كمي من إندوسوم و ليسوسوم التحركات في الخلايا العصبية المستزرعة باستخدام تحقيقات الفلورسنت

التحقيق في الاتجار بالغشاء أمر بالغ الأهمية لفهم وظائف الخلايا العصبية. هنا، ونحن نقدم طريقة لقياس الحركة الحويصلة في الخلايا العصبية. هذا هو وسيلة مريحة التي يمكن أن تتكيف مع القياس الكمي للاتجار الغشاء في الجهاز العصبي.

في الدماغ، نظم الاتجار غشاء تلعب أدوارا هامة في تنظيم وظائف الخلايا العصبية، مثل التشكل العصبية، اللدونة متشابك، والبقاء على قيد الحياة، والاتصالات الدبقية. حتى الآن، وقد ذكرت العديد من الدراسات أن عيوب في هذه النظم تسبب مختلف الأمراض العصبية. وهكذا، فهم الآليات الكامنة وراء ديناميات الحويصلة قد توفر أدلة مؤثرة التي يمكن أن تساعد في علاج العديد من الاضطرابات العصبية. هنا، نحن تصف طريقة لقياس الحركات الحويصلات، مثل المسافة الحركة ومعدل الحركة، وذلك باستخدام برنامج المكونات في لمنصة إيماجيج. للحصول على صور لتقدير الكميات، وصفنا الهياكل العصبية-ليسوسوم الخلايا العصبية مع إغف الموسومة بروتينات حويصلة علامة ولاحظ حركة الحويصلات باستخدام المجهر الفاصل الزمني. هذه الطريقة مفيدة للغاية وتبسيط قياس الحويصلة الحركة في نيوريتس، ​​مثل المحاور العصبية، والتشعبات، وكذلك في سوما من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية على حد سواء. Furthermoإعادة، وهذا الأسلوب يمكن تطبيقها على خطوط الخلايا الأخرى، مثل الخلايا الليفية والخلايا البطانية. ويمكن أن يوفر هذا النهج تقدما قيما لفهمنا للاتجار بالأغشية.

السيطرة الدقيقة على الاتجار إندوسوم-ليسوسوم أمر لا غنى عنه لتنظيم وظيفة الخلايا العصبية. ومن الجدير بالذكر أن الحركات الديناميكية لهذه الحويصلات هي عامل رئيسي في تنظيم التشكل العصبي، والتنمية، والبقاء على قيد الحياة. العيوب في هذا النظام يسبب اضطرابات عصبية شديدة ^{1 ، 2} . وتعتبر الآليات الجزيئية التي تربط الاتجار بالحويصلة بالأمراض العصبية معقدة، وسعت عدة مجموعات إلى دراسة هذه الأهمية. على سبيل المثال، فقد أفيد أن الحركة المضطربة في نهاية متأخرة يرتبط بشكل كبير مع نيمان بيك C المرض ³ ، وهو اضطراب العصبية الموروثة الناجمة عن عيوب ليسوسوم. مثال آخر هو طفرة في الليسوزومية كا ^{2 +} قناة، تربمل 1، مما يضعف الحركة الليزوزومية، مما أدى إلى أمراض تخزين الليزوزومية ^{4 ، 5 ، 6} . وقد ذكرت مجموعتنا أن التقلبات في بتدينز (3،5) P ₂ دوران يلغي إندوسوم و ليسوسوم حركية في الخلايا العصبية، مما يؤدي إلى زيادة في التعرض للاستجابة الإجهاد ^{7 ، 8} . تنظيم الأيض من بتدينز (3،5) P ₂ ، التي توضع في الغالب على إندوسوميس المتأخرة والليسوسومات، يلعب دورا هاما في مجموعة واسعة من الوظائف الخلوية، بما في ذلك الاتجار الحويصلة وعمليات الانصهار الانشطار ^{9 ، 10} . منذ ضعاف بتدينز (3،5) P ₂ دوران يسبب التنكس العصبي الحاد ^{11 ، 12} ، وتنظيم شاذ من الحركة إندوسوم-ليسوسوم يمكن أن يكون عاملا رئيسيا لفهم التسبب في التنكس العصبي. وبالتالي فإن التحقيق في الآليات الجزيئية التي تكمن وراء حركية الحويصلة قد توفر أدلة واعدة يمكن أن تعمق وندرضوخ العديد من الاضطرابات العصبية.

