 들어 있는 튜브를 배치 하 여 캡처된 단백질을 세척 하 고 일단 자석 구슬은 튜브의 측면을 완벽 하 게 준수는 상쾌한을 제거.
8. 세포의 용 해 버퍼와 구슬 4 번 씻어.
   1. 1.5 mL 튜브에 1 mL 세포의 용 해 버퍼를 추가 하 고 반전 튜브 10 번. 1.5 mL 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 2.7에서 설명 된 대로 상쾌한을 제거 합니다.
   2. 또 다른 3 시간 이전 단계를 반복 합니다.
9. 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)와 구슬 한 번 씻는 다.
   1. 1.5 mL 튜브에 1 mL PBS (137 m m NaCl, 2.7 m m KCl, 8 m m Na2HPO4, 1.5 m m KH2PO4)를 추가 하 고 반전 튜브 10 번.
   2. 마그네틱 스탠드에 1.5 mL 튜브를 넣어 하 고는 상쾌한 제거.
10. 1.5 mL 튜브에 PBS에 희석 150 µ g/mL octapeptide의 100 µ L을 추가 하 여 항 체 태그 자석 구슬에서 태그-K-bZIP 단백질을 elute. 실 온에서 정지 믹서에 의해 50 rpm에서 10 분 동안 튜브를 회전 합니다. 다음, 튜브 자석 스탠드에 다시 놓고 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 K bZIP 포함 된 상쾌한 수집 합니다.
11. SDS 페이지 Coomassie 파란 얼룩이²⁶뒤 1-5 µ L 정화 태그-K-bZIP 단백질 분석. 2 µ g, 1 µ g, 로드 및 소 혈 청 알 부 민 (BSA)는 동일에 0.5 µ g 샘플 젤 ImageJ 같은 이미지 처리 프로그램, 정량화에 대 한 그것을 사용 하 여. BSA 기준에 비교 하 여 K-bZIP 농도 견적 한다.
12. 순화 K bZIP 이제 각 SUMOylation 분석 결과에서 사용 될 준비가 되어 있습니다. PBS에서 K bZIP 100 ng / µ L-80 ° c.에 작은 aliquots가 게의 최종 농도에 희석

