Echtzeit-Analyse von Stoffwechselprofil in

Dünndarm Krypta Organoiden kultiviert ex vivo eine Gewebekultursystem, das Wachstum der Krypten abhängig Stammzellen und ihrer Nische rekapituliert. Wir haben eine Methode, um das metabolische Profil in Echtzeit in der primären Maus Krypta Organoiden testen. Wir fanden Organoiden aufrechtzuerhalten physiologischen Eigenschaften von ihrer Quelle definiert.

Die Dünndarmschleimhaut weist eine sich wiederholende Architektur in zwei Grundstrukturen organisiert: Zotten, in das Darmlumen vorspringende und reifer Enterozyten, Becherzellen und enteroendokrinen Zellen zusammengesetzt; und Krypten, wohnhaft proximal der Submukosa und Muskularis, Beherbergung adulten Stammzellen und Vorläuferzellen und reife Panethzellen sowie Stromazellen und Immunzellen der Krypta Mikroumgebung. Bis zu den letzten Jahren, in vitro Untersuchungen von Dünndarm wurde, um Zelllinien entweder benigne oder maligne Tumoren abgeleitet sind, und nicht die Physiologie der normalen Darm Epithelien und den Einfluss der Mikroumgebung, in dem sie sich aufhalten darstellen. Hier zeigen wir ein Verfahren von Sato et al angepasst. (2009) für die Kultivierung von primären Maus-Darm-Krypta Organoide von C57BL / 6-Mäusen abgeleitet sind. Darüber hinaus präsentieren wir die Verwendung von crypt Organoid Kulturen, um die Krypta metabolische Profil in Echtzeit von Maßnahme zu testenment der basalen Sauerstoffverbrauch, glykolytischen Rate, die ATP-Produktion und Atemkapazität. Organoiden aufrechtzuerhalten Eigenschaften durch ihre Quelle definiert und Aspekte ihrer metabolischen Anpassung durch den Sauerstoffverbrauch und die extrazelluläre Ansäuerung Raten wider behalten. Echtzeitstoffwechselstudien in dieser Krypta Organoid Kultursystem sind ein leistungsfähiges Werkzeug zur Krypta Organoid Energiestoffwechsel zu untersuchen, und wie sie durch Ernährungs- und pharmakologischen Faktoren moduliert werden.

Darmkrebs (CRC) ist die dritthäufigste Ursache der durch Krebs Todesfälle in den Vereinigten Staaten. Sporadische Darmkrebs - das heißt, dass die sich später im Leben (> 50 Jahre) und ohne klare prädisponierende genetische Faktoren - Konten für ~ 80% aller Fälle, mit Einfalls stark durch langfristige Ernährungsmuster ^1,2 beeinflusst. Diese Tumoren weisen eine metabolische Verschiebung hin Abhängigkeit oxidative Glykolyse als Warburg-Effekt bekannt, das zum Teil machen können höhere Konzentrationen der Zellbausteine ​​und Energie zur Verfügung (über Glutaminolyse) zu hohen Raten der Tumorzellproliferation ^3-5 gestatten und vielleicht fahren . Studien von Darmkrebs sowie anderen gastrointestinalen Tumoren einschließlich Dünndarm Krebsarten liefern wichtige Einblicke in die Ursache der Tumorbildung. Untersuchung der Stoffwechselunterschiede zwischen normalen, pro-tumor und tumorerzeugende Staaten von gastrointestinalen Organsysteme kann det unterstützenermination des relativen Risikos für die Tumorentwicklung sowie Früherkennung von Neoplasien. Darüber hinaus verstehen bioenergetischen Stoffwechsel mit mitochondriale Atmung und Glykolyse liefert grundlegende Einblicke in die Zellphysiologie, Altern und Krankheitszustand stört Darm Homöostase. Nutzung der Bioenergetik Assay-Technologie für extrazelluläre Flussanalyse können die Preise der mitochondrialen Atmung und Glykolyse gleichzeitig in wachsenden Zellen in Kultur in Echtzeit ^6,7 bewerten.

