Real Time Analisi di profilo metabolico in

Piccoli organoidi cripta intestinali in coltura ex vivo fornire un sistema di coltura tessuto che racchiude in sintesi la crescita delle cripte dipendenti sulle cellule staminali e la loro nicchia. Abbiamo stabilito un metodo per dosare il profilo metabolico in tempo reale in organoidi cripta del mouse primario. Abbiamo trovato organoidi mantengono le proprietà fisiologiche definite dalla loro fonte.

La mucosa dell'intestino tenue presenta un'architettura ripetitiva organizzata in due strutture fondamentali: villi, sporgenti nel lume intestinale e composti da enterociti maturi, cellule caliciformi e cellule enteroendocrine; e cripte, che risiedono in prossimità del sottomucosa e muscolare, l'ospitare staminali adulte e cellule progenitrici e cellule mature Paneth, così come stromali e cellule del sistema immunitario del microambiente cripta. Fino agli ultimi anni, studi in vitro di piccolo intestino era limitato a linee cellulari derivate da tumori benigni o maligni, e non rappresentano la fisiologia dei normali epiteli intestinali e l'influenza del microambiente in cui risiedono. Qui, dimostriamo un metodo adattato da Sato et al. (2009) per la coltura di organoidi cripta del mouse intestinali primarie derivate da topi C57BL / 6. Inoltre, vi presentiamo l'uso di colture organoide cripta di saggiare il profilo metabolico cripta in tempo reale per misurazione del consumo basale di ossigeno, glicolisi, la produzione di ATP e la capacità respiratoria. Organoidi mantengono proprietà definite per la loro origine e conservano gli aspetti del loro adattamento metabolico riflessa dal consumo di ossigeno e tassi di acidificazione extracellulare. In tempo reale studi metabolici in questo organoide sistema di coltura cripta sono un potente strumento per studiare il metabolismo energetico organoide cripta, e come possono essere modulati da fattori nutrizionali e farmacologici.

Cancro del colon-retto (CRC) è la terza causa di decessi per cancro correlati negli Stati Uniti. Cancro del colon sporadica - vale a dire che derivanti nel corso della vita (> 50 anni di età) e senza fattori predisponenti genetici chiare - conti per ~ 80% di tutti i casi, con un'incidenza fortemente influenzata da abitudini alimentari a lungo termine ^1,2. Questi tumori presentano uno spostamento metabolico verso dipendenza glicolisi ossidativa, noto come effetto Warburg, che può in parte rendere concentrazioni elevate di particelle elementari cellulari e di energia disponibili (attraverso glutaminolysis) permettere e forse guidare alti tassi di proliferazione delle cellule tumorali ^3-5 . Studi di tumore del colon e altri tumori gastrointestinali, inclusi piccoli tumori intestinali fornire informazioni importanti sulle cause della formazione di tumori. Indagare le differenze metaboliche tra gli stati normali, pro-tumorali e tumorali di sistemi di organi gastrointestinali possono aiutare detine di rischio relativo per lo sviluppo del tumore e la diagnosi precoce della neoplasia. Inoltre, la comprensione del metabolismo bioenergetico che coinvolge la respirazione mitocondriale e la glicolisi si forniscono informazioni fondamentali sul modo in cui la fisiologia delle cellule, l'invecchiamento e la malattia lo stato perturba l'omeostasi intestinale. L'utilizzo della tecnologia bioenergetica test per l'analisi del flusso extracellulare in grado di valutare i tassi di respirazione mitocondriale e glicolisi contemporaneamente in cellule in crescita in coltura in tempo reale ^6,7.

Fino a poco tempo, studi in vitro di tenue sono stati limitati a linee cellulari derivate da tumori benigni o maligni ^8,9 e non rappresentano la fisiologia dei normali epiteli intestinali e l'influenza del microambiente in cui risiedono. Nel 2009, Sato et al. ¹⁰ ha introdotto un sistema ex vivo della cultura a crescere tridimensionale (3D) del mouse intestinali organoidi epiteliali, o epithelial "mini-coraggio", adatto a fini sperimentali, diagnostiche e terapeutiche indagini ^10,11. Inoltre, cripte isolate da topi calorico limitati mantengono le loro proprietà di crescita alterati come organoidi in tali colture ^12. Rispetto a linee cellulari trasformate, culture organoide cripta possono essere utilizzati per generare dati fisiologicamente rilevanti che presentano un modello molto meglio comprendere lo stato in vivo.

