Bienes Análisis Tiempo de perfil metabólico en

Pequeñas organoides las criptas intestinales cultivadas ex vivo proporcionan un sistema de cultivo de tejidos que recapitula el crecimiento de las criptas dependientes de células madre y su nicho. Hemos establecido un método para analizar el perfil metabólico en tiempo real en organoides cripta ratón primaria. Encontramos organoides mantienen propiedades fisiológicas definidas por su origen.

La mucosa del intestino delgado exhibe una arquitectura repetitivo organizada en dos estructuras fundamentales: vellosidades, que sobresalen en el lumen intestinal y compuestas de los enterocitos maduros, células caliciformes y células enteroendocrinas; y criptas, que residen proximal a la submucosa y la capa muscular, la acogida madre adultas y células progenitoras y células de Paneth madura, así como del estroma y las células inmunes del microambiente cripta. Hasta los últimos años, los estudios in vitro de intestino delgado se limitó a las líneas celulares derivadas de tumores benignos o malignos, y no representaban la fisiología del epitelio intestinal normal y la influencia del microambiente en el que residen. Aquí, se demuestra un método adaptado de Sato et al. (2009) para el cultivo de organoides de las criptas intestinales del ratón primarios derivados de ratones C57BL / 6. Además, se presenta el uso de cultivos de organoides cripta para analizar el perfil metabólico cripta en tiempo real por medidación del consumo basal de oxígeno, tasa glucolítica, la producción de ATP y la capacidad respiratoria. Organoides mantienen propiedades definidas por su origen y conservan aspectos de su adaptación metabólica se refleja en el consumo de oxígeno y las tasas de acidificación extracelular. Estudios metabólicos en tiempo real en esta cripta organoid sistema de cultivo son una poderosa herramienta para estudiar el metabolismo energético organoid cripta, y la forma en que pueden ser modulados por factores nutricionales y farmacológicos.

El cáncer colorrectal (CCR) es la tercera causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en los Estados Unidos. Cáncer de colon esporádico - es decir, que surge más tarde en la vida (> 50 años de edad) y sin factores genéticos predisponentes claras - las cuentas de ~ 80% de todos los casos, con una incidencia muy influida por los patrones de la dieta a largo plazo ^1,2. Estos tumores exhiben un cambio metabólico hacia la dependencia de la glucólisis oxidativo, conocido como el efecto Warburg, lo que puede hacer, en parte, concentraciones más altas de bloques de construcción celular y la energía disponibles (a través de glutaminolysis) para permitir y tal vez conducir altas tasas de proliferación de células tumorales ^3-5 . Estudios de cáncer de colon, así como otros cánceres gastrointestinales que incluyen cánceres pequeños intestino proporcionan información importante sobre la causa de la formación de tumores. La investigación de las diferencias metabólicas entre estados normales, pro-tumorigénicos y tumorigénicos de sistemas de órganos gastrointestinales pueden ayudar determination de riesgo relativo para el desarrollo del tumor así como la detección precoz de la neoplasia. Por otra parte, la comprensión de metabolismo bioenergético que involucra la respiración mitocondrial y la glucólisis proporcionará información fundamental en la forma en la fisiología celular, el envejecimiento y la enfermedad estado perturba la homeostasis intestinal. La utilización de la tecnología de ensayo de la bioenergética para el análisis de flujo extracelular puede evaluar las tasas de respiración mitocondrial y la glucólisis simultáneamente en las células que crecen en cultivo en tiempo real ^6,7.

Hasta hace poco, los estudios in vitro de intestino delgado se limitan a las líneas celulares derivadas de tumores benignos o malignos ^8,9 y no representan la fisiología del epitelio intestinal normal y la influencia del microambiente en el que residen. En 2009, Sato et al. ¹⁰ introdujo un sistema ex vivo la cultura a crecer en tres dimensiones del ratón (3D) organoides epiteliales intestinales, o epithElial "mini-tripas", apto para experimentales, diagnósticos y terapéuticos investigaciones ^10,11. Por otra parte, criptas aisladas de ratones restricción calórica mantienen sus propiedades de crecimiento alterados como organoides en tales culturas ^12. En comparación con las líneas celulares transformadas, culturas organoides de las criptas se pueden utilizar para generar datos fisiológicamente relevantes que presentan un mejor modelo para entender el estado in vivo.

