における代謝プロファイルのリアルタイム分析

小腸の陰窩オルガノイド培養ex vivoで幹細胞およびそれらのニッチに依存する陰窩の成長を再現する組織培養系を提供する。私たちは、初代マウス陰窩オルガノイドリアルタイムで代謝プロフィールをアッセイする方法を確立した。私たちは、オルガノイドは、それらのソースで定義された生理学的特性を維持した。

腸管腔に突出し、絨毛および成熟した腸細胞、杯細胞および腸内分泌細胞から成る;小腸粘膜は、2つの基本的な構造に編成され、繰り返しのアーキテクチャを示し、及び陰窩、粘膜下層および筋の近位に常駐成体幹細胞および前駆細胞を保有し、パネート細胞成熟、ならびに間質および陰微小環境の免疫細胞。ここ数年までは、小腸のin vitro試験で 、良性または悪性のいずれかで腫瘍に由来する細胞株に限定されていた、と正常な腸上皮の生理学および、それらが存在する微小環境の影響を表すものではありませんでした。ここでは、佐藤らから適応する方法を実証している。（2009）C57BL / 6マウス由来の初代マウス腸陰窩オルガノイドを培養する。さらに、メジャーによってリアルタイムに陰窩代謝プロファイルをアッセイする陰窩オルガノイド培養物の使用を提供する基礎酸素消費、解糖率、ATP産生および呼吸容量のメント。オルガノイドは、それらのソースで定義された特性を維持し、酸素消費量と細胞外酸性化率で反射されたそれらの代謝適応の側面を保持している。この陰窩オルガノイド培養系におけるリアルタイム代謝研究は、陰窩オルガノイドエネルギー代謝を研究するための強力なツールであり、それは、栄養および薬理学的因子によって調節することができる方法。

結腸直腸癌（CRC）は、米国における癌関連死亡原因の第3位である。それが人生の後半で生じたすなわち （> 50歳）と、明確な素因遺伝因子を持つ- -散発大腸癌強く、長期的食事パターン^1,2の影響を受けて発生率が全症例の〜80％ ​​を占め、。これらの腫瘍は、腫瘍細胞増殖^3-5の高率を可能にし、おそらく駆動するために部分的に（グルタミノリシスを介して）利用可能な細胞のビルディングブロックとエネルギーのより高い濃度を行うことがワールブルク効果として知られている酸化的解糖への依存性に向けた代謝シフトを呈する。小腸癌を含む大腸癌の研究、ならびに他の胃腸癌は、腫瘍形成の原因に重要な洞察を提供する。 DETのを支援することができる胃腸器官系の、通常のプロ腫瘍形成及び腫瘍形成状態間の代謝の違いを調査腫瘍発生の相対リスクだけでなく、新生物の早期発見のermination。また、ミトコンドリア呼吸と解糖が関与する生体エネルギー代謝を理解することは、細胞生理学、老化や病気の状態が腸の恒常性を乱す方法に根本的な洞察を提供します。細胞外フラックス解析のための生体エネルギーアッセイ技術の利用は、リアルタイムで^6,7、培養中で増殖する細胞で同時にミトコンドリアの呼吸と解糖の速度を評価することができます。

最近まで、小腸のin vitro試験で ^8,9良性または悪性のいずれかの腫瘍由来の細胞株に限定されていましたし、正常な腸上皮の生理学および、それらが存在する微小環境の影響を表すものではありませんでした。 2009年には、佐藤らは ^、10は、3次元（3D）マウス腸管上皮オルガノイド、またはepithを成長させるex vivoで培養システムを導入、実験的な診断および治療 ​​の研究^10,11に適しelial「ミニ根性」、。また、カロリー制限されたマウスから単離された陰窩は、このような培養物¹²におけるオルガノイドとしての改変された成長特性を維持する。形質転換細胞株と比較して、陰窩オルガノイド培養物は、 インビボでの状態を理解することがはるかに優れたモデルを提示し、生理学的に関連するデータを生成するために使用することができる。