Bis vor kurzem wurden in vitro Untersuchungen von Dünndarmzelllinien entweder benigne oder maligne Tumoren ^8,9 abgeleitet sind und nicht die Physiologie der normalen Darm Epithelien und den Einfluss der Mikroumgebung, in dem sie sich aufhalten darstellen. Im Jahr 2009, Sato et al. ¹⁰ führte eine ex vivo Kultursystem zur dreidimensionalen (3D) Maus Darmepithelzellen Organoiden wachsen oder epithElial "Mini-Mumm", geeignet für experimentelle, diagnostische und therapeutische Untersuchungen ^10,11. Außerdem Krypten von kalorisch eingeschränkt Mäusen isoliert behalten ihre veränderte Wachstumseigenschaften wie Organoiden in solchen Kulturen ^12. Im Vergleich zu transformierten Zelllinien können Krypta organoide Kulturen verwendet, um physiologisch relevante Daten präsentiert ein weit besseres Modell für die in vivo-Zustand zu verstehen erzeugen.

Wir angepasst Bioenergetik-Analyse-Technologie, um den Energiestoffwechsel der Darm Krypta Organoiden testen. Maus Darm Krypta Organoiden kultiviert wurden ex vivo zur Krypta Organoid Energiestoffwechsel Studien vorgestellt zu entwickeln. Die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und der extrazellulären Ansäuerungsrate (ECAR) der Krypta Organoide wurden in Abwesenheit und Anwesenheit von zwei unterschiedlichen Stoffwechselinhibitoren (Oligomycin, Rotenon) und ein Ionenträger (Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) gemessen. Die Krypta organoid metabolische Reaktion auf diese chemischen Verbindungen wurden erfolgreich durch wechselnde ECAR und OCR-Werte wider.

Cellular bioenergetischen Untersuchungen werden die gegenseitigen Wechselwirkungen zwischen Stoffwechsellage und Krankheitsrisiko und Phänotyp bei Krebs, Fettleibigkeit, Diabetes, Stoffwechselstörungen und mitochondrialen Erkrankungen aufzuklären und helfen Voraus Screening-Methoden mit unmittelbaren Auswirkungen für translationale Medizin. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für kleine Darmkrypten isolieren und Kultur Krypta Organoiden. Darüber hinaus führen wir eine neuartige Methode zur Krypta Organoid Kulturen für metabolische Assays verwenden.

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Das Protokoll wurde von dem Ausschuss für die Ethik der Tierversuche des Albert Einstein College of Medicine genehmigt.