3. SUMOylation 분석 결과

1. 각 시험관에서 SUMOylation 반응에서의 마스터 믹스에 정화 태그-K-bZIP의 100 ng / µ L의 3 µ L를 추가 합니다. 마스터 믹스 구성 요소 포함 1 µ L 단백질 버퍼, SUMOylation 버퍼, 0.5 µ L p53 단백질 (0.5 mg/mL), 25 x 1 nM E1 효소를 활성화 (재고 하자마자: 1 µ M), 50 nM e 2의 효소 변화 (재고 하자마자: 10 µ M), 및 250 nM 각 스모 펩 티 드 (스모-1의 스모-2, 또는 스모-3; 재고 하자마자: 5 µ M) 17 µ L의 최종 볼륨을.
2. 내용을 부드럽게 혼합 하 고 3 h. SDS 페이지 로딩 버퍼 x 2의 20 µ L을 추가 하 여 반응을 중지에 30 ° C에서 반응을 품 어 (100 mM Tris HCL pH 6.8, 4% 나트륨 라우릴 황산 염, 0.2% (w/v) bromophenol 블루, 20% (v/v) 글리세롤, 및 200 m m β-mercaptoethanol) 및 5 분 동안 95 ° C에서 샘플 변성
3. SDS 페이지에 샘플, PVDF 막에 분리 된 단백질 전기 이동 전송 반 건조 장치를 사용 하 여 전송 하 고 안티-p53 항 체를 사용 하 여 서쪽 오 점 분석 합니다.
   1. 2.11, 단계에서 젤 장치를 설정 하 고 젤 우물에 20 µ L의 샘플을 로드.
   2. (때까지 염료 밴드 젤의 하단에 도달) 정 전류 80 V에서 약 120 분 동안에 10% 젤을 실행 합니다. 전기 이동 법의 완성 후 전원 공급 장치를 해제 합니다.
   3. 젤 기구와 젤, 밖으로 데리고 젤 카세트를 분리 하 고 5 분 동안 세미 드라이 전송 버퍼 (48 mM Tris HCl, 39mm 글리신, 20% 메탄올)에 젤을 떠.
   4. 다른 컨테이너를가지고 고 1 분 동안 메탄올에 PVDF 막 담가. 그런 다음, 메탄올에 PVDF를 데리고 고 세미 드라이 전송 버퍼에 넣어. 부드럽게 막 5 분 교 반 하십시오.
   5. 세미 드라이 전기 이동 기구의 안전 덮개를 제거 합니다.
   6. 사전 필터 종이, 젖은 하단 플래티넘 양극에 젤 샌드위치를 같이 준비: 필터 종이, PVDF 막, 젤, 및 필터.
   7. 다음 실행 오 점 15 V 정 전류 90 분 설정에 대 한 전원 공급 장치에서 안전한 음극 판과 안전 커버, 세미 건조 장치, 고 PVDF 막 밖으로.
   8. 블로킹 버퍼 블록 PVDF 막 (TBST 버퍼에 5% 비-지방 우유 (137 m m NaCl₂, 20 mM Tris HCl, 0.1% 세제 B ( 재료의 표참조), pH 7.6)) 궤도 셰이 커로 흔들어 30 rpm으로 1 시간에 대 한 실내 온도에.
   9. 30 rpm 떨고 정지 믹서를 사용 하 여 함께 안티 p53 항 체 희석 (1:1, 000) 4 ° C에서 12-16 h에 대 한 블로킹 버퍼와 PVDF 막 교배.
   10. 컨테이너에 PVDF 막 꺼내와 TBST에 넣어. 두 번 더 TBST 가진 PVDF 막을 헹 구 십시오.
   11. 45 rpm 궤도 셰이 커로 흔들어 30 분 동안 TBST에 PVDF 막을 담근 다.
   12. 30 rpm 떨고 정지 믹서를 사용 하 여 실 온에서 1 h에 대 한 블로킹 버퍼에 반대로 토끼 항 체 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 희석과 활용 (1:4, 000)와 PVDF 막 교배.
   13. 3.4.10 단계에서 설명한 대로 TBST 3 시간 PVDF 막을 씻으십시오.
   14. 45 rpm 떨고 정지 믹서를 사용 하 여 함께 30 분 동안 TBST에 PVDF 막을 담근 다. TBST를 제거 하 고 PBS PVDF 막 12 h까지 4 ° C에서 유지 하기 위해 추가.
   15. 믹스 향상 된 chemiluminescent 기판 (ECL 기판) 시 약 1, 2 (1:1) ( 재료의 표참조). PBS에서 PVDF 막 제거, 간단히 종이 타월 또는 과도 일 분을 흡수 즉시 짧게 blotting에 의해 3-5 분 제거 초과 ECL 시 약에 대 한 각 막의 표면에 ECL 시 약의 400 µ L을 추가 하는 빛-의무 퍼 오 점 하지만 m을 허용 하지 마십시오 embrane을 완전히 건조.
   16. 오 점 발광 이미징 시스템 또는 autoradiography 영화²⁷을 사용 하 여 노출 합니다.

제조업체에서 제공 하는 정보에 따라 E1 및 E2 효소 SUMOylation 분석 결과에서 표준 금액은 50 nM 및 500 nM, 각각. 최소한의 E2 효소 Ubc9 SUMOylate p53 수 있는 어근 먼저 생체 외에서 SUMOylation 분석 결과 의해 결정 되었다. 낮은 Ubc9는 표준 체 외에서 SUMOylation 분석 결과 프로토콜에 사용 금액의 1 / 5 SUMOylate p53 효율적으로 수 있었다 (그림 1A). 따라서, 표준 프로토콜에 사용 되는 Ubc9의 양의 1/10로 조합에서 E1 효소의 금액의 절반 SUMOylation 분석 결과 체 외에 다른 사용 되었다. SUMOylation 효율의 상당한 감소는 표준 프로토콜 (그림 1B)를 비교 하 여 관찰 되었다.

따라서, 스모 E3 리가 K bZIP의 능력 향상 p53 SUMOylation 이들을 사용 하 여 결정 되었다 생체 외에서 SUMOylation 조건 수정. Sf9 셀 (그림 2A)에서 정화 태그 K bZIP E1 및 E2 Ubc9 효소의 낮은 금액 SUMOylation 반응에서 고용 되었다. 이 수정 된 조건 하에서 K bZIP 효율적으로 p53의 SUMOylation 촉매 수 (그림 2B). Immunoblotting 안티 p53 항 체와 각 반응에서 p53의 비슷한 총 금액을 확인 하 고 또한 검색 된 스모 p53 수정.