Hemos adaptado la tecnología de análisis bioenergético para analizar el metabolismo energético de las criptas intestinales organoides. Ratón organoides criptas intestinales fueron cultivadas ex vivo para desarrollar los estudios de metabolismo energético organoides cripta presentados. La tasa de consumo de oxígeno (OCR) y el índice de acidificación extracelular (ECAR) de organoides de las criptas se midieron en ausencia y presencia de dos diferentes inhibidores metabólicos (oligomicina, rotenona) y un portador de iones (cianuro de carbonilo-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). La orga criptarespuesta metabólica noid a estos compuestos químicos se refleja con éxito a través de cambiar ECAR y valores de OCR.

Estudios bioenergéticos celulares tendrán dilucidar las interacciones recíprocas entre el estado metabólico y riesgo de enfermedad y fenotipo en el cáncer, la obesidad, la diabetes, los trastornos metabólicos y las enfermedades mitocondriales y ayudar a los métodos de detección de avance con implicaciones directas para la medicina traslacional. A continuación, describimos un protocolo detallado para aislar pequeñas criptas intestinales y de la cultura organoides cripta. Por otra parte, se introduce un nuevo método de usar las culturas organoides cripta para ensayos metabólicos.

Este estudio se realizó de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética de Experimentación Animal de la Einstein College de Medicina Albert.

