대사 프로파일의 실시간 분석

소장 토굴 organoids 줄기 세포와 그 틈새에 의존 소낭의 성장을 되풀이 조직 배양 시스템을 제공하는 생체 외 배양. 우리는 기본 마우스 토굴 organoids에 실시간으로 대사 프로파일을 분석하는 방법을 설립했다. 우리는 organoids 자신의 소스에 의해 정의 된 생리 학적 특성을 유지했습니다.

소장 점막은 두 가지 기본적인 구조로 구성 반복적 인 구조 전시 : 융모, 장 내강으로 돌출 성숙 장 세포, 술잔 세포와 enteroendocrine 세포 구성을; 및 점막하 근육 판과, 은닉 성체 줄기 및 전구 세포 및 성숙한 Paneth 세포 근위뿐만 아니라 간질과 토굴 미세 환경의 면역 세포를있는 소낭. 지난 몇 년 전까지의 소장 시험 관내 연구에서 양성 또는 악성 종양 중 하나로부터 유래 된 세포주로 제한하고, 정상적인 장 상피의 생리 상주하는 미세 환경의 영향을 나타내지 않았다. 여기서 우리는 사토 등의 알에서 적응하는 방법. (2009) C57BL / 6 마우스에서 파생 된 기본 마우스 장 토굴 organoids을 배양를 보여줍니다. 또, 측정에 의해 실시간으로 토굴 대사 프로파일을 분석하는 토굴 organoid 배양의 사용을 제시기저 산소 소비, 당분 레이트, ATP 생산 및 호흡 능력, 표준. Organoids는 소스에 의해 정의 된 속성을 유지하고 산소 소비와 세포 외 산성화 속도에 의해 반사 된 대사 적응의 측면을 유지합니다. 이 토굴 organoid 문화 시스템에서 실시간 대사 연구는 토굴 organoid 에너지 대사를 연구하는 강력한 도구이며, 어떻게이 영양과 약물 학적 요인에 의해 변조 될 수 있습니다.

대장 암 (CRC)는 미국에서 암 관련 사망 원인 중 3 위를 차지한다. 산발적 인 대장 암은 - 즉 인생의 뒷부분에서 발생하는 (> 50 세)와 명확한 걸리기 유전 적 요인과 -를 차지하고 ~ 강하게 장기식이 패턴 ^{1, 2에} 의해 영향을 발생으로 모든 경우의 80 %. 이 종양은 종양 세포의 증식 ^3-5의 높은 비율을 허용 아마도 운전하는 부분 (glutaminolysis을 통해) 사용 가능한 휴대 빌딩 블록과 에너지의 높은 농도를 만들 수 바르 부르크 효과로 알려진 산화 적 해당 작용에 대한 의존도를 향한 신진 대사 변화를, 전시 . 소장 암을 포함하여 대장 암에 대한 연구뿐만 아니라 다른 위장관 암 종양 형성의 원인으로 중요 통찰력을 제공. 탐지를 도울 수있다 위장 기관계의 정상 친 종양 및 종양 상태 사이의 차이를 조사 대사종양 발생에 대한 상대 위험뿐만 아니라 종양의 조기 발견 ermination. 또한, 미토콘드리아의 호흡과 당분을 포함하는 생체 에너지 대사를 이해하는 것은 세포 생리학, 노화 및 질병 상태가 장내 항상성을 교란하는 방법에 근본적인 통찰력을 제공 할 것입니다. 세포 외 플럭스 분석을위한 생체 에너지 분석 기술의 활용이 실시간으로 ^6,7 문화에서 성장 세포에서 동시에 미토콘드리아 호흡과 당분의 비율을 평가할 수 있습니다.