في هذه الورقة، ونحن نقدم طريقة قيمة لتحديد الحركة الحويصلة في الخلايا العصبية باستخدام حزمة البرمجيات الحرة تسمى دليل تتبع. وكان الهدف هو تطوير طريقة القياس الكمي لتحليل الحركة الحويصلة. يتم توجيه هذا التقدير الكمي من خلال نهج قياسي من النقر على نقطة مرجعية في كل إطار من فيلم الفاصل الزمني. استخدام برنامج التتبع اليدوي يجعل هذا النهج بسيطا جدا ومنفعة واسعة، على عكس التطبيقات الأخرى. وعلاوة على ذلك، هذا النهج ينطبق أيضا على خلايا أخرى، مثل الخلايا الدبقية. على الرغم من أن هذه الطريقة بدائية، فإنه يمكن تطبيقها على التحليلات المختلفة، بما في ذلك الحركة الخلوية والتغيير المورفولوجي. على سبيل المثال، بعد تحديد نقطة مرجعية عبر سلسلة من الصور، يمكن استخراج المعلومات عن مواقف النقاط المرجعية والوقت في كل موقف من الصور المتسلسلة باستخدام تحليل البيانات ومعالجة الصور الناعمةوير. مجتمعة، وهذه الطريقة هي بسيطة ولكنها قوية ويسهم في تطوير كفاءة محسنة في الدراسات التي تقوم على الاتجار الغشائي، مثل تلك التي فحص وظيفة إندوسوم-ليسوسوم.

تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية بموافقة من لجنة تسوكوبا رعاية الحيوان واستخدامها (إاكوك).

1. تشريح

1. لإعداد يوم الجنينية 13-14 إكر أو C57BL / 6 الأجنة، الموت ببطء الفئران الحوامل عن طريق خلع عنق الرحم. إزالة الرحم ووضعه في طبق بتري مع الحل الملح المتوازن هانك (هبس). شطف جيدا لإزالة الدم.
2. باستخدام ملقط، ونقل الرحم إلى طبق بتري جديد مع الايثانول 70٪ لتعقيم.
3. نقل الرحم إلى طبق بتري جديد مع هبس. إزالة الأجنة من الرحم باستخدام ملقط تشريح تعقيم ومقص جراحي.
4. قطع رأس الأجنة باستخدام مقص جراحي. وضعها في طبق بتري جديد مع هبس.
5. إزالة الجلد والجمجمة وإخراج العقول باستخدام ملقط تشريح تعقيمها. وضعها في طبق بتري مع هبس.
   ملاحظة: من هذه الخطوة على، فمن الأفضل لإجراء الإجراء على نظيفةمقاعد البدلاء.
6. إزالة السحايا باستخدام ملقط تشريح تعقيم تحت المجهر ستيريو. قطع العقد القاعدية، الحصين، والمخيخ باستخدام ملقط. باستخدام ملقط تلميح المنحني، ونقل القشور إلى طبق بتري جديد مع هبس.
7. جمع كل القشور باستخدام قطارة المتاح أو ماصة 25 مل. وضعها في أنبوب 15 مل ثم إزالة هبس بواسطة بيبتينغ.
8. إضافة 3 مل من محلول انزيم القشرية الدماغية إلى أنبوب يحتوي على القشرة. وضع هذا الأنبوب في حمام مائي واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   ملاحظة: إعداد انزيم ثقافة القشرية الدماغية التي تتكون من الفوسفات مخزنة المالحة (بس) مع التربسين 0.25٪ و 1 ملي إدتا. تعقيم مع مرشح 0.22 ميكرون.
9. إضافة 3 مل أخرى من حل إنزيم القشرية الدماغية في أنبوب يحتوي على القشور واحتضان عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 5 دقائق إضافية.
10. إزالة حل إنزيم القشرية الدماغية باستخدام ماصة 5 مل وإضافة 5 مل من دولبكو تعديل النسر المتوسطة (دمم) تحتوي على 10٪ مصل بقري الجنين (فبس).
11. فصل القشور بيبتينغ بلطف صعودا وهبوطا باستخدام ماصة 5 مل مع طرف P1000 العقيمة. ماصة مرة أخرى باستخدام ماصة 5 مل مع طرف P200.
12. وضع مصفاة خلية النايلون 40 ميكرون على أنبوب 50 مل وتصفية تعليق لإزالة الحطام.
13. أجهزة الطرد المركزي في 420 x ج لمدة 5 دقائق في رت ثم إزالة وسط دمم.
14. إضافة 5 مل من وسط زراعة القشرية الدماغية و ريسوسبيند بلطف بيليه الخلية.
    ملاحظة: إعداد وسط ثقافة القشرية الدماغية التي تتألف من المتوسطة القاعدية العصبية تستكمل مع 1X B-27 المكملات الغذائية، 2 ملي L- الجلوتامين، و 100 U / مل البنسلين الستربتومايسين.
15. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات وضبط تركيز الخلية (كما هو مطلوب) باستخدام وسط زراعة القشرية الدماغية.
16. لوحة 3.0 × 10 ⁶ الخلايا العصبية القشرية في 2.0 مل لكل المغلفة 35 ملم أطباق القاع الزجاج.
    ملاحظة: قبل الطلاء، معطفأطباق ذات قاع زجاجي بقطر 35 مم مع 0.1 ملغم / مل هيدروبروميد بولي-D- ليسين (بدل) أو 0.01٪ بولي-L-أورنيثين (بلو). احتضان لمدة 3 ساعات - O / N عند 37 درجة مئوية وغسل مع برنامج تلفزيوني على الأقل 3X.