1. Crypt Isolierung und Kultur

1. Isolierung von Krypten aus dem Dünndarm:
   1. Isolieren Darmkrypten aus jedem Mausmodell von Interesse. Euthanize die Mäuse mit CO _2, gefolgt durch zervikale Dislokation.
   2. Öffnen Sie den Bauch längs und füllen den Dünndarm (SI) mit eiskaltem Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, PBS (-Ca ^2+; -Mg ²⁺⁾ mit 2x Antibiotika-Antimykotika (anti-anti). Rasch zu isolieren Dünndarm.
   3. Gründlich sezieren frei von mesenterialen Fett mit einem Skalpell. Achten Sie darauf, um das Gewebe zu perforieren - jederzeit feucht mit eiskaltem PBS halten das Gewebe. Öffnen Sie inteStine längs und gründlich mit eiskaltem PBS.
   4. Schneiden Sie Dünndarm in zwei Abschnitte und flach aus mit einem feuchten Wattestäbchen vorsichtig abkratzen Zotten mit einem vorgekühlten Rutsche. Kräftig in eiskaltem PBS mehrmals waschen.
   5. Inkubieren 3 min in 20 ml 1x PBS pro 3 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) /0.5 mM Dithiothreitol (DTT) für nicht-enzymatische Dissoziation des Gewebes.
   6. Geschnitten Gewebe in kleine Stücke (2-4 mm) mit einer Rasierklinge auf einem vorgekühlten Folie. Übertragen Sie die Stücke in einen 50-ml-Tube mit 20 ml eiskaltem PBS.
   7. Pipette nach oben und unten vorsichtig 10x mit einem 10 ml sterile Einwegpipette. Lassen Gewebefragmente zu sedimentieren durch die Schwerkraft. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Wiederholen Sie drei weitere Male; stellen Sie sicher, Überstand klar ist.
   8. 20 ml PBS pro 2 mM EDTA. Swirl und Inkubation bei 4 ° C für 30 min unter leichtem Schütteln.
   9. Lassen Gewebe Sediment und Überstand verwerfen. 15 ml eiskaltem PBS und Pipettennach oben und unten 5x mit einer 10 ml Pipette. Lassen Sie die Gewebefragmente Sediment zu sammeln und das Überstand als Fraktion 1 (F1). Wiederholen Sammeln F2-F5, jede Fraktion getrennt gehalten.
   10. 15 ml eiskaltem PBS und diesmal unter kräftigem Schütteln für 15 Sekunden. Sammeln Sie F6 und wiederholen Sie für F7, F8. Wenn Gewebestücke beginnen zu schweben, tippen, um ihnen helfen zu begleichen.
   11. Untersuchen Sie ein Aliquot jeder Fraktion unter dem Mikroskop. Pool jene Fraktionen, die Krypten.
   12. Übergeben Sie die gesammelten Fraktionen durch einen 70 & mgr; m Nylon Zellsieb, Sammeln Krypten in einem 50-ml-Tube.
   13. Zentrifuge bei 100 xg für 5 min bei 4 ° C, den Überstand verwerfen und Pellet in 10 ml eiskaltem PBS mit 2x Anti-Anti und Transfer Krypten in ein 15-ml-Tube. Wiederholen Sie den Wasch noch einmal.
   14. 2x Anti-Anti - einmal mit 10 ml eiskaltem ADF, Advanced DMEM / F-12 (Dulbecco "s Modified Eagle Medium / Ham" s F-12) Waschen Sie die Krypten.
   15. Waschen Sie die Krypten einmal mit 10 ml ADF - 1x Anti-Anti.
   16. Zählen Sie die Krypten mit einer Zählkammer. Passen Sie die Krypta Lösungsvolumen und Transfer zu einem 1,5-ml-Röhrchen, so dass die endgültige Krypta Konzentration bei resuspendiert wird 100-500 Krypten pro 50 ul gallertartige Proteinmischung (Matrigel) sein. Zentrifuge bei 100 × g für 5 min bei 4 ° C und resuspendieren Krypten im gelartigen Proteingemisch.
   17. Platte 50 ul Krypta - gallertartig Proteingemisch Suspension pro Vertiefung in einer 24-Well-Platte (Wachstumsbereich: 2 cm ^2), sorgfältig Platzierung der Aufhängungseinbruch in der Mitte jeder Vertiefung. Pflegen Sie die Platte in einem CO _2, 37 ° C Inkubator für ~ 30 min, bis die Suspension verfestigt.
   18. In 500 ul eiskaltem komplette Kulturmedien (Advanced DMEM / F12 mit 1x Anti - Anti, 10 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), 1x GlutaMAX, 1x B27 Supplement, 1x N2 Supplement, 1 mM N-Acetyl-L-Cystein (NAC), 50 ng / ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), 100 ng / mlNoggin, 500 ng / ml R-Spondin).
       1. Rekonstitution Wachstumsfaktoren in 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS.
2. Crypt Organoide Kultur und Passage:
   1. Passage Krypta Organoiden 14-21 Tage nach der Aussaat (oder nach Bedarf) wie folgt:
      1. Ändern Medien jeden Freitag und Montag. Mittwochs, ersetzen die Hälfte der Medien mit frischem Medium.
   2. Entfernen Sie das Kulturmedium. Die Probe zweimal Waschen mit 500 ul PBS bei 5-Minuten-Intervallen.
   3. Entfernen PBS und sanft brechen die gallertartige Proteinmischung mit einem sterilen P1000 Mikropipettenspitze.
   4. 1 ml komplettes Kulturmedien auf ein einziges gut und resuspendieren Organoiden in 1 ml Medium.
   5. Sanft stören die Organoiden mit einem P1000 durch Auf- und Abpipettieren 20-30x (Check unter dem Mikroskop für die ordnungsgemäße Organoid Dissoziation mit einer guten Ausbeute Krypta bis eine einheitliche Technik wird entwickelt).
   6. Übertragen Sie die Krypten in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen;Zentrifuge bei 100 × g bei 4 ° C, 5 min.
   7. Zweimal Waschen des Pellets mit 1 ml komplettem Kulturmedien.
   8. Split in einem Verhältnis von 1: 3 oder 1: 6 wie erforderlich, Resuspendieren Krypten in 50 & mgr; l Matrigel pro Vertiefung. Gehen Sie wie oben (Abschnitt 1.1.16-18) beschrieben.
3. Crypt Organoide Freezing:
   1. Entfernen Sie das Kulturmedium. Die Probe in 500 ul PBS waschen.
   2. Verteilen das gallertartige Proteinmischung mit einem P1000 Pipettenspitze.
   3. 1 ml Medium auf ein einziges gut und resuspendieren Organoiden in 1 ml Medium.
   4. Vorsichtig brechen die Organoiden mit einem P1000 durch Auf- und Abpipettieren 20-30x.
   5. Übertragen Sie die Organoiden in ein 1,5-ml-Röhrchen. Zentrifuge bei 100 × g bei 4 ° C, 5 min.
   6. Zweimal Waschen des Pellets mit 1 ml komplettem Kulturmedien.
   7. Resuspendieren Krypten in 500 ul gefrierenden Medien.
   8. Transfer Krypten zu einem Kryoröhrchen, den Schlauch in einem Gefrierbehälter und Speicher in einem -80 ° C Gefrierschrank overnight.
   9. Übertragen Krypten zu flüssigem N ₂ Tank.
      1. Recover gefrorenen Krypta Organoiden durch schnelles Auftauen in einem 37 ° C Wasserbad. Waschen mit 500 ul komplettem Kulturmedium einmal, Zentrifuge bei 100 × g, 5 min und resuspendieren in gelatinösen Proteingemisch, und die Kultur wie oben beschrieben. Für bessere Erholung, fügen ROCK-Inhibitor (Y-27632) mit dem gefrierenden Medien.