그림 1 : 스모 효소는 생체 외에서 SUMOylation 분석 결과에서 사용의 최소한의 결정. (A) p53 SUMOylation 생체 외에서 SUMOylation 분석 결과 표준 프로토콜에 사용 하는 Ubc9 효소의 양을 1/2 및 1 5를 포함 하는에 평가 했다. 3 시간 후 체 외에서 SUMOylation 반응에서 SUMOylated p53 효소는 서쪽에 의해 시험 되었다 안티 p53 항 체와 오 점. (B) 생체 외에서 SUMOylation p53의 표준 프로토콜에 사용 되는 Ubc9의 10 분의 1 금액으로 조합에서 E1 효소의 절반 금액을 사용 하 여 추가 분석 했다. 서쪽 오 점 (A)에서 설명 된 대로 수행 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 : 스모 E3 리가 K bZIP으로 p53 SUMOylation의 향상. (A) Coomassie 파란 얼룩이 함께 다음 SDS 페이지 분석 잠재 표현 K bZIP 단백질 정화. 1 µ g BSA와 10 µ L K bZIP 정화 단백질 수량 비교에 대 한 로드 했다. (B) K-bZIP 향상 p53 SUMOylation 표준 프로토콜에는 생체 외에서 SUMOylation 반응 E1 효소의 절반 금액 및 10 분의 1 Ubc9 추천의 금액을 사용 하 여 평가 되었다. 그림 1에 설명 된 대로 SUMOylated p53 서쪽 오 점에 의해 조사 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

생체 외에서 SUMOylation 프로토콜 여기에 설명 된 확인 된 Ubc9 기판의 SUMOylation 상태 설정 정기적으로 사용 됩니다. 스모 E3 리가의 SUMOylation 함수를 공부 하는 표준 프로토콜을 사용 하 여 주요 한계는 스모 E1 활성화 및 E2 변화 효소 Ubc9 체 외에 시스템에서 스모 활용을 극대화 하는 풍부한. 이 문제를 고려 하면 우리가 믿는 그 적정 수준에 스모 E1 및 E2 효소의 양을 하나 겨우 SUMOylation에 그들의 활동만 방법을 사용할 수 있는이 시험관 을 사용 하 여 스모 E3 리가 촉매 활동을 결정 하는 검색할 수 있습니다. SUMOylation 시스템입니다. 이 가설에 따라 우리는 성공적으로 해명 K bZIP의 E3 리가 활동 하 고 소설 스모 E3 리가로 스모-2/3으로 특이성에 동일시.

프로토콜 내에서 중요 한 단계는 E1 및 e 2의 낮은 금액의 설립 이다. 같이 그림 2, 소설 스모 E3 ligases 낮은 리가 활동이 낮은 금액을 사용 하 여 기판 및 스모 paralogues 그들의 특이성의 보존으로 식별 될 수 있습니다. 기술의 주요 한계는 기판의 매우 작은 비율만 스모 수정 될 수 있으므로 스모 기질을 인식-고품질 항 체에 대 한 요구 사항입니다.

비록 많은 단백질 overexpression에서 vivo에서후 SUMOylation 증가 가능성을 보여, 스모 E3 리가 정의 시스템에 의해 재구성 된 생체 외에서 SUMOylation 순화 E1, E2 및 E3 효소를 사용 하 여 시연 합니다. 수백, 아마 수천 유비퀴틴 E3 ligases 식별의 반대로 지금까지 몇 스모 E3 ligases 발견 되었습니다. 이 부분에서 전통적인 표준 생체 외에서 SUMOylation 분석 결과 스모 활용 효율성을 극대화 하 고 결과적으로 잠재적인 스모 E3 ligases의 SUMOylation 기능을 방해 하는의 사용에 있을 수 있습니다. 현재 프로토콜 SUMOylation 스모 E3 리가 향상을 간단 하 고 일관 된 분석 결과를 설명 합니다. 설명된 방법 식별 및 소설 스모 E3 ligases의 특성에 대 한 필수적입니다.

저자는 잠재적인 충돌의 관심을 공개.

이 작품에서 과학과 기술 (PCC에 대부분, 105-2320-B-010-007-MY3), 국립 보건 연구소 (NHRI-EX105-10215BC PCC에)에서 과학과 기술 (가장 105-2314-B-400-019에서 교부 금에 의해 지원 되었다 HJK)을 국립 보건 연구소 (NHRI MG-105-SP-10, NHRI MG-106-SP-10 HJK)에서. 이 작품 또한 PCC 원고 게시에 국립 양 밍 대학으로 부분적으로 지원 되었다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정, 게시 또는 원고의 배상에 아무 역할을 했다.