1. Cripta Aislamiento y Cultura

1. El aislamiento de las criptas del intestino delgado:
   1. Aislar criptas intestinales de cualquier modelo de ratones de interés. La eutanasia a los ratones con CO ₂ seguido por dislocación cervical.
   2. Abrir el abdomen longitudinalmente y llenar el intestino delgado (SI) con solución salina tamponada con fosfato enfriada en hielo, PBS (-Ca ^2+; -Mg ²⁺⁾ con 2x antibiótico-antimicótico (anti-anti). Rápidamente aislar intestino delgado.
   3. Completamente diseccionar libre de grasa mesentérica utilizando un bisturí. Tenga cuidado de no perforar el tejido - en todo momento mantener el tejido húmedo con PBS enfriado con hielo. Abre inteStine longitudinalmente y lavar a fondo con helado de PBS.
   4. Cortar el intestino delgado en dos secciones y aplanar con una punta de algodón húmedo, suavemente raspar las vellosidades utilizando una diapositiva pre-enfriado. Lave vigorosamente en PBS enfriado con hielo varias veces.
   5. Incubar 3 min en 20 ml de 1x PBS por 3 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) /0.5 mM ditiotreitol (DTT) para la disociación no enzimática del tejido.
   6. Cortar el tejido en trozos pequeños (2-4 mm) utilizando una cuchilla de afeitar en un portaobjetos pre-enfriado. Transferir las piezas en un tubo de 50 ml que contiene 20 ml de PBS helado.
   7. Pipeta hacia arriba y abajo suavemente 10 veces con una pipeta desechable estéril de 10 ml. Deje que los fragmentos de tejido sedimentan por gravedad. Eliminar el sobrenadante con una pipeta. Repita tres veces más; asegúrese de sobrenadante es claro.
   8. Añadir 20 ml de PBS por EDTA 2 mM. Remolino e incubar a 4 ° C durante 30 minutos con agitación suave.
   9. Deje que los sedimentos del tejido y desechar el sobrenadante. Añadir 15 ml de hielo frío PBS y pipetaarriba y abajo 5x con una pipeta 10 ml. Dejar que los fragmentos de tejido de sedimentos y recoger el sobrenadante como la fracción 1 (F1). Repita la recogida de F2-F5, cada fracción mantenido separado.
   10. Añadir 15 ml de hielo PBS frío y este batido tiempo vigorosamente a mano durante 15 segundos. Recoger F6 y F7 para repetir, F8. Si las piezas de tejido comienzan a flotar, toque para ayudarles a establecerse.
   11. Inspeccionar una parte alícuota de cada fracción bajo el microscopio. Piscina aquellas fracciones que contienen criptas.
   12. Pasar las fracciones reunidas a través de un filtro de células de 70 micras de nylon, la recogida de las criptas en un tubo de 50 ml.
   13. Centrifugar a 100 xg durante 5 min a 4 ° C, se descarta el sobrenadante y resuspender el pellet en 10 ml PBS enfriado con hielo con criptas anti-anti y transferencia 2X a un tubo de 15 ml. Repita el lavado una vez más.
   14. Lavar las criptas una vez con 10 ml enfriado en hielo ADF, Advanced DMEM / F-12 (Dulbecco "s Medio Eagle Modificado / jamón" s F-12) - 2x anti-anti.
   15. Lavar las criptas una vez con 10 ml ADF - 1x anti-anti.
   16. Cuente las criptas utilizando un hemocitómetro. Ajustar el volumen de la solución cripta y transferir a un tubo de 1,5 ml para que la concentración final cuando cripta resuspendió será 100-500 criptas por 50 l de mezcla de proteína gelatinosa (Matrigel). Centrifugar a 100 xg durante 5 min a 4 ° C y volver a suspender las criptas en la mezcla de proteína gelatinosa.
   17. Placa de 50 l de cripta - suspensión gelatinosa mezcla de proteína por pocillo en una placa de 24 pocillos (área de crecimiento: 2 cm ^2), colocando cuidadosamente la caída de suspensión en el centro de cada pocillo. Mantener la placa en una CO _2, 37 ° C incubadora durante ~ 30 min hasta que la suspensión se solidifica.
   18. Añadir 500 medios de comunicación helada l de cultivo completo (Advanced DMEM / F12 con 1x anti - anti, 10 mM ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES), 1x GlutaMAX, Suplemento B27 1x, 1x N2 Suplemento, 1 mM N-acetil-L-cisteína (NAC), 50 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF), 100 ng / mlNoggin, 500 ng / ml R-Spondin).
       1. Reconstituir factores de crecimiento en 0,1% albúmina de suero bovino (BSA) en PBS.
2. Cripta organoide cultura y Pasaje:
   1. Passage organoides cripta 14-21 días después de la siembra (o cuando sea necesario) como sigue:
      1. Cambio de los medios de comunicación todos los viernes y lunes. Los miércoles, reemplace la mitad de los medios de comunicación con los medios de comunicación fresca.
   2. Retire el medio de cultivo. Lavar la muestra dos veces con 500 l de PBS a intervalos de 5 min.
   3. Retire PBS y romper suavemente la mezcla de proteína gelatinosa usando una punta micro pipeta P1000 estéril.
   4. Añadir 1 ml de medios de cultivo completa a un solo pozo y resuspender las organoides en 1 ml de medio.
   5. Interrumpir suavemente los organoides utilizando un P1000 pipeteando arriba y abajo 20-30x (comprobar bajo el microscopio para la disociación organoid adecuada con un buen rendimiento cripta hasta que una técnica consistente se desarrolla).
   6. Transfiera las criptas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml;centrifugar a 100 xg a 4 ° C, 5 min.
   7. Lavar el sedimento dos veces con 1 ml de medio de cultivo completo.
   8. Split en una proporción de 1: 3 o 1: 6, según sea necesario, criptas resuspender en 50 l de Matrigel por pocillo. Proceda como se describe anteriormente (sección 1.1.16-18).
3. Cripta de congelación organoide:
   1. Retire el medio de cultivo. Lavar la muestra en 500 l de PBS.
   2. Dispersar la mezcla de proteína gelatinosa usando una punta de pipeta P1000.
   3. Añadir 1 ml de medio a un solo pozo y resuspender las organoides en 1 ml de medio.
   4. Romper suavemente hasta los organoides utilizando un P1000 pipeteando arriba y abajo 20-30x.
   5. Transfiera los organoides a un tubo de 1,5 ml. Centrifugar a 100 xg a 4 ° C, 5 min.
   6. Lavar el sedimento dos veces con 1 ml de medio de cultivo completo.
   7. Criptas Resuspender en 500 l de congelación medios de comunicación.
   8. Criptas transferencia a un criotubo, coloque el tubo en un recipiente de congelación y almacenar en un congelador a -80ºC overnilucha.
   9. Transferencia de criptas a líquido del tanque N _2.
      1. Recuperar organoides cripta congelados descongelando rápidamente en un baño a 37 ° C. Lavar con 500 l medio completo de cultivo una vez, centrifugar a 100 xg, 5 min y resuspender en mezcla de proteína gelatinosa, y la cultura como se describe anteriormente. Para una mejor recuperación, añada inhibidor ROCA (Y-27632) a los medios de congelación.