2. Crypt Organoide Stoffwechsel Assay

1. 24-Well-Platte Zubereitung:
   1. Isolieren und zählen Krypten nach dem Protokoll (siehe Abschnitt 1.1 für crypt Isolation und Abschnitt 1.2 für crypt Durchgang).
   2. Resuspendieren Krypten in gallertartigen Proteinmischung (100-200 Krypten pro 20 ul).
   3. Platte Krypta-gallertartige Proteingemisch Suspension in einem 24-Well-Assayplatte (stellen Sie sicher, es gibt mindestens dreifacher Ausführung für jede Probe) und lassen Sie die Suspension bei 37 ° C in einem CO ₂ zu verfestigenInkubator; fügen Sie dann 500 ul komplette Kulturmedien.
   4. Kultur Krypten (wie in Abschnitt 1.1 beschrieben) und beobachten unter dem Mikroskop bis Krypten in voll entwickelten Organoiden wachsen.
2. Extracellular Flux Assay:
   1. Hydrat Patrone über Nacht in einem Nicht-CO ₂ (0% CO _2), 37 ° C Inkubator.
   2. Entfernen des Kulturmediums und waschen Organoiden zweimal mit 500 & mgr; l DMEM (ohne: Glucose, L-Glutamin, Natriumpyruvat und Natriumbicarbonat, und mit: Phenolrot). Warten Sie 5 min.
   3. Gib 675 & mgr; l pro Vertiefung Testmedium (DMEM mit 2 mM L-Glutamin und 5 mM D-Glucose) in jede Vertiefung.
   4. Überprüfen Krypta Organoiden mikroskopische Morphologie, um sicherzustellen, dass Organoiden und die gallertartige Proteinmischung intakt nach den Wäschen sind. Inkubieren für 1 Stunde in einer nicht-CO _2, 37 ° C Inkubator.
   5. Herstellung von 10 & mgr; M injizierbaren Verbindungen (Oligomycin, Carbonylcyanid-p-Trifluor-methoxy-phenyl-Hydrazon (FCCP), rotenone) in Testmedium.
   6. Set-up die Patrone durch das Laden 75 ul 10 uM injizierbaren Verbindungen in die Häfen der Kartusche nacheinander: Port A - Oligomycin; Port B - FCCP; und Port C - Rotenon (Die Endkonzentrationen während des Assays wird 1 & mgr; M).
   7. Inkubieren Kassette 30 min - 1 h bei 37 ° C in einer nicht-CO ₂ -Inkubator.
   8. Gleichzeitig schalten Sie den XF Analyzer und erstellen Sie die Assay-Protokoll-Vorlage.
   9. Zeigen Patrone und Gebrauchsplatte in XF Analyzer und führen Sie "Kalibrieren" Patrone.
   10. Überprüfen Krypta Organoiden mikroskopisch sicherstellen, dass sie auf die gallertartige Proteingemisch gebunden sind.
   11. Lastzellkulturplatte in Instrument und führen Testprotokoll.