2. التصوير الحويصلة الحركة

1. إعداد البلازميدات التي سوف تسمية كل نوع من الحويصلة. على سبيل المثال، استخدم إغف-Rab5 لل إندوسوميس في وقت مبكر، إغف-Rab7 ل إندوسوميس المتأخرة، لامب-إغف للليسوسومات، و إغف-LC3 ل أوتوفاغوسوميس ^{8 ، 13} .
   ملاحظة: هذه البلازميدات متوفرة عند الطلب من tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp. عادة، 3 -5 أيام في المختبر (ديف) الخلايا العصبية يمكن ترانزفكتد مع هذه البلازميدات باستخدام الكواشف ترنسفكأيشن.
2. مزيج 4.0 ميكروغرام من البلازميدات مع 200 ميكرولتر من المتوسطة خالية من المصل عن طريق بيبتينغ. في أنبوب منفصل، تمييع 8 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن (انظر جدول المواد ) في 200 ميكرولتر من المتوسطة خالية من المصل. احتضان لمدة 5 دقائق في رت.
3. مزيج الحل البلازميد و ترنسفكأيشن ريجنت الحل في الخطوة 2.2 بواسطة بيبتينغ. احتضان لمدة 20 دقيقة في رت.
4. إضافة المتوسطة خالية من مصل و 400 ميكرولتر من محلول البلازميد من الخطوة 2.3 إلى كل طبق الزجاج السفلي المغلفة. احتضان الخلايا العصبية عند 37 درجة مئوية في 5٪ كو ₂ حاضنة لمدة 30 دقيقة. استبدال المتوسطة مع 2 مل من وسط ثقافة القشرية الدماغية. احتضان الخلايا العصبية عند 37 درجة مئوية في 5٪ كو ₂ حاضنة لمدة 1-2 أيام.
5. بعد 1 - 2 د من ترنسفكأيشن، حدد الخلايا ترانزفكتد للحصول على الصور.
   ملاحظة: الخلايا العصبية المبكرة أقل من 7 ديف لديهم ميل لإظهار حركة حويصلة ديناميكية. حدد الخلايا العصبية التي تعبر بشكل معتدل مسبار مضان لأنه لا يمكن الحصول على صور واضحة عندما يتم تحديد الخلايا العصبية معربا للغاية. أيضا، حدد شكل عصبي نموذجي، مثل الخلايا العصبية الهرمية، والتي لديها محاور عصبية طويلة والتشعبات المعقدة، لسهولة تحديد محور عصبي وتشعبات (انظر الشكل 1A).
6. اكتساب صورة باستخدام نظام التصوير الفاصل الزمني:
   للتصوير، واستخدام المجهر مضان مجهزة مع جهاز شحن المسؤول (كسد) مع 40X خطة أبو 0.95NA أو 100X خطة أبو العدسات فك NA1.4 الهدف. السيطرة على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية باستخدام نظام الحضانة. الحصول على الصور العصبية في إطار واحد / 5 ثانية على مدى فترة 100 ثانية التي تسيطر عليها برامج الحصول على الصور. بدلا من ذلك، الحصول على الصور على فترات أقصر وللفترات الزمنية أطول، مثل في إطار واحد لكل 2 ثانية على مدى فترة 300 ثانية.
   ملاحظة: تتوفر مجموعة متنوعة من التطبيقات لالتقاط صور متتابعة، وكثير منها سيكون مناسبا لهذه الطريقة. ولذلك، لا ينصح تطبيق معين. بدلا من ذلك، يجب على كل باحث استخدام أي تطبيق متاح.