최근까지 소장의 시험 관내 연구는 양성 또는 악성 종양 중 ^-8,9- 유래 세포주에 한정되었고, 정상적인 장 상피의 생리 상주하는 미세 환경의 영향을 나타내지 않았다. 2009 년, 사토 등. ^(10)는 체외 배양 3 차원 (3D) 마우스 장내 상피 organoids를 성장 시스템, 또는 epith 소개실험 진단 및 치료 연구 ^{(10, 11)에} 적합 elial "미니 용기". 또한, 열량 제한 쥐에서 분리 된 납골당은 문화 ¹² organoids 그들의 변화된 성장 특성을 유지한다. 형질 전환 된 세포주에 비해 토굴 organoid 배양 생체 상태를 이해하기 위해 훨씬 더 좋은 모델을 제시 생리 관련 데이터를 생성하는데 사용될 수있다.

우리는 장 토굴 organoids의 에너지 대사를 분석하는 생체 에너지 분석 기술을 적용. 마우스 장 토굴 organoids 제시 토굴 organoid 에너지 대사 연구 개발에 체외 배양 하였다. 산소 소비 속도 (OCR) 및 굴 organoids의 세포 외 산성화 레이트 (ECAR)가없는 두 개의 다른 대사 억제제 (oligomycin, 로테 논) 및 이온 담체 (보닐 시안화 메틸 -p- trifluoromethoxyphenylhydrazone)의 존재하에 측정 하였다. 토굴 ORGA이러한 화학 물질에 솔레노이드 대사 반응은 성공적으로 변화 ECAR 및 OCR 값을 반영했다.

셀룰러 바이오 에너지 연구는 암, 비만, 당뇨병, 대사 장애 및 미토콘드리아 질환 신진 대사 상태와 질병 위험과 표현형 사이의 상호 작용을 규명하고 병진 의학에 대한 직접적인 영향은 사전 심사 방법을 도움이 될 것입니다. 여기에, 우리는 상세한 프로토콜 소장 납골당을 분리하고 문화 토굴 organoids의 정보는 다음의 제품에 대해 설명합니다. 또한, 우리는 대사 분석을 위해 토굴 organoid 문화를 사용하는 새로운 방법을 소개합니다.

이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서의 권장 사항에 따라 수행되었다. 이 프로토콜은 의학의 알버트 아인슈타인 대학의 동물 실험 윤리위원회에 의해 승인되었다.