Crypt Organoiden wurden 8 Monate alten C57BL / 6-Mäusen etabliert gereinigt Nagerfutter American Institute of Nutrition 76A (AIN76A). Intestinale Krypta Organoiden können in Kultur über einen längeren Zeitraum von einem einzigen crypt (1A, einzelne rote Pfeil) angebaut werden. Organoiden wachsen aus Krypta-ähnliche Strukturen in 18-20 Tagen in Kultur (1B, rote Pfeile). Krypten wurden alle 3 Wochen agiert und Organoiden effizient nach jedem Durchgang gewonnen.

Seahorse Bioenergetik Instrumentierung kann Raten mitochondriale Atmung und Glykolyse gleichzeitig in Zellen, die in Kultur und in Echtzeit zu bewerten. Wir passten diese Technologie zur Krypta Organoid Stoffwechsel untersuchen. Mit Organoiden von Mäusen gefüttert AIN76A gereinigt Ernährung für 8 Monate abgeleitet messen wir:. 1 Sauerstoffverbrauchsrate, in 2A gezeigt OCR - rote Linie repräsentiert Sauerstoffverbrauchsrate (pmol / min) in Krypta Organoiden, ist blau the Kontrollvertiefungen nur mit Matrigel (die gallertartige Proteinmischung); 2. extrazellulären Ansäuerungsrate (ECAR) in 2B gezeigt - rote Linie repräsentiert extrazellulären Ansäuerungsrate (mph / min) in Krypta Organoiden, Blau ist die Kontrollvertiefungen nur mit dem gallertartigen Proteingemisch.

Abb. 1: Crypt Organoiden von 8-Monats-abgeleiteten alten C57BL / 6-Mäuse Krypten sind (A) 2-Tage oder (B) 18-Tagen in Kultur. Maßstab: 100 & mgr; m.

Figur 2: Bioenergetics Assay unter Verwendung von Organoiden 8 Monate alte C57BL / 6-Mäusen abgeleitet sind. (A) Die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) ist gezeigt; (B) extrazelluläre Ansäuerung Rate (ECAR) gezeigt. Legende: rot - Krypten, blau - Steuer nur Matrigel. n = 3. Reagenzien injiziert nacheinander - von den blauen vertikalen Balken angezeigt - sind wie folgt: A, Oligomycin; B, Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP); C, Rotenon.

Wir testeten die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und die extrazelluläre Ansäuerung Rate (ECAR) der Krypten von 8 Monate alten Mäusen isoliert und in Organoiden ex vivo gewachsen. Nach Messung der Basalrate wurde Krypta Stoffwechsel durch Zugabe Oligomycin, Carbonylcyanid bewertet -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) und Rotenon, nacheinander.