2. Cripta organoide Metabolismo Ensayo

1. 24 y Preparación de la placa:
   1. Aislar y contar criptas de acuerdo con el protocolo (ver sección 1.1 para el aislamiento de las criptas y la sección 1.2 para el paso cripta).
   2. Criptas Resuspender en mezcla de proteína gelatinosa (100-200 criptas por 20 l).
   3. Placa-cripta gelatinosa suspensión mezcla de proteínas en una placa de 24 pocillos de ensayo (asegúrese de que hay al menos por triplicado para cada muestra) y permita que la suspensión se solidifique a 37 ° C en un CO ₂incubadora; a continuación, añadir 500 l de los medios de cultivo completo.
   4. Criptas Cultura (como se describe en la sección 1.1) y observar al microscopio hasta criptas crecen en organoides plenamente desarrollados.
2. Extracelular Ensayo de flujo:
   1. Cartucho Hidratación durante la noche en un ₂ no-CO (0% de CO _2), 37 ° C incubadora.
   2. Retire el medio de cultivo y se lava dos veces con 500 organoides l DMEM (sin: glucosa, L-glutamina, piruvato de sodio y bicarbonato de sodio; y con: rojo de fenol). Espere 5 min.
   3. Añadir 675 l por pocillo de medio de ensayo (DMEM con 2 mM L-glutamina y 5 mM de D-glucosa) a cada pocillo.
   4. Compruebe la morfología microscópica cripta organoides para asegurar que organoides y la mezcla de proteína gelatinosa están intactas después de los lavados. Incubar 1 hora en un _no-CO2, 37 ° C incubadora.
   5. Preparar 10 mM compuestos inyectables (oligomicina, cianuro de carbonilo-p-trifluoro-metoxi-fenil-hidrazona (FCCP), rotenone) en medio de ensayo.
   6. Puesta en marcha del cartucho mediante la carga de 75 l de 10 mM compuestos inyectables en los puertos de la secuencialmente cartucho: Port A - oligomicina; Puerto B - FCCP; y Port C - rotenona (Las concentraciones finales durante el ensayo será de 1 M).
   7. Incubar cartucho de 30 min - 1 hora a 37 ° C en una incubadora de _2-CO no.
   8. Al mismo tiempo, active el XF Analyzer y crear la plantilla de protocolo de ensayo.
   9. Coloque el cartucho y la placa de utilidad en el Analizador XF y ejecutar "calibrar" cartucho.
   10. Compruebe organoides cripta microscópicamente para asegurarse de que están unidos a la mezcla de proteína gelatinosa.
   11. Placa de cultivo de células de carga en protocolo de ensayo de instrumentos y de ejecución.

Organoides cripta se establecieron a partir de 8 meses de C57BL / 6 ratones alimentados con la dieta purificada roedor Instituto Americano de Nutrición 76A (AIN76A). Organoides criptas intestinales pueden ser cultivadas en cultivo durante períodos extendidos de un solo cripta (Figura 1A, sola flecha roja). Organoides surgen estructuras de cripta en 18-20 días en cultivo (Figura 1B, flechas rojas). Las criptas se pasaron cada 3 semanas y organoides recuperaron de manera eficiente después de cada pasaje.

Instrumentación bioenergética Seahorse puede evaluar las tasas de respiración mitocondrial y la glucólisis simultáneamente en las células que crecen en cultivo en tiempo real. Hemos adaptado esta tecnología para analizar el metabolismo organoid cripta. Con organoides derivados de los ratones alimentados con la dieta purificada AIN76A durante 8 meses, se midió:. 1 la tasa de consumo de oxígeno, OCR se muestra en la Figura 2A - línea roja que representa la tasa de consumo de oxígeno (pmol / min) en organoides cripta, el azul es ªpocillos de control e sólo con Matrigel (la mezcla de proteína gelatinosa); 2. tasa de acidificación extracelular (ECAR) se muestra en la Figura 2B - línea roja que representa la tasa de acidificación extracelular (MPH / min) en organoides cripta, el azul es el control de los pozos sólo con la mezcla de proteína gelatinosa.

Figura 1:. Organoides Crypt derivados de 8 meses de edad C57BL / 6 ratones criptas son 2-día (A) o (B) 18 días en cultivo. Escala: 100 m.

Figura 2: ensayo de Bioenergética utilizando organoides derivados de 8 meses de edad C57BL / 6 ratones. (A) la tasa de consumo de oxígeno (OCR) es mostrado; (B) tasa de acidificación extracelular (ECAR) se muestra. Leyenda: rojo - criptas, azul - el control, sólo Matrigel. n = 3. Reactivos inyectaron secuencialmente - indicado por las barras verticales azules - son las siguientes: A, oligomicina; B, carbonilo cianuro de p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP); C, la rotenona.

Hemos probado la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y el índice de acidificación extracelular (ECAR) de criptas aisladas a partir de 8 meses de edad los ratones y se hicieron crecer en organoides ex vivo. Después de la medición de la tasa basal, el metabolismo cripta se evaluó mediante la adición de oligomicina, cianuro de carbonilo -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) y rotenona, secuencialmente.

