형광 프로브를 이용한 배양 된 뉴런의 엔도 좀과 리소좀 기능의 정량화

막 인신 매매에 대한 조사는 신경 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 뉴런에서 소포 운동성을 정량화하는 방법을 소개합니다. 이것은 신경계에서 막 인신 매매의 정량화에 적용 할 수있는 편리한 방법입니다.

뇌에서 멤브레인 트래 피킹 시스템은 연결 형태, 시냅스 가소성, 생존 및 신경 교종과 같은 신경 기능을 조절하는 데 중요한 역할을합니다. 지금까지 수많은 연구에서 이러한 시스템의 결함이 다양한 신경 질환을 일으킨다 고보고했습니다. 따라서, 소포 역학의 기저를 이해하는 메커니즘은 여러 가지 신경 질환의 치료에 도움이 될 수있는 영향력있는 단서를 제공 할 수 있습니다. 여기에서는 ImageJ 플랫폼 용 소프트웨어 플러그인을 사용하여 운동 거리 및 이동 속도와 같은 소포 운동을 정량화하는 방법을 설명합니다. 정량화를위한 ​​이미지를 얻기 위해, 우리는 EGFP - 태그 소낭 마커 단백질과 연결 endosome - 리소좀 구조를 표시하고 시간 경과 현미경을 사용하여 소포의 움직임을 관찰했다. 이 방법은 매우 유용하고 축삭 및 수상 돌기와 같은 신경 돌기뿐만 아니라 뉴런 및 신경아 교세포의 소마에서 소포 운동성 측정을 단순화합니다. 추가이 방법은 섬유 아세포 및 내피 세포와 같은 다른 세포주에도 적용될 수있다. 이 접근법은 막 밀매에 대한 우리의 이해를 진전시키는 데 도움이 될 수 있습니다.

Endosome-lysosome trafficking의 정확한 조절은 신경 기능 조절에 필수 불가결합니다. 주목할 만하게,이 vesicles의 동적 인 운동은 신경질 형태학, 발달 및 생존의 규칙의 기초가되는 중요한 요인이다. 이 시스템의 결함은 심한 신경 장애를 유발합니다 ^{1 , 2} . 소포 인신 매매를 신경 질환과 연결시키는 분자 메커니즘은 복잡하다고 여겨지며, 몇몇 그룹에서는이 관련성을 조사하려고 시도해 왔습니다. 예를 들어, 늦은 엔도 솜 운동성을 교란 시키면 리소좀 결함으로 인해 유전되는 신경 퇴행성 질환 인 Niemann-Pick C 질병 ³ 과 유의 한 연관성이있는 것으로보고되었습니다. 다른 예는 리소좀 운동성을 손상시키는 리소좀 성 Ca ²⁺ 채널 trpml 1의 돌연변이로 리소좀 성 저장 질환 ^{4 , 5 ,} 6 . 우리 그룹은 PtdIns (3,5) P ₂ turnover의 조절 장애가 뉴런의 엔도 좀과 리소좀 운동성을 억제하여 스트레스 반응에 대한 취약성이 증가한다고보고했다. PtdIns (3,5) P _2의 대사 조절은 후기 엔도 좀과 리소좀에 주로 국한되며, 소포 수송과 융합 분열 과정을 포함한 다양한 세포 기능에 중요한 역할을한다. 손상된 PtdIns (3,5) P ₂ turnover가 심한 신경 퇴화를 유발하기 때문에 11,12 endosome-lysosome 운동성의 비정상적인 조절은 신경 퇴행의 발병 기전을 이해하는 중요한 요소가 될 수 있습니다. 소포 운동성의 기초가되는 분자 메커니즘에 대한 연구는 우리의 unde를 깊게 할 수있는 유망한 단서를 제공 할 수 있습니다몇 가지 신경 장애의 견해.