我々は、腸陰窩オルガノイドのエネルギー代謝をアッセイするために生体エネルギー分析技術に適合。マウス腸の陰窩オルガノイドは、提示さ陰窩オルガノイドエネルギー代謝研究を開発するためにex vivoで培養した。陰窩オルガノイドの酸素消費速度（OCR）および細胞外酸性化率（ECAR）の非存在下および存在下つの異なる代謝阻害剤（オリゴマイシン、ロテノン）のイオンキャリア（カルボニルシアニド-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン）で測定した。陰窩orgaがこれらの化学化合物へのNOID代謝反応が正常に変化ECARとOCRの値を通して反映された。

セルラー生体エネルギー研究は、癌、肥満、糖尿病、代謝性疾患およびミトコンドリア病で代謝状態および疾患リスクと表現型の間の相互の相互作用を解明および翻訳医学のための直接的な意味合いを持つ事前スクリーニング方法を助ける。ここでは、小腸陰窩を分離し、培養陰窩オルガノイドにするための詳細なプロトコルを記述します。また、我々は、代謝アッセイのためのcryptオルガノイドの文化を使用するための新規な方法をご紹介します。

この研究は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針の推奨に従って行った。プロトコルは、アルベルト·アインシュタイン医学校の動物実験の倫理委員会によって承認された。