3. تحليل الصورة

1. فتح جميع الصور المتسلسلة في برنامج إيماجيج مع تتبع اليدوي ¹⁴ .
   ملاحظة: حتى الآن، كان تتبع اليدوي وايديلي المستخدمة في تتبع التجارب ^{15 ، 16 ، 17 ، 18 ، 19} . وقد وضعت التتبع اليدوي من قبل الدكتور فابريس كورديليرز. تتوفر تعليمات مكتوبة مفصلة على الإنترنت ²⁰ . لتحليل، وتحسين جودة البيانات التصوير مع عدد كاف من الصور. فمن المستحسن استخدام أكثر من 20 صورة.
2. لدمج الصور المتسلسلة، اختر <إيماج> → <ستاكس> → <إيماجيس تو ستاك>. انقر على <موافق>.
3. اختر <بلوجينز> → <مانوال تراكينغ>؛ فإن نافذة تتبع يطفو على السطح.
4. انقر على مربع الاختيار <عرض المعلمات؟> وحدد معلمات التتبع في قسم المعلمات.
   ملاحظة: يمكن تعيين العديد من المعلمات، بما في ذلك الفاصل الزمني، x / y المعايرة، ض المعايرة، البحث مربع الحجم للمركزإنغ، حجم النقطة، عرض الخط، وحجم الخط. في هذا الفحص المبسط، تم تعريف كل من الفاصل الزمني و x / y المعايرة. وفي ظروف تجريبية أخرى، قد يكون من الضروري تحديد معلمات أخرى أيضا. المعلمات المستخدمة هنا هي كما يلي: <فاصل زمني> هو 5 ثانية، و إما 0.26642 ميكرون ل 40X خطة أبو 0.95NA عدسة موضوعية أو 0.10657 ميكرون لخطة 100X أبو فك NA1.4 عدسة موضوعية.
5. بعد تحديد المعلمات، انقر على <أد تراك> لبدء مسار جديد.
6. بعد تحديد حويصلات الفائدة (على سبيل المثال، الحويصلات المشار إليها من قبل السهام الأزرق والأحمر في الشكل 1A (اللوحة اليمنى))، انقر على مركز الإشارات في الصور المتسلسلة لتسجيل الإحداثيات زي. تظهر نتائج إحداثيات زي المسجلة والمسافة والسرعة في نافذة جديدة.
   ملاحظة: في حالة الليزوزومات، إشارات الفلورسنت مشرق كبيرة (على سبيل المثال، الشكلأور 1A (اللوحة اليمنى)، رأس السهم البرتقالي) وغالبا ما لوحظ في الخلايا العصبية. كما أن هذه الإشارات تظهر أحيانا الحويصلات المتراكمة أو دوالي المرضية، وينبغي تجنب هذه الإشارات لقياس الحركة.
7. كرر الخطوة 3.6 لجمع الإحداثيات زي من الحويصلات من جميع الصور متتابعة. كل صورة تقدم تلقائيا إلى الصورة المتعاقبة بعد اختيار نقطة مرجعية.
8. تصدير هذه البيانات إلى جدول جديد (على سبيل المثال، جدول بيانات). استخدم برنامجا مناسبا لإنشاء رسم بياني مناسب (انظر جدول المواد ).
   ملاحظة: لتحليل البيانات، حدد العمود <ديستانس>، تلخيص كل قيم هذا العمود، وتظهر المسافة الحركة كرسم بياني شريطي، كما هو الحال في الشكل 1B . بالإضافة إلى ذلك، كرر هذه الخطوة، وحساب متوسط ​​المسافة الحركة الكلي، وتظهر كرسم بياني شريطي، كما هو الحال في الشكل 1C . يتم عرض البرنامج لإنشاء رسم بياني شريطي وبيانات الموجي فيجدول المواد.