이 논문에서는 수동 추적이라는 무료 소프트웨어 패키지를 사용하여 뉴런의 소포 운동성을 정량화하는 유용한 방법을 소개합니다. 목표는 소포 운동성을 분석하는 빠른 정량화 방법을 개발하는 것이 었습니다. 이 양화는 저속 영화의 각 프레임에서 기준점을 클릭하는 표준 방식을 통해 이루어집니다. 수동 추적 소프트웨어를 사용하면이 방법을 다른 응용 프로그램과 달리 매우 간단하고 폭넓게 사용할 수 있습니다. 또한, 이러한 접근법은 신경 교세포와 같은 다른 세포에도 적용 가능하다. 이 방법은 원시적이지만 세포 운동성 및 형태 학적 변화를 비롯한 다양한 분석에 적용 할 수 있습니다. 예를 들어 일련의 이미지에서 참조 점을 정의한 후 데이터 분석 및 이미지 처리 소프트를 사용하여 순차 이미지에서 참조 지점의 위치 및 각 위치에서의 시간에 대한 정보를 추출 할 수 있습니다제품. 이 방법은 간단하면서도 강력하며, 엔도 좀 - 리소좀 기능을 검사하는 것과 같은 멤브레인 트래 피킹을 기반으로 한 연구의 효율성 향상에 기여합니다.

모든 동물 실험은 쓰쿠바 대학 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받아 수행되었습니다.

1. 해부

1. 배아 일 13-14 ICR 또는 C57BL / 6 태아를 준비하기 위해, 자궁 경부 탈구로 임신 생쥐를 안락사. 자궁을 제거하고 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)와 페트리 접시에 넣어. 혈액을 제거하기 위해 잘 헹구십시오.
2. 겸자를 사용하여 70 % 에탄올로 자궁을 새로운 페트리 접시에 옮겨 멸균하십시오.
3. 자궁을 HBSS로 새로운 페트리 접시로 옮깁니다. 살균 해부 포셉 및 수술 가위를 사용하여 자궁에서 태아를 제거하십시오.
4. 외과 용 가위로 태아를 처치하십시오. HBSS와 함께 새로운 페트리 접시에 그들을 놓으십시오.
5. 피부와 두개골을 제거하고 살균 해부 포 셉를 사용하여 두뇌를 꺼내. 그들을 HBSS와 페트리 접시에 넣어.
   참고 :이 단계부터 깨끗한 상태에서 절차를 수행하는 것이 가장 좋습니다벤치.
6. 입체 현미경으로 멸균 해부 포셉을 사용하여 meninges를 제거합니다. 겸자를 사용하여 기저핵, 해마 및 소뇌를 차단하십시오. 곡선 팁 포셉을 사용하여 HBSS와 함께 새로운 페트리 접시에 cortices를 전송하십시오.
7. 일회용 dropper 또는 25mL 피펫을 사용하여 모든 cortices를 수집합니다. 그들을 15 ML 튜브에 넣어 다음 pipetting하여 HBSS를 제거하십시오.
8. cortices를 포함하는 튜브에 대뇌 피질 효소 솔루션 3 ML을 추가합니다. 이 튜브를 수조에 넣고 5 분 동안 37 ° C에서 배양하십시오.
   참고 : 0.25 % 트립신과 1mM EDTA와 인산염 완충 식염수 (PBS)로 구성된 대뇌 피질 문화 효소를 준비합니다. 0.22 μm 필터로 소독하십시오.
9. cortices를 포함하는 튜브에 대뇌 피질 효소 솔루션의 추가 3 ML을 추가하고 추가 5 분 동안 수욕에서 37 ° C에서 품어.
10. 5 ML 피펫을 사용하여 대뇌 피질 효소 솔루션을 제거하고 Dulbe 5 ML을 추가10 % 태아 소 혈청 (FBS)이 함유 된 cco 's Modified Eagle Medium (DMEM).
11. 멸균 P1000 팁 5 ML 피펫을 사용하여 위아래로 부드럽게 pipetting하여 cortices을 떼어. P200 팁 5 ML 피펫을 사용하여 다시 피펫.
12. 40 μm 나일론 셀 스트레이너를 50 mL 튜브에 넣고 현탁액을 여과하여 잔해물을 제거합니다.
13. RT에서 5 분 동안 420 XG에서 원심 분리기를 만든 다음 DMEM 배지를 제거합니다.
14. 대뇌 피질 배지 5 ML을 추가하고 부드럽게 세포 펠렛을 resuspend.
    참고 : 1x B - 27 보충제, 2mM L - 글루타민, 100 U / ML 페니실린 스트렙토 마이신으로 보충 뉴런 기본 미디어로 구성된 대뇌 피질의 문화 매체를 준비합니다.
15. hemocytometer를 사용하여 세포를 세고 대뇌 피질 문화 매체를 사용하여 세포 농도를 (원하는대로) 조정합니다.
16. 코팅 된 35mm 유리 바닥 접시 당 2.0mL의 플레이트 3.0 × 10 ⁶ 피질 뉴런.
    참고 : 도금하기 전에Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) 또는 0.01 % Poly-L-Ornithine (PLO)을 함유 한 35mmm 유리 바닥 접시. 37 ° C에서 3 시간 동안 배양하고 적어도 3x PBS로 세척하십시오.