1.陰窩単離および培養

1. 小腸から陰窩の単離：
   1. 関心のある任意のマウスモデルから腸陰窩を分離します。頸椎脱臼に続いてCO ₂を持つマウスを安楽死させる。
   2. 縦方向に腹部を開き、氷冷リン酸緩衝生理食塩水、PBS（-Ca ²⁺ -Mg ^2+）と小腸（SI）を埋める2倍の抗生物質-抗真菌（抗抗）で。急速に小腸を分離します。
   3. 徹底的にメスを用いて腸間膜脂肪の自由な解剖。組織を穿孔しないように注意してください - すべての回での氷冷PBSで湿った組織を保つ。 INTEを開く縦方向スタイン、氷冷PBSで徹底的に洗浄してください。
   4. 予冷されたスライドを使用して絨毛を掻き優しく、2セクションに小腸をカットし、湿った綿棒を使って平ら。氷冷PBS数回激しく洗う。
   5. 3mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）当たり20ミリリットル1×PBS中で3分間インキュベート/0.5 mMのは、組織の非酵素的解離のためにジチオスレイトール（DTT）。
   6. 予冷されたスライド上のカミソリの刃を使用して小片（2-4 mm）の中に組織を切断。 20ミリリットルの氷冷PBSを含む50ミリリットルチューブに作品を転送します。
   7. ピペットは、上下優しく10xの10ミリリットルの無菌の使い捨てピペットを用いて。組織片が重力によって沈降してみましょう。ピペットで上清を取り除きます。さらに3回繰り返します。上清が透明であることを確認してください。
   8. 2mMのEDTAあたり20mlのPBSを追加します。スワールとは穏やかに揺らしながら30分間、4℃でインキュベートする。
   9. 組織土砂を聞かせて、上清を捨てる。 15ミリリットルの氷冷PBSおよびピペットを追加上下5倍10ミリリットルピペットで。組織片が堆積しましょう​​と画分1（F1）として上清を収集します。 F2-F5キーを収集を繰り返し、各分画を別々に維持した。
   10. 15ミリリットルの氷冷PBSと、この時間は15秒間手で激しく振る追加。 F6キーを収集し、F7、F8のために繰り返します。組織片が浮いて起動した場合、彼らが定住を支援するをタップします。
   11. 顕微鏡下で各画分のアリコートを点検。陰窩を含む画分をプールする。
   12. 50ミリリットルチューブに陰窩を集め、70μmのナイロン細胞ストレーナーを通してプールした画分を渡します。
   13. 4℃で5分間100×gで遠心し、15mlチューブに2X抗抗転送陰窩と10ミリリットルの氷冷PBSに上清を再懸濁ペレットを捨てる。洗浄をもう一度繰り返します。
   14. 2X抗 - 抗 - 10ミリリットルの氷冷ADF、アドバンストDMEM / F-12（ダルベッコ "sは改変イーグル培地/ハム" S F-12）で一度陰窩を洗ってください。
   15. 10ミリリットルAで一回陰窩を洗うDFは - 抗 - 抗1倍。
   16. 血球計数器を用い陰窩を数える。陰窩溶液量を調整し、再懸濁させ、最終的な暗号濃度はゼラチン状タンパク質混合物（マトリゲル）を50μlあたり100〜500陰窩になるよう1.5mlチューブに移す。ゼラチン状のタンパク質混合物中で4℃、再懸濁陰窩で5分間100×gで遠心。
   17. 陰窩のプレートに50μl - 24ウェルプレート中でウェルあたりゼラチン状のタンパク質混合懸濁液（成長分野：2 cm ^2）を 、慎重に各ウェルの中央にサスペンションの低下を置く。 CO ₂に懸濁液が固化〜30分まで、37℃のインキュベーターをプレートを維持する。
   18. 抗、10 mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、1xのグルタMAX、1X B27サプリメント、1×N2サプリメント、1 mMの - 500μlの氷冷完全培養培地（1×抗による高度なDMEM / F12を追加N-アセチル-L-システイン（NAC）、50ng / mlの上皮増殖因子（EGF）、100ng / mlのノギン、500 / mlのRスポンジン）。
       1. PBS中の0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）中で増殖因子を再構成する。
2. 陰窩オルガノイド文化とパッセージ：
   1. 通過陰窩オルガノイド14-21日後に播種（または必要に応じて）次のように：
      1. 変化媒体毎週金曜日と月曜日。水曜、新鮮な培地で半分メディアを交換。
   2. 培養液を除去します。 5分間隔で500μlのPBSで2回サンプルを洗ってください。
   3. PBSを外し、静かに滅菌P1000マイクロピペットチップを使用したゲル状のタンパク質混合物を壊す。
   4. 単一のウェルに1ミリリットルの完全培養培地を追加し、1ミリリットルのメディアにおけるオルガノイドを懸濁します。
   5. 優しく（一貫性のある技術が開発されるまでの良い暗号収量との適切なオルガノイド解離のために顕微鏡下で確認してください）​​にピペッティングによって20-30xダウンP1000を使用してオルガノイドを混乱させる。
   6. 1.5ミリリットルマイクロチューブへ陰窩を移す。4℃、5分で100×gで遠心する。
   7. 1ミリリットルの完全培養培地で二回ペレットを洗浄。
   8. 3または1：1の割合で分割6必要に応じて、ウェルあたり50μlのマトリゲルにおける陰窩を再懸濁する。 （ セクション1.1.16-18）、上述のように実行します。
3. 墓所オルガノイド凍結：
   1. 培養液を除去します。 500μlのPBSにサンプルを洗ってください。
   2. P1000のピペットチップを用いてゲル状のタンパク質混合物を分散させる。
   3. 単一のウェルに1ミリリットルのメディアを追加し、1ミリリットルのメディアにおけるオルガノイドを懸濁します。
   4. 優しく上下20-30xピペッティングすることによりP1000を使用してオルガノイドを破る。
   5. 1.5ミリリットルチューブにオルガノイドを転送します。 4℃、5分で100×gで遠心。
   6. 1ミリリットルの完全培養培地で二回ペレットを洗浄。
   7. メディアを凍結500μlの中で再懸濁陰窩。
   8. クライオチューブへの転送陰窩は、-80℃の冷凍庫overniに冷凍コンテナとストア内チューブを配置GHT。
   9. 液体N ₂タンクに陰窩を転送します。
      1. 急速に37℃の水浴中で解凍し凍結した陰窩オルガノイドを回復します。前述のように100×gで、ゼラチン状のタンパク質混合物中で5分間再懸濁し、文化で500μlの完全培養ワンスメディア、遠心分離機を洗ってください。より良い回復のために、凍結メディアにROCK阻害剤（Y-27632）を追加します。