Basal OCR y ECAR basal se registraron 0-29 min (Figura 2A y 2B). Al ²⁹ min, oligomicina (desde el puerto A) se inyectó en cada pocillo (n = 3, para ambos criptas y los pocillos de control). Oligomicina es un inhibidor de la síntesis de ATP. Se utiliza para evitar que el estado 3 (de fosforilación) de la respiración. Por lo tanto, oligomicina inyección resultó en una ligera reducción en OCR, debido al bloqueo de la síntesis de ATP en la mitocondria, y las criptas cambió a la glucólisis para satisfacer su necesidad de ATP resulta en un aumento en ECAR. En el ^64º min, FCCP (from puerto B) se inyectó en cada pocillo. FCCP es un portador de iones móvil, el transporte de iones de hidrógeno a través de la membrana mitocondrial, lo que lleva al consumo de energía rápida sin la necesidad de la generación de ATP. OCR se incrementó debido al desacoplamiento y ECAR aumentó desde las criptas mantuvieron su balance de energía mediante el empleo de la glucólisis para generar ATP, así sintetizar y secretar ácido láctico. En el ^99º min, rotenona (desde el puerto C) se inyectó en cada pocillo. Rotenona es un inhibidor mitocondrial. Por lo tanto, la tercera inyección condujo a una disminución en OCR debido a la función mitocondrial alterada y cambió las criptas a un estado más glicolítica manteniendo los valores ECAR elevadas.

Hay dos conclusiones principales: 1) organoides cripta de 8 meses de edad ratones fueron cultivadas con éxito a través de varios pasajes; 2) organoides que se había pases en cultivo durante 2 meses después de la derivación exhibió una respuesta metabólica a oligomicina, carbonilo cianuro de p-trifluorometoxifen ilhidrazona y rotenona. Por lo tanto, la capacidad glucolítica de organoides era estable después de 2 meses en la cultura, en consonancia con el informe que organoides de ratones restricción calórica son relativamente adaptados de forma permanente para diferente crecimiento y fenotipos metabólicos en la cultura ^12.

Los procedimientos experimentales descritos en este protocolo serán de gran importancia en los estudios metabólicos de las criptas intestinales. El protocolo para el aislamiento cripta es una adaptación de Sato et al. ¹⁰ El protocolo para el estudio del metabolismo cripta en pequeños cultivos de organoides de las criptas intestinales utilizando la bioenergética tecnología de análisis no ha sido reportado. Los estudios de metabolismo de organoides las criptas se pueden extender aún más la introducción de diferentes variables a los medios de cultivo y condiciones de ensayo, tales como diferentes fuentes de energía, inhibidores y activadores de la señalización específica y vías metabólicas, y las condiciones de hipoxia que pueden modular las vías metabólicas.

Estudios de metabolismo organoide Crypt presentados pueden aplicarse a mini-tripas epiteliales normales y de pacientes derivados para explorar la utilidad para la evaluación temprana del riesgo de enfermedad relativa y enfoques que pueden modular fenotipo metabólico y por lo tanto disminuir el riesgo. Los ensayos metabólicos descritos aquí introducen nuevas estrategias para su posible evaluación del riesgo relativo de desarrollo de la enfermedad y para la detección precoz del estado de la enfermedad, su disección de bioquímica y molecular y potencial de modulación. En resumen, se describe un protocolo detallado para aislar pequeña intestinal criptas y organoides cultura cripta. Además, se introduce un nuevo método para utilizar cripta organoid cultura para la determinación de las tasas de acidificación y de consumo de oxígeno extracelular para estudiar el metabolismo energético cripta organoide. Ex vivo cripta organoid metabólica cultura de perfiles de estudios definirá nuevas estrategias para la comprensión de la biología intestinal.

No hay revelaciones.

Este estudio fue apoyado por becas SR1 CA 135561, R01 CA151494, R01 CA174432 y P3013330 de los Institutos Nacionales de Salud.

Nos gustaría dar las gracias a Michele Houston, Elena Dhima y la doctora Anna Velcich por sus valiosos comentarios en el desarrollo del protocolo de aislamiento cripta.

También agradecemos a la Formación de la Diabetes y el Centro de Investigación del Colegio Albert Einstein de Medicina apoyado por el NIH P60DK20541, y el Dr. Michael Brownlee y el Dr. Xue Liang-Du, que dirigen y operan las instalaciones de Seahorse, respectivamente.