2. 이미징 베 시클 운동성

1. 각 유형의 소포를 라벨링 할 플라스미드를 준비하십시오. 예를 들어 초기 엔도 솜에는 EGFP-Rab5를, 후기 엔도 솜에는 EGFP-Rab7을, 리소좀에는 LAMP-EGFP를,자가 염색체에는 EGFP-LC3을 사용합니다 ^{8 , 13} .
   참고 :이 플라스미드는 tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp에서 ​​요청할 수 있습니다. 전형적으로, 3-5 일 의 시험 관내 (DIV) 뉴런은 형질 전환 시약을 사용하여 이들 플라스미드로 트랜 스펙 션 될 수있다.
2. 피펫 팅으로 혈청이없는 배지 200 μL와 4.0 μg의 플라스미드를 섞는다. 별도의 튜브에 혈청이없는 배지 200 μL에 8 μL의 형질 전환 시약 ( 재료 표 참조)을 희석하십시오. RT에서 5 분 동안 품어 둡니다.
3. 단계 2.2에서 pipetting하여 플라스미드 솔루션과 transfection 섭정 솔루션을 섞는다. RT에서 20 분 동안 품어 낸다.
4. 무 혈청 배지와 단계 2.3에서 얻은 플라스미드 용액 400 μL를 각 코팅 된 유리 바닥 접시에 첨가한다. 37 ° C에서 뉴런을 품어 5 % CO ₂ 배양기에서 30 분간 항온 처리한다. 대뇌 피질 문화 매체 2 ML로 매체를 대체하십시오. 1-2 일 동안 5 % CO ₂ 인큐베이터에서 37 ° C에서 뉴런을 품어.
5. transfection 1 ~ 2 일 후, 이미지 수집을 위해 transfected 세포를 선택합니다.
   참고 : 7 DIV 미만의 조기 뉴런은 동적 소포 운동성을 나타내는 경향이 있습니다. 고도로 표현하는 뉴런을 선택하면 명확한 이미지를 얻을 수 없기 때문에 형광 프로브를 적당히 표현하는 뉴런을 선택하십시오. 또한 축색 돌기 및 수상 돌기의 확인을 용이하게하기 위해 긴 축삭 및 복잡한 수상 돌기가있는 피라미드 뉴런과 같은 전형적인 연결 형태를 선택하십시오 ( 그림 1A 참조)).
6. 저속 영상 시스템을 이용한 영상 획득 :
   이미징의 경우 40X Plan Apo 0.95NA 또는 100X Plan Apo VC NA1.4 대물 렌즈가 장착 된 CCD (Charge Coupled Device) 카메라가 장착 된 형광 현미경을 사용하십시오. 부화 시스템을 사용하여 37 ° C에서 온도를 제어하십시오. 이미지 수집 소프트웨어가 제어하는 ​​100 초 동안 한 프레임 / 5 초에서 뉴런 이미지를 수집합니다. 또는 300 초 동안 2 초당 1 프레임과 같이 더 짧은 시간 간격과 더 긴 시간 간격으로 이미지를 수집 할 수 있습니다.
   참고 : 순차적 이미지 촬영에는 다양한 응용 프로그램을 사용할 수 있으며 그 중 많은 이미지가이 방법에 적합합니다. 따라서 특정 응용 프로그램을 권장하지 않습니다. 오히려 각 연구원은 사용 가능한 응용 프로그램을 사용해야합니다.