2.クリプトオルガノイド代謝アッセイ

1. 24ウェルプレートの調製：
   1. （陰窩通過のためのcrypt分離およびセクション1.2のためのセクション1.1を参照）のプロトコルに従って陰窩を隔離してカウントされます。
   2. ゼラチン状のタンパク質混合物中の再懸濁陰窩（20μLあたり100-200陰窩）。
   3. 24ウェルアッセイプレートにおけるプレートのcrypt-ゼラチン状タンパク質混合懸濁液（各サンプルについて少なくとも三連であることを確認してください）とサスペンションは、CO _2、37℃で固化することができますインキュベーター。その後500μlの完全な培養培地を追加します。
   4. 文化陰窩（ セクション1.1で説明したように）と陰窩は完全に開発オルガノイドへと成長するまで、顕微鏡下で観察する。
2. 細胞外フラックスアッセイ：
   1. 一晩非CO ₂水和物カートリッジ（0％CO _2）、37℃のインキュベーター。
   2. 培地を除去し、500μlのDMEMで二回オルガノイドを洗浄（なし：グルコース、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム及び重炭酸ナトリウム;及び付き：フェノールレッド）。 5分待ちます。
   3. 各ウェルにウェルのアッセイ培地（2 mM L-グルタミンおよび5mM D-グルコースを含むDMEM）あたり675μlを添加する。
   4. オルガノイドとゼラチン状のタンパク質混合物は、洗浄の後に無傷であることを確実にするために、陰窩オルガノイド微視的形態を確認してください。非CO _2、37℃のインキュベーター内で1時間インキュベートする。
   5. 10μMの注射可能な化合物（オリゴマイシン、カルボニルシアニド-Pトリフルオロメトキシフェニル - ヒドラゾン（FCCP）を準備し、Rotenone）アッセイ培地中。
   6. セットアップカートリッジをカートリッジ順次ポートに10μMの75μlの注入可能な化合物をロードすることによって：ポートA - オリゴマイシン。ポートB - FCCP。そしてポートC - ロテノン（アッセイ中の最終濃度は、1μMとなります）。
   7. カートリッジ30分間インキュベートする- 37℃で1時間、非CO ₂インキュベーター中。
   8. 同時に、XFア​​ナライザをオンにし、アッセイプロトコルテンプレートを作成します。
   9. XFアナライザーにカートリッジとユーティリティプレートを置き、カートリッジを「キャリブレーション」を実行します。
   10. 彼らはゼラチン状のタンパク質混合物に添付されていることを確認するために顕微鏡的に陰窩オルガノイドを確認してください。
   11. 計器および実行アッセイプロトコルにロード細胞培養プレート。

墓所オルガノイドは、8ヶ月齢のC57BL / 6マウスから樹立し、栄養76A（AIN76A）の齧歯類ダイエットアメリカの協会で精製供給した。腸の陰窩オルガノイドは、単一のcrypt（ 図1A、シングル赤矢印）から長期間培養で増殖させることができる。オルガノイド培養物（ 図1B、赤い矢印）で18-20日で暗号のような構造を成長させる。陰窩は3週間毎に継代し、オルガノイドを効率的に各継代後に回収。

タツノオトシゴ生体エネルギーの計装は、リアルタイムで培養中の増殖する細胞で同時にミトコンドリアの呼吸と解糖の速度を評価することができます。私たちは、陰窩オルガノイド代謝を検定するためにこの技術を適応。 8ヶ月間AIN76A精製飼料を与えたマウスから誘導されたオルガノイドで、我々は測定された：1酸素消費速度を、OCRは、 図2Aに示さ-陰窩オルガノイドの酸素消費速度（モル/分）を表す赤線、青目である唯一のマトリゲル（ゼラチン状タンパク質混合物）を含む電子制御ウェル。 図2Bに示す。2.細胞外酸性化率（ECAR） -陰窩オルガノイドにおける細胞外酸性化速度（MPH /分）を表す赤線、青は、ゼラチン状タンパク質混合物との対照ウェルである。

図1：8ヶ月齢のC57BL / 6マウス由来のクリプトオルガノイド陰窩は、培養物中の（A）2日または（B）が 18日間である。スケール：100μmである。

図2：8ヶ月齢のC57BL / 6マウス由来のオルガノイドを用いた生体エネルギーアッセイ。 （A）酸素消費率（OCR）が示されている。 （B）は、細胞外酸性化速度（ECAR）が示されている。凡例：赤 - 陰窩、青 - 制御、唯一マトリゲル。青い縦棒で示された - - のn = 3の試薬を順次注入し、以下の通りである：A、オリゴマイシン。 B、​​カルボニルシアニド-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（FCCP）; C、ロテノン。

我々は、カルボニルシアニド、基礎速度の測定後、陰窩代謝オリゴマイシンを添加することにより評価した。ex vivoで 8ヶ月齢のマウスから単離した陰窩の酸素消費速度（OCR）および細胞外酸性化率（ECAR）を試験し、オルガノイドに成長順次-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone（FCCP）およびロテノン、。