1. 크립트의 분리 및 문화

1. 소장에서 납골당의 분리 :
   1. 관심의 마우스 모델에서 장 지하실을 격리 할 것. 자궁 경부 전위 다음 CO _2와 쥐를 안락사.
   2. 길이 방향으로 복부를 열고 얼음 차가운 인산염 완충 생리 식염수와 소장 (SI)를 작성, PBS (-ca ^{2 +;} -Mg ²⁺⁾ 2 배 항생제 항진균제 (안티 - 안티)와. 신속 소장을 격리 할 것.
   3. 철저하게 메스를 사용하여 장간막 지방의 무료 해부. 조직을 관통하지 않도록주의 - 모든 시간은 얼음 차가운 PBS와 촉촉한 조직 유지에. INTE을 엽니 다스타 인 세로 방향으로 얼음 차가운 PBS로 깨끗이 씻어.
   4. 미리 냉각 슬라이드를 사용하여 융모를 긁어 부드럽게, 두 부분으로 소장을 잘라 젖은면 팁을 사용하여 평평. 얼음처럼 차가운 PBS 여러 번에 적극적으로 씻으십시오.
   5. 조직의 비 효소 분해에 대해 3mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) /0.5 mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT) 당 1X PBS 20 ㎖의 3 분 부화.
   6. 미리 냉각 슬라이드에 면도날을 사용하여 작은 조각 (2-4mm)로 조직을 잘라. 20 ml의 빙냉 PBS를 함유하는 50 ㎖ 튜브에 조각을 전송.
   7. 피펫은 위아래로 부드럽게 10 배 10 ml의 멸균 일회용 피펫을 사용하여. 조직 조각이 중력에 의해 침전하자. 피펫으로 상층 액을 제거합니다. 세 개의 추가 번 반복; 확인 상층 액은 분명합니다.
   8. 2 mM의 EDTA 당 PBS의 20 ML을 추가합니다. 소용돌이와 부드러운 락을 30 분 동안 4 ° C에서 배양한다.
   9. 조직 침전물을하자 상층 액을 제거한다. 15 ml의 얼음 차가운 PBS 및 피펫 추가위로 10ml를 피펫으로 5 배 아래로. 조직 파편이 침전물하자 분수 1 (F1)과 상층 액을 수집합니다. F2-F5, 별도로 관리 각 부분을 수집 반복합니다.
   10. 15 초 동안 손으로 격렬하게 15 ml의 얼음 차가운 PBS이 때 흔들림을 추가합니다. , F8을 F6를 수집하고 F7을 위해 반복합니다. 조직 조각이 떠 시작하면, 그들이 정착하기 위해 누릅니다.
   11. 현미경 각 부분의 나누어지는을 검사합니다. 지하실을 포함하는 분획 풀.
   12. 50 ML 튜브에 지하실을 수집, 70 μm의 나일론 셀 스트레이너를 통해 풀링 분수를 전달합니다.
   13. 4 ° C에서 5 분 100 XG에 원심 분리기, 15 ML 튜브에 2 배 안티 - 안티 및 전송 납골당 10 ml의 얼음 차가운 PBS에서 뜨는에 resuspend 펠렛을 폐기합니다. 세차를 한 번 더 반복합니다.
   14. 배 안티 - 안티 - 10 ml의 얼음처럼 차가운 ADF, 고급 DMEM / F-12 (둘 베코 "의 수정 이글 중간 / 햄"의 F-12)로 한 번 지하실을 씻으십시오.
   15. 한 번 납골당 10 ㎖를 씻어DF는 - 안티 - 안티 1 배.
   16. 혈구를 사용하여 지하실을 계산합니다. 토굴 솔루션 볼륨을 조정하고 재현 탁 최종 토굴 농도가 젤라틴 단백질 혼합물 (마트 리겔)의 50 μL 당 100 ~ 500 지하실 될 수 있도록 1.5 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. 젤라틴 단백질 혼합물에서 4 ° C 및 재현 탁 지하실에서 5 분 100 XG에 원심 분리기.
   17. 접시 토굴 50㎕의 - 24 웰 플레이트에 웰 당 단백질 젤라틴 혼합물을 현탁액 (성장 면적 : 2cm ^2), 신중을 각 웰의 중앙에 현탁액 드롭을 배치. , CO _2의 서스펜션은 굳은 ~ 30 분까지 37 ° C 배양기를 접시를 유지한다.
   18. 500 μl의 빙냉 완전 배양 배지 (고급 DMEM / 1X 방지와 F12 추가 - 안티 10 mm로 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES), 1X 루타, 1X B27 보충, 1X N2 보충, 1mM의 N-L 아세틸 시스테인 (NAC), 50 ng / ml의 상피 세포 성장 인자 (EGF), 100 / ㎖ ng를소량, 500 NG / ㎖의 R-Spondin).
       1. PBS 중 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)에 성장 인자를 재생성.
2. 크립트 Organoid 문화와 항로 :
   1. 항로 토굴 organoids 14-21일 포스트 시딩 (필요에 따라)은 다음과 같습니다 :
      1. 미디어 변경, 매주 금요일과 월요일. 수요일에, 새로운 미디어의 절반 미디어를 교체합니다.
   2. 문화 매체를 제거합니다. 5 분 간격으로 500 μL PBS로 두 번 샘플을 씻으십시오.
   3. PBS를 제거하고 부드럽게 멸균 P1000 마이크로 피펫 팁을 사용하여 젤라틴 단백질 혼합물을 휴식.
   4. 하나의 웰에 1 ml의 완전한 문화 매체를 추가하고 1 ml의 미디어 organoids를 재현 탁.
   5. 부드럽게 피펫 팅과 20-30x 아래 P1000을 사용하여 organoids 중단 (일관성있는 기술까지 좋은 토굴 수익률 적절한 organoid 해리에 대한 현미경 검사 개발).
   6. 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 지하실로 이동;4 ° C, 5 분에 100 XG에 원심 분리기.
   7. 1 ml의 완전한 배양 배지로 두 번 펠렛을 씻으십시오.
   8. 웰 당 50 μl를 매트 리겔에서 필요에 재현 탁 지하실 등의 6 : 3 또는 1 : 1의 비율로 분할. (섹션 1.1.16-18) 전술 한 바와 같이 진행합니다.
3. 크립트 Organoid 냉동 :
   1. 문화 매체를 제거합니다. 500 μL PBS에서 샘플을 씻으십시오.
   2. P1000 피펫 팁을 사용하여 젤라틴 단백질 혼합물을 분산.
   3. 하나의 웰에 1 ml의 미디어를 추가하고 1 ml의 미디어 organoids를 재현 탁.
   4. 부드럽게 아래로 20-30x 피펫 팅에 의해 P1000을 사용하여 organoids를 휴식.
   5. 1.5 ML 튜브에 organoids을 전송합니다. 4 ° C, 5 분 100 XG에 원심 분리기.
   6. 1 ml의 완전한 배양 배지로 두 번 펠렛을 씻으십시오.
   7. 미디어를 동결 500 μL에 재현 탁의 지하실.
   8. cryotube로 전송 지하실은 -80 ° C 냉동고 overni에 냉동 컨테이너 및 저장소에 튜브를 배치GHT.
   9. 액체 N ₂ 탱크에 지하실을 전송합니다.
      1. 빠르게 37 ° C의 물을 욕조에 해동하여 냉동 토굴 organoids를 복구 할 수 있습니다. 상기 한 바와 같이 100 XG, 젤라틴 단백질 혼합물에서 5 분 및 재현 탁하고, 문화 500 μL로 완전한 문화 번 미디어, 원심 분리기를 씻으십시오. 더 나은 복구의 경우, 냉동 미디어 ROCK 저해제 (Y-27632)를 추가합니다.