وقد تم تصميم هذا الفحص لقياس ديناميات الحويصلة في الثقافة في المختبر . وقد استخدم هذا الفحص لتحديد حركة الحويصلة المرتبطة مورفولوجيا الخلايا العصبية والبقاء على قيد الحياة. الشكل 1A والبيانات B عرض ممثل تظهر الحركة ليسوسوم في الخلايا العصبية. تم ترانزفكتد الخلايا العصبية القشرية مع علامة ليسوسوم، لامب-إغف، ولاحظت باستخدام المجهر مضان القياسية. وقد ذكرت سابقا أن الحويصلات إندوسوم-ليسوسوم محددة متحركة للغاية، حتى في يستريح الخلايا العصبية ⁸ . في الواقع، تظهر هذه النتائج على حد سواء يستريح والحويصلات تتحرك في نفس التغشية ( الشكل 1A و B ). عادة، يستريح حويصلات يحمل حركة اهتزازي، مثل حركة براونية، في [دندريتس] عصبية. في المقابل، الحويصلات المتحركة تظهر حركة غير منتظمة. نحن التكهن بأن كل حويصلة لديها مختلفةميزة التركيبية التي تكمن وراء تحديد وظيفة، حتى في الحويصلات ليسوسوم ⁸ . وهكذا، فإن تصنيف الحويصلات باستخدام هذا النهج قد توفر معلومات مفيدة. باستخدام هذا النظام، فمن السهل لتحديد متوسط ​​حركية هذه الحويصلات ( الشكل 1C ) وتحليل خصائص حويصلة باستخدام هذا النظام بطريقة فعالة من حيث الوقت.

الشكل 1: حركة ليسوسوم في التشعبات العصبية. ( A ) الخلايا العصبية الماوس القشرية (4 ديف) ترانزفكتد مع لامب-إغف البلازميد لمدة 2 يوما. تظهر هذه الصورة حركية الحويصلات التي تحتوي على لامب-إغف في التشعبات. يظهر أقحم صورة الوقت الفاصل بين الحويصلات إيجابية لامب-إغف. يشير السهم الأحمر إلى حويصلة متحركة، ويشير رأس السهم الأزرق إلى حويصلة يستريح. رؤوس الأسهم البرتقالية تشير إلى إشارات الفلورسنت أكبر، كما أشيرإلى أعلى. شريط مقياس = 20 ميكرون. ( B ) موقف x- محور تعتمد على الوقت من الحويصلات إيجابية لامب-إغف من الشكل A. الحويصلة في الدائرة الحمراء المسمى (ب) يتحرك، والحويصلة في الدائرة الزرقاء المسمى (أ) يستريح. شريط مقياس: 5 ميكرون (يسار). الرسم البياني شريط يشير إلى المسافة الإجمالية للحركة لامب-إغف (يمين). ( C ) الرسم البياني شريط يشير إلى متوسط ​​المسافة الحركية من الحويصلات التي تحتوي على لامب-إغف. (n = 5، يعني ± الخطأ المعياري للمتوسط ​​[سيم]، ** p <0.01 بواسطة t -test للطالب). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

هذا البروتوكول يقدم الإجراء لقياس الحركة الحويصلة. في الخلايا العصبية الأولية، إندوسوميس و ليسوسوميس تميل إلى إظهار حركية عالية في الخلايا العصبية الأصغر سنا (4-6 ديف). وبالنظر إلى أن الخلايا العصبية يجب أن تقدم بعض المكونات إلى الحواف الرائدة لاستطالة العمليات العصبية، وينبغي أن يحدث الاتجار الغشائي بشكل حيوي خلال هذه المرحلة. وبالتالي، فمن المهم استخدام الخلايا العصبية الأصغر سنا لمراقبة الحركة الديناميكية في التشعبات العصبية. وبالإضافة إلى ذلك، حويصلات أكبر لا تميل إلى أن تظهر حركية عالية، حتى في الخلايا العصبية الأصغر سنا. ومن المرجح أن تشارك في حجم حويصلة في وتيرة الخطوات الانصهار الانشطار. قد يكون من الممكن أن الحويصلات المحددة التي لا تتحرك بشكل حيوي بسهولة تقبل الحويصلات الأخرى بسهولة وإنهاء تحركاتهم. وبالتالي، واختيار الحويصلات هو عملية هامة لهذا التحليل.