3. 이미지 분석

1. Manual Tracking ¹⁴ 로 ImageJ 소프트웨어의 모든 순차 이미지를 엽니 다.
   참고 : 현재까지 수동 추적은추적 실험 ^{15 , 16 , 17 , 18 , 19에서 사용} 되었습니다. 수동 추적은 Dr. Fabrice Cordelières가 개발했습니다. 자세한 서면 지침은 온라인에서 확인할 수 있습니다 ²⁰ . 분석을 위해, 이미징 데이터의 품질은 충분한 수의 이미지로 개선됩니다. 20 장 이상의 이미지를 사용하는 것이 좋습니다.
2. 연속 이미지를 결합하려면 <이미지> → <스택> → <스택 할 이미지>를 선택하십시오. <확인>을 클릭하십시오.
3. → 을 선택하십시오. 추적 창이 열립니다.
4. 체크 박스를 클릭하고 매개 변수 섹션에서 추적 매개 변수를 정의하십시오.
   참고 : 시간 간격, x / y 보정, z 보정, 중심에 대한 정사각형 크기 검색 등 여러 매개 변수를 설정할 수 있습니다도트 크기, 선 너비 및 글꼴 크기가 포함됩니다. 이 단순화 된 분석에서, 시간 간격 및 x / y 보정 모두가 정의되었다. 다른 실험 환경에서는 다른 매개 변수도 정의해야 할 수 있습니다. 여기에 사용 된 매개 변수는 다음과 같습니다 : 40X Plan Apo 0.95NA 대물 렌즈의 경우 이 5 초이고 이 0.26642 μm이거나 100X Plan Apo VC NA1.4의 경우 0.10657 μm입니다. 대물 렌즈.
5. 매개 변수가 정의 된 후 <트랙 추가>를 클릭하여 새 트랙을 시작하십시오.
6. 관심있는 소낭 ( 예 : 그림 1A (오른쪽 패널)의 파란색과 빨간색 화살촉으로 표시된 소낭)을 결정한 후 순차 이미지에서 신호의 중심을 클릭하여 xy 좌표를 기록합니다. 기록 된 xy 좌표, 거리 및 속도의 결과가 새 창에 표시됩니다.
   참고 : 리소좀의 경우, 큰 밝은 형광 신호 ( 예 : Figure 1A (오른쪽 패널), 주황색 화살촉)은 종종 뉴런에서 관찰됩니다. 이 신호들은 때때로 누적 된 소낭이나 병적 정맥류를 나타 내기 때문에 운동성을 정량화하기 위해 이러한 신호를 피해야합니다.
7. 모든 순차 이미지에서 vesicles의 xy 좌표를 수집하려면 3.6 단계를 반복하십시오. 각 이미지는 참조 점이 선택된 후 자동으로 연속 이미지로 진행됩니다.
8. 이 데이터를 새 테이블 ( 예 : 스프레드 시트)로 내 보냅니다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 적절한 그래프를 만듭니다 ( 재료 표 참조).
   참고 : 데이터를 분석하려면 <거리> 열을 선택하고이 열의 모든 값을 합한 다음 그림 1B 와 같이 운동 거리를 막대 그래프로 표시합니다. 또한이 단계를 반복하고 전체 운동 거리의 평균을 계산하고 막대 그래프로 표시합니다 ( 그림 1C) . 막대 그래프와 파형 데이터를 생성하는 소프트웨어는자료 표.