29分（ 図2Aおよび2B） - OCR基底および基底ECAR 0から記録した。 ²⁹日分で、（ポートAからの）オリゴマイシンは、（陰窩および対照ウェルの両方について、n = 3）を各ウェルに注入した。オリゴマイシンは、ATP合成阻害剤である。これは、状態3（リン）呼吸を防ぐために使用されます。従って、オリゴマイシンの注射は、ミトコンドリアにおけるATP合成の遮断に、OCRのわずかな低下をもたらし、かつ陰窩はECARの増加をもたらすATPのためのそれらの要件を満たす解糖に切り替える。 64 ^番目の分、FCCP（あちこちでmのポートB）を各ウェルに注入した。 FCCPは、ATPの生成を必要とすることなく、迅速なエネルギー消費につながる、ミトコンドリア膜を横切って水素イオンを輸送する、移動イオンキャリアである。 OCRは、脱共役に上昇させ、陰窩は、このように、乳酸を合成し、分泌する、ATP​​を生成するために、解糖を使用することによって、それらのエネルギーバランスを維持しているのでECARが増加した。 99 ^番目の分で、（ポートCから）ロテノンを各ウェルに注入した。ロテノンは、ミトコンドリア阻害剤である。従って、第3の注射が原因損なわミトコンドリア機能に、OCRの減少につながったと上昇ECAR値を維持し、より解糖の状態に陰窩を移した。

二つの主な結論がある：1）8ヶ月齢のマウスからの陰窩オルガノイドは、複数の通路を通って首尾よく培養した。導出はオリゴマイシンに対する代謝反応を示した後、2ヶ月間培養液中で継代されていた2）オルガノイド、カルボニルシアニド-P-trifluoromethoxyphen ylhydrazoneとロテノン。したがって、オルガノイドの解糖能力が制限されたカロリーのマウスからのオルガノイドを比較的恒久的文化¹²の異なる成長と代謝表現型に適応していることの報告と一致して、培養中の2ヶ月後に安定していた。

このプロトコールに記載された実験手順は、腸管陰窩の代謝研究において非常に重要であろう。陰窩を単離するためのプロトコルは、佐藤らに適合されている^。10生体エネルギー分析技術を用いて、小腸腺窩オルガノイド培養物中の陰窩の代謝を研究するためのプロトコルが報告されていない。代謝研究は、さらに代謝経路を調節し得るような異なるエネルギー源、特定のシグナル伝達および代謝経路の阻害剤および活性化剤、および低酸素条件の培養培地およびアッセイ条件の異なる変数を導入することに拡張することができるオルガノイド陰窩。

提示陰窩オルガノイド代謝試験は、代謝表現型を調節し、これによりリスクを減少させることができ、相対疾患リスクとのアプローチの早期評価のための有用性を探求する上皮ミニ根性由来の正常および患者に適用することができます。ここで説明する代謝アッセイは疾患発症の相対リスクの可能性を評価するため、および疾患状態、その生化学的および分子解剖と潜在的な変調の早期発見のための新しい戦略をご紹介します。要約すると、我々は、小さなintestinaを単離するための詳細なプロトコールを説明リットル陰窩および培養陰窩オルガノイド。加えて、我々は、陰窩オルガノイドエネルギー代謝を研究するために、細胞外酸性化および酸素消費速度を決定するためのオルガノイド文化のcryptを使用するために新規な方法をご紹介します。培養代謝プロファイリング研究は、腸の生物学を理解するための新たな戦略を定義するオルガノイドex vivoでのcrypt。

全く開示はありません。

この研究は、国立衛生研究所からの助成金RO1 CA 135561、R01 CA151494、R01 CA174432およびP3013330によってサポートされていました。

私たちは、陰窩単離プロトコールを開発する上で彼らの貴重なコメントミケーレヒューストン、エレナDhima博士アンナVelcichに感謝したいと思います。

我々はまた、直接、それぞれ、タツノオトシゴ施設を運営糖尿トレーニングおよびNIH P60DK20541でサポートされているアルベルト·アインシュタイン医学校の研究センター、博士マイケル·ブラウンリー博士と雪-梁デュを、感謝します。