2. 크립트 Organoid 대사 분석

1. 24 웰 플레이트 준비 :
   1. 분리 및 프로토콜 (토굴 격리 및 토굴 통로 섹션 1.2 섹션 1.1 참조)에 따라 납골당을 계산합니다.
   2. 젤라틴 단백질 혼합물에 재현 탁의 지하실 (20 μL 당 100 ~ 200 납골당).
   3. 24 웰 분석 플레이트 플레이트 토굴 - 젤라틴 단백질 혼합물 서스펜션 (각 샘플에 대한 최소한 삼중 거기 있는지 확인) 현탁액은 CO _2에서 37 ° C에서 응고시킬 것인큐베이터; 500 μL 전체 문화 매체를 추가 할 수 있습니다.
   4. (1.1 절에 설명 된대로) 및 납골당이 완전히 개발 organoids으로 성장할 때까지 현미경으로 관찰 문화 지하실.
2. 세포 외 유출 분석 :
   1. 밤새 비 _{이산화탄소} 하이드레이트 카트리지 (0 %의 CO _2), 37 ° C 배양기.
   2. 배지를 제거하고 500 ㎕의 DMEM 회 organoids 세척 (않고 : 글루코스, L 글루타민, 피루브산 나트륨 및 중탄산 나트륨과 함께 : 페놀 레드). 5 분을 기다립니다.
   3. 각 웰에 잘 분석 매체 당 (DMEM 2 mM L- 글루타민 (L-glutamine), 5 mM의 D 글루코스) 675 μl를 추가합니다.
   4. organoids 및 젤라틴 단백질 혼합물은 세척 후 손상되지 않도록 토굴 organoids 미세한 형태를 확인합니다. 비 CO _2에서 1 시간, 37 ° C 배양기를 품어.
   5. 10 μM 주사 가능한 화합물 (oligomycin, 카보 시안화 메틸 -p- 플루오로 - 메 톡시 페닐 히드라 존 (FCCP)를 준비, Rotenone) 분석 배지에서.
   6. 설정 카트리지를 카트리지 순차적으로 포트에 10 μM 주 화합물의 75 μl를로드하여 : 포트 - oligomycin을; 포트 B - FCCP; 및 포트 C는 - 로테 논 (분석 중 최종 농도 1 μM 될 것입니다).
   7. 카트리지 30 분을 품어 - 37 ° C에서 1 시간을 비 CO ₂ 배양기에서.
   8. 동시에, XF 분석기를 켜고 분석 프로토콜 템플릿을 만들 수 있습니다.
   9. 카트리지를 "보정"XF 분석기로 카트리지와 유틸리티 플레이트를 삽입하고 실행합니다.
   10. 그들은 젤라틴 단백질 혼합물에 부착되어 있는지 확인하기 위해 현미경 토굴 organoids를 확인합니다.
   11. 악기와 실행 분석 프로토콜에로드 세포 배양 접시입니다.