29 min (2A und 2B) - basale OCR und basalen ECAR wurden aus 0 aufgezeichnet. Am ^29. min, Oligomycin (von Port A) wurde in jedes Well (3 n =, für beide Krypten und Kontrollvertiefungen) injiziert. Oligomycin ist ein ATP-Synthese-Hemmer. Es wird verwendet, um den Zustand 3 (phosphorylierenden) Atmung verhindern. Somit führte oligomycin Injektion in einer leichten Verringerung in OCR aufgrund Blockade der ATP-Synthese in Mitochondrien und die Krypten geschaltet Glykolyse ihrer Anforderung für ATP was zu einem Anstieg in ECAR erfüllen. Am ^64. min, FCCP (from Anschluss B) wurde in jede Vertiefung eingespritzt. FCCP ist eine mobile Ionenträger, Transport von Wasserstoffionen durch die Membran der Mitochondrien, was zu einer schnellen Energieverbrauch ohne ATP-Generation. OCR stiegen aufgrund Entkopplung und ECAR erhöht, da die Krypten ihre Energiebilanz aufrechterhalten durch den Einsatz von Glykolyse ATP zu erzeugen, damit die Synthese und Sekretion von Milchsäure. Am ^99. min wurde Rotenon (von Port C) in jedes Well injiziert. Rotenon ist ein mitochondrialen Inhibitor. So führte die dritte Injektion zu einer Abnahme der OCR aufgrund eingeschränkter Funktion der Mitochondrien und verschoben die Krypten zu einer glykolytischen Zustand halten die ECAR Werte erhöht.

Es gibt zwei Hauptschlussfolgerungen: 1) Krypta Organoiden von 8 Monate alten Mäusen wurden erfolgreich durch mehrere Passagen kultiviert; 2) Organoide, die in Kultur für 2 Monate agiert worden waren, nachdem die Ableitung zeigte eine metabolische Reaktion auf Oligomycin, Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxyphen ylhydrazone und Rotenon. Somit wird die Fähigkeit des glykolytischen Organoiden war nach 2 Monaten in Kultur, die mit dem Bericht, dass Organoide von kalorisch beschränkten Mäusen relativ dauerhaft auf verschiedene Wachstums- und Stoffwechsel Phänotypen in Kultur ¹² angepaßt stabil.

Die in diesem Protokoll beschriebenen experimentellen Verfahren von großer Bedeutung in metabolischen Studien von Darmkrypten sein. Das Protokoll für die Isolierung von Krypta Sato et al angepasst. ¹⁰ Das Protokoll zur Untersuchung der Krypta Stoffwechsel in Dünndarm Krypta organoide Kulturen mit bioenergetischen Analysetechnik wurde nicht berichtet. Die Krypta Organoid Metabolismus-Untersuchungen kann verlängert werden weitere Einführung verschiedener Variablen auf die Kulturmedien und Testbedingungen, wie beispielsweise unterschiedliche Energiequellen, Inhibitoren und Aktivatoren der spezifischen Signal- und Stoffwechselwege und hypoxischen Bedingungen, die Stoffwechselwege modulieren kann.

Crypt Organoid Metabolismusstudien präsentiert werden, um normale und Patienten gewonnen epithelialen Mini-Mumm aufgebracht, um das Dienstprogramm für die frühe Beurteilung der relativen Krankheitsrisikos sowie Ansätze, die metabolischen Phänotyp zu modulieren und damit verringern Risiko kann zu erkunden. Die hier beschriebenen Stoffwechseltests einzuführen, neue Strategien für eine mögliche Bewertung des relativen Risikos für die Entwicklung der Krankheit und zur Früherkennung von Krankheitszustand, seine biochemischen und molekularen Dissektion und Potentialmodulation. Zusammenfassend, kleine intestina isolieren beschreiben wir ein detailliertes Protokolll Krypten und Kultur Krypta Organoiden. Darüber hinaus führen wir eine neuartige Methode zur Krypta Organoid Kultur zur Bestimmung der extrazellulären Übersäuerung und Sauerstoffverbrauch Kurse Krypta Organoid Energiestoffwechsel zu untersuchen verwenden. Ex vivo Krypta Organoid Kultur Metabolic Profiling Studien werden neue Strategien für das Verständnis Darm Biologie definieren.

Es sind keine Angaben.

Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse RO1 CA 135.561, R01 CA151494, R01 CA174432 und P3013330 von den National Institutes of Health.

Wir möchten Michele Houston, Elena Dhima und Dr. Anna Velcich für ihre wertvollen Kommentare bei der Entwicklung der Krypta Isolierungsprotokoll danken.

Wir danken auch den Diabetes-Schulungen und Forschungszentrum in der Albert Einstein College of Medicine vom NIH P60DK20541 unterstützt, und Dr. Michael Brownlee und Dr. Xue-G. Richter, der direkt und Betrieb der Seahorse Anlage verbunden.