이 분석은 체외 배양 에서 소포 역학을 측정하기 위해 고안되었습니다. 이 분석은의 연결 형태 및 생존과 관련된 소포 운동성을 결정하는 데 활용되었습니다. 그림 1A 및 B 는 뉴런의 리소좀 운동성을 보여주는 대표적인 데이터를 표시합니다. 피질 뉴런은 리소좀 마커, LAMP-EGFP로 형질 감염되었고, 표준 형광 현미경을 사용하여 관찰되었다. 이전에는 특정 엔도 좀 - 리소좀 소포가 쉬고있는 뉴런 에서조차도 매우 이동성이 있다고보고되었습니다. 사실, 이러한 결과는 같은 수상 돌기 ( 그림 1A 와 B )에 휴식과 움직이는 소포 둘 다 보여줍니다. 일반적으로 쉬고있는 소포는 갈색의 움직임과 같은 진동 운동을 뉴런 수상 돌기에서 나타낸다. 대조적으로, 움직이는 소포는 불규칙한 운동성을 나타낸다. 우리는 각각의 소포가 다른lysosome vesicles에서도 기능의 결정을 내리는 구성적인 특성 ⁸ . 따라서, 이러한 접근법을 사용하는 소포의 분류는 유용한 정보를 제공 할 수있다. 이 시스템을 사용하면 이러한 소포의 평균 운동성을 정량화하고 ( 그림 1C )이 시스템을 사용하여 소포 성질을 시간에 따라 효과적으로 분석 할 수 있습니다.

그림 1 : 신경원 수상 돌기에서의 라이 소솜 운동성. ( A ) 마우스 대뇌 피질 뉴런 (4 DIV)은 LAMP-EGFP 플라스미드로 2 일 동안 형질 감염시켰다. 이 이미지는 수상 돌기에서 LAMP-EGFP- 함유 소포의 운동성을 보여줍니다. 삽화는 LAMP-EGFP 양성 소포의 시간 경과 이미지를 보여줍니다. 빨간색 화살촉은 움직이는 소포를 나타내며 파란색 화살촉은 휴식 소포를 나타냅니다. 주황색 화살촉은 더 큰 형광 신호를 나타냅니다.에 위. 스케일 바 = 20 μm. ( B )는 그림 A의 LAMP-EGFP 양성 소포의 시간 의존적 인 x 축 위치입니다. (b)로 표시된 빨간 동그라미의 소포는 움직이며, (a)로 표시된 파란색 동그라미의 소포는 쉬고 있습니다. 스케일 바 : 5 μm (왼쪽). 막대 그래프는 LAMP-EGFP 이동의 총 거리를 나타냅니다 (오른쪽). ( C ) 막대 그래프는 LAMP - EGFP - 함유 vesicles의 평균 운동 거리를 나타냅니다. (n = 5, 평균 ± SEM의 표준 오차, Student t- 검정 에 의한 ** p <0.01). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이 프로토콜은 소포 운동성을 정량화하는 절차를 소개합니다. 일차 뉴런에서 엔도 좀과 리소좀은 젊은 뉴런에서 높은 운동성을 나타내는 경향이 있습니다 (4-6 DIV). 뉴런은 신경 프로세스를 길게하기 위해 리딩 에지에 몇 가지 구성 요소를 제공해야한다는 것을 감안할 때 멤브레인 트래 피킹은이 단계에서 동적으로 발생해야합니다. 따라서, 신경 dendrites의 동적 운동을 관찰하기 위해 젊은 뉴런을 사용하는 것이 중요합니다. 또한, 큰 베 시클은 젊은 뉴런에서도 높은 운동성을 나타내는 경향이 없습니다. 소포 크기의 조절은 융합 - 핵분열 단계의 빈도와 관련이있다. 역동적으로 움직이지 않는 특정 소포는 다른 소포를 쉽게 받아들이고 운동을 종결시킬 수 있습니다. 따라서 소포를 선택하는 것은이 분석을위한 중요한 과정입니다.