크립트 organoids 8 개월 된 C57BL / 6 마​​우스에서 설립되었다가 영양 76A (AIN76A)의 설치류 다이어트 미국 연구소 정제 먹인. 장 토굴 organoids는 하나의 토굴 (그림 1A, 하나의 빨간색 화살표)에서 연장 된 기간 동안 문화에서 재배 할 수있다. Organoids 문화 18 ~ 20 일 (그림 1B, 빨간색 화살표)를 토굴 같은 구조를 성장. 납골당은 모든 삼주 계​​대하고 organoids 효율적으로 각각의 통과 다음 회복했다.

해마 생물 에너지 학 계측 실시간으로 문화에서 성장 세포에서 동시에 미토콘드리아 호흡과 당분의 비율을 평가할 수 있습니다. 우리는 토굴 organoid 신진 대사를 분석하기 위해이 기술을 적용. 8개월 생쥐 공급 AIN76A 정제 다이어트에서 파생 organoids, 우리는 측정 :. 1 산소 소비 속도, OCR은 그림 2a에 도시 - 빨간색 선이 토굴 organoids의 산소 소비 속도 (pmol의 / 분)를 나타내는, 파란색 일 것입니다단지 마트 리겔 (젤라틴 단백질 혼합물)와 전자 대조군 웰; 도 2b에 도시 2. 세포 외 산성화 레이트 (ECAR) - 토굴 organoids에서 세포 외 산성화 레이트 (MPH / 분)를 나타내는 적색 라인, 청색은 젤라틴 단백질 혼합물 대조군 웰이다.

그림 1 :. 오래된 C57BL / 6 마우스 8 개월에서 파생 크립트 organoids 납골당은 (A) 2 일 (B) 문화에서 18 일입니다. 규모 : 100 ㎛.

그림 2 : 8 개월 된 C57BL / 6 마우스에서 파생 된 organoids를 사용하여 생물 에너지 분석. (A) 산소 소모율 (OCR) 도시이고; (B) 세포 외 산성화 속도 (ECAR)이 표시됩니다. 설명 : 빨간색 - 지하실, 블루 - 제어, 단지 마트 리젤. 파란색 수직 막대로 표시 - - N = 3. 시약이 순차적으로 주입 다음과 같습니다 : A, oligomycin; B, 카르 보닐 시안화-P-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP); C, 로테 논.

우리는 기저 속도 측정 후, 토굴 대사가 oligomycin, 카르 보닐 시아 나이드를 첨가하여 평가 하였다. 산소 소모율 (OCR) 및 8 개월 된 마우스로부터 단리 organoids 체외로 성장 소낭의 세포 외 산성화 레이트 (ECAR)를 테스트 순차적으로 -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)와 로테 논,.