تتوفر عدة برامج مجانية في المكونات البرمجية لتتبع الأجسام ²¹ . على سبيل المثال، المسارحزمة ماتي يمكن تتبع الأجسام ²² ويمكن تعديلها من قبل البرامج العددية، وتوفير مجموعة من المعلومات الرياضية. من ناحية أخرى، فمن معقدة قليلا لاستخدام لتحليل الصور بسيطة نسبيا في هذا البروتوكول. Mtrack2 هو آخر المكونات في ويستند على مولتيتراكر المكونات في ²³ . Mtrack2 هو أيضا مفيد لأنه يمكن تحديد الأهداف ومن ثم تحديد أي الأهداف في الإطارات التالية هي الأقرب. وهذا النهج مفيد لقياس كميات هائلة من البيانات؛ ومع ذلك، قد يكون التتبع اليدوي أكثر موثوقية لحجم أصغر من بيانات الصور. ولذلك، فإننا نوصي التتبع اليدوي لتحديد مجموعات أصغر من البيانات والاعتراف بأنه قد يكون من الأفضل استخدام برامج أخرى لمراقبة كميات أكبر.

وينبغي اتخاذ العديد من الاحتياطات في هذا النهج. أولا، يجب أن يكون معدل أخذ العينات عالية من أجل الحصول على بيانات صارمة. وذلك لأن بعض الحويصلات تظهر حركة سريعة ووالتغيرات المفاجئة، مثل الانصهار الانشطار، وأحداث ظهور الاختفاء يلاحظ في بعض الأحيان، مشيرا إلى أن التصوير المتكرر أمر حاسم لتجنب تفويت علامة على أي تغييرات. نقطة أخرى هي أن استخدام المجاهر الراقية، مثل المجهر متحد البؤر القرص ومجموع الانعكاس المجاهر مضان الداخلية، قد يكون المفتاح للحصول على بيانات عالية الدقة، مثيرة للاهتمام. فمن المستحسن لالتقاط الصور على فترات أقصر باستخدام المجهر الراقية، على الرغم من هنا، تم التقاط الصور كل 5 ثانية بسبب قيود المعدات.

وقد اقترحت دراسات كبيرة وجود صلة بيولوجية بين الاتجار الغشائي واضطرابات الخلايا العصبية ² . على سبيل المثال، فقد ثبت أن العيوب الليزوزومية تشارك في اضطرابات عصبية حادة، مثل مرض نيمان بيك ومرض جوشر ²⁴ . ومن المثير للاهتمام، وذكرت العديد من الدراسات أن حركة الليزوزومية وتوطين تشارك فيبداية اضطراب تخزين الليزوزومية ⁶ . فمن الممكن أن الحركة الحويصلة يمكن استخدامها كعلامة بيولوجية لهذه الاضطرابات. قد تنشأ واحدة من نهج مثيرة للاهتمام من توافر الخلايا الجذعية المحفزة البشرية (إيبسس). التحقيق الحويصلة الحركة باستخدام الخلايا العصبية المستمدة إيبسس قد تكشف عن المؤشرات الحيوية للاضطرابات تخزين الليزوزومية. ويوفر هذا النهج بعض الأدلة على العمليات التي تكمن وراء خطر المرض.

منذ هذا الفحص هو بسيط، فمن السهل الحصول على بيانات الحركة. أيضا، فإنه ينطبق على تحليل الأحداث الخلوية الأخرى، بما في ذلك الهجرة والتغيرات المورفولوجية. ومن المهم أن نلاحظ أن هذا النهج له العديد من القيود بسبب بساطته. على هذا النحو، فمن الضروري استخدام نهج أخرى، بما في ذلك الكهربية، والكيمياء الحيوية، وتحليل المجهر الالكتروني، لفهم الصلة الفسيولوجية الدقيقة للاتجار العصبية. ومع ذلك، فإن هذا النهج هو ميثو قيمة(د) مناسب للباحثين الذين يرغبون في تحليل الاتجار بطريقة مباشرة وفعالة من حيث الوقت.

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

نشكر الدكتور ريكاردو دولميتسش (كلية الطب بجامعة ستانفورد؛ الانتماء الحالي: معاهد نوفارتيس للبحوث الطبية الحيوية) للمساعدة في تطوير هذا التحليل والدكتور ماثيو وود، تاكوما أيهارا، ودونغسوك كيم لقراءتهم النقدية للمخطوطة.