객체를 추적하기 위해 몇 가지 무료 플러그인 소프트웨어 패키지를 사용할 수 있습니다 ²¹ . 예를 들어, 트랙메이트 패키지는 객체 ²² 를 추적 할 수 있으며 다양한 수학 정보를 제공하는 수치 소프트웨어로 수정할 수 있습니다. 반면에,이 프로토콜에서 상대적으로 간단한 이미지 분석에 사용하는 것은 약간 복잡합니다. Mtrack2는 또 다른 플러그인이며 MultiTracker 플러그인 ^23을 기반으로합니다. Mtrack2는 대상을 식별하고 다음 프레임에서 가장 가까운 대상을 결정할 수 있기 때문에 유용합니다. 이 접근법은 엄청난 양의 데이터를 정량화하는 데 유용합니다. 그러나 수동 추적은 더 적은 양의 이미지 데이터에 대해 더 신뢰할 수 있습니다. 따라서 더 작은 데이터 세트를 수량화하고 다른 소프트웨어를 사용하여 더 큰 볼륨을 모니터링하는 것이 더 나을 수 있음을 인정하기 위해 수동 추적을 권장합니다.

이 접근법에서는 몇 가지주의 사항을 취해야합니다. 첫째, 엄격한 데이터를 얻으려면 샘플링 속도가 높아야합니다. 일부 소포는 빠른 움직임을 보이고융합 분열 (fusion-fission)과 같은 급격한 변화와 외견 상 실종 (appearance-disappearance) 현상이 때때로 관찰되어, 빈번한 이미징 (imaging)이 변화의 징조를 놓치지 않기 위해 중요하다는 것을 나타낸다. 또 다른 요점은 스캐닝 디스크 공 촛점 현미경과 내부 반사 형광 현미경과 같은 하이 엔드 현미경을 사용하면 고해상도 흥미로운 데이터를 얻는 데 핵심이 될 수 있다는 것입니다. 하이 엔드 현미경을 사용하여 더 짧은 간격으로 이미지를 찍는 것이 좋습니다. 이미지는 장비 제한으로 인해 매 5 초마다 찍었습니다.

상당한 연구 결과 막 매매와 신경 장애 사이의 생물학적 연관성이 제기되었다 ² . 예를 들어, 리소좀 결함이 Niemann-Pick 병 및 Gaucher 질환과 같은 심한 신경 장애에 관여한다는 것이 입증되었습니다. 흥미롭게도, 여러 연구에 의하면 리소좀 운동과 지방화가lysosomal 저장 장애의 개시 ⁶ . 소포 운동성이 이러한 장애에 대한 바이오 마커로 사용될 수 있습니다. 하나의 흥미로운 접근법은 인간 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)의 이용 가능성에서 발생할 수 있습니다. iPSCs 유래 뉴런을 사용하여 소포 운동성을 조사하면 리소좀 성 저장 장애에 대한 바이오 마커가 밝혀 질 수 있습니다. 이 접근법은 질병의 위험에 처한 프로세스에 대한 단서를 제공합니다.

이 분석은 간단하기 때문에 운동성 데이터를 얻는 것이 쉽습니다. 또한 이동 및 형태 학적 변화를 포함한 다른 세포 사건의 분석에도 적용 가능합니다. 이 접근법은 단순성으로 인해 여러 가지 한계가 있음을 알아 두는 것이 중요합니다. 따라서, 전기 생리학, 생화학 및 전자 현미경 분석을 포함한 다른 접근법을 사용하여 신경 인신 매매의 정확한 생리적 관련성을 이해할 필요가 있습니다. 그럼에도 불구하고이 접근법은 가치있는인신 매매를 직접적이고 시간 효율적으로 분석하고자하는 연구자에게 적합합니다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이번 분석을 돕기 위해 Ricardo Dolmetsch 박사 (Stanford University of Medicine, 현재 : Novartis Institute for Biomedical Research)와 Matthew Wood 박사, Aihara Takum, Dongsook Kim에게 감사드립니다.