29 분 (그림 2A와 2B) - 기저 OCR 및 기초 ECAR은 0에서 기록되었다. 29 ^일 분에서 (포트)에서 oligomycin은 (모두 지하실 및 제어 우물, N = 3) 잘 각각 주입 하였다. Oligomycin는 ATP 합성 억제제이다. 이 상태 3 (인산) 호흡을 방지하기 위해 사용된다. 따라서 oligomycin 주입 인해 미토콘드리아 ATP 합성의 봉쇄, OCR 약간 저하 결과 및 소낭은 ECAR에서 증가하게 ATP 그들의 요구를 충족하도록 해당 작용으로 전환. 64 ^일 분, FCCP (이리저리에서m 포트 B)을 각 웰에 주입 하였다. FCCP는 ATP 생성 없이도 신속 에너지 소비로 이어지는 미토콘드리아 막을 통해 수소 이온 수송, 이동 이온 캐리어이다. OCR 인해 언 커플 링을 증가 ECAR은 소낭 따라서, ATP를 생성하는 당분을 이용하는 합성 젖산을 분비하여 에너지 균형을 유지 후 증가. 99 ^회 분에서 (포트 C)에서 로테 논 각 웰에 주입 하였다. 로테 논은 미토콘드리아 억제제이다. 따라서, 세 번째 주사 인해 손상된 미토콘드리아 기능 OCR 감소 주도하고 상승 ECAR 값을 유지하는 상태로 더 당분 소낭 시프트.

두 가지 결론이 있습니다 : 여러 통로를 통해 성공적으로 배양 하였다 8개월 된 마우스의 1) 토굴 organoids는; 유도는 oligomycin하는 대사 응답을 전시되어 2 개월 후를위한 문화 계대했다 2) organoids, 카르 보닐 시안화-P-trifluoromethoxyphen ylhydrazone와 로테 논. 따라서, organoids의 당분 기능은 열량 제한 마우스의 organoids이 상대적으로 영구적으로 문화 ^(12)의 서로 다른 성장과 신진 대사 표현형에 적응하고 있다는보고와 일치 문화 2 개월 후 안정적이었다.

이 프로토콜에 설명 된 실험 절차는 장 지하실의 대사 연구에 매우 중요 할 것이다. 토굴 격리를위한 프로토콜은 사토 등의 알에서 적합하다. ⁽¹⁰⁾ 분석 기술이보고되지 않은 생체 에너지를 사용하여 소장 토굴 organoid 문화에 토굴 대사 연구를위한 프로토콜을. 토굴 organoid 대사 연구는 상기 배양 배지와 같은 대사 경로를 변조 할 수있다 다른 에너지 원, 억제제 및 특정 시그널링 및 대사 경로의 활성화, 및 저산소 상태의 분석 조건에 다른 변수를 도입 확장 될 수있다.

제시 크립트 organoid 대사 연구는 상대적으로 질병 위험 및 신진 대사 표현형을 조절함으로써 위험을 줄일 수 있습니다 방법의 초기 평가를위한 유틸리티를 탐구하는 정상 및 환자 유래 된 상피 미니 용기에 적용 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 대사 분석은 질병 개발을위한 상대 위험의 가능한 평가 및 질병 상태, 생화학 및 분자 해부 및 잠재적 변조의 조기 발견을위한 새로운 전략을 소개합니다. 요약하면, 우리는 작은 intestina를 분리 상세한 프로토콜 설명L의 납골당과 문화 토굴 organoids. 또, 토굴 organoid 에너지 대사를 연구하는 세포 외 산성화 및 산소 소모 속도를 결정하기위한 organoid 배양 토굴을 사용하는 신규 한 방법을 소개한다. 생체 내 토굴 organoid 장 생물학을 이해하기위한 새로운 전략을 정의합니다 연구 프로파일 문화 대사.

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이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)에서 보조금 RO1 CA 135561, R01 CA151494, R01 CA174432 및 P3013330에 의해 지원되었다.

우리는 토굴 격리 프로토콜 개발에 소중한 의견을 미셸 휴스턴, 엘레나 Dhima 박사 안나 Velcich에게 감사의 말씀을 전합니다.

우리는 또한 직접 각각 해마 시설을 운영하는 당뇨병 교육 및 NIH P60DK20541 지원 의학의 알버트 아인슈타인 대학의 연구 센터 박사 마이클 브라운 리 박사와 슈 리앙 뒤를, 감사합니다.