Abbiamo adattato la tecnologia di analisi bioenergetica per saggiare il metabolismo energetico di organoidi cripta intestinale. Mouse organoidi cripta intestinale sono state coltivate ex vivo per lo sviluppo degli studi cripta metabolismo energetico organoide presentati. Il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) di organoidi cripta sono stati misurati in assenza e in presenza di due diversi inibitori metabolici (oligomicina, rotenone) e un vettore di ioni (Carbonil cianuro-p-trifluorometossifenil idrazone). L'orga criptarisposta metabolica noid a questi composti chimici sono riflessi con successo attraverso la modifica ECAR e valori OCR.

Studi bioenergetici cellulari potranno chiarire le reciproche interazioni tra stato metabolico e rischio di malattia e fenotipo nel cancro, obesità, diabete, malattie metaboliche e le malattie mitocondriali e contribuire a metodi di screening anticipo aventi implicazioni dirette per la medicina traslazionale. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per isolare piccole cripte intestinali e alla cultura organoidi cripta. Inoltre, si introduce un nuovo metodo per usare le culture organoide cripta per le analisi metaboliche.

Questo studio è stato eseguito in conformità con le raccomandazioni nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Il protocollo è stato approvato dalla commissione etica della sperimentazione animale del Albert Einstein College of Medicine.

1. Isolamento Cripta e Cultura

1. Isolamento delle Cripte dal piccolo intestino:
   1. Isolare cripte intestinali da qualsiasi modello di topi di interesse. Eutanasia i topi con CO ₂ seguita da dislocazione cervicale.
   2. Aprire l'addome longitudinalmente e riempire il piccolo intestino (SI) con soluzione fisiologica fredda ghiaccio fosfato tamponata, PBS (-Ca ^2+; -Mg ²⁺⁾ con 2x antibiotico-antimicotico (anti-anti). Rapidamente isolare piccolo intestino.
   3. Sezionare completamente privo di grasso mesenterico con un bisturi. Fare attenzione a non forare il tessuto - in ogni momento mantenere il tessuto umido con ghiaccio PBS freddo. Aprite inteStine longitudinalmente e lavare accuratamente con ghiaccio freddo PBS.
   4. Tagliare piccolo intestino in due sezioni e appiattire con una punta di cotone bagnato, delicatamente raschiare il villi con una diapositiva pre-raffreddata. Lavare vigorosamente in PBS freddo più volte.
   5. Incubare 3 minuti in 20 ml di PBS 1x per 3 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) /0.5 mM ditiotreitolo (DTT) per la dissociazione non enzimatica del tessuto.
   6. Tagliare il tessuto in piccoli pezzi (2-4 mm) usando una lama di rasoio su un vetrino pre-raffreddato. Trasferire i pezzi in un tubo da 50 ml contenente 20 ml di PBS freddo ghiaccio.
   7. Pipettare su e giù delicatamente 10x con un 10 ml sterile, pipetta monouso. Lasciate che frammenti di tessuto sedimentano per gravità. Rimuovere il surnatante con una pipetta. Ripetere altre tre volte; assicurarsi che il surnatante è chiaro.
   8. Aggiungere 20 ml di PBS per 2 mM EDTA. Turbinio e incubare a 4 ° C per 30 minuti con dolce dondolio.
   9. Lasciate sedimenti tessuti ed eliminare il surnatante. Aggiungere 15 ml di PBS freddo ghiaccio e pipettasu e giù 5x con una pipetta 10 ml. Lasciate che i frammenti di tessuto sedimenti e raccogliere il surnatante come Frazione 1 (F1). Ripetere la raccolta di F2-F5, ogni frazione mantenuto separatamente.
   10. Aggiungere 15 ml di ghiaccio PBS freddo e questa volta agitare vigorosamente a mano per 15 secondi. Raccogliere F6 e ripetere per F7, F8. Se i pezzi di tessuto cominciano a galleggiare, toccare per aiutarli a stabilirsi.
   11. Controllare un'aliquota di ciascuna frazione al microscopio. In comune le frazioni contenenti cripte.
   12. Passare le frazioni aggregati attraverso un filtro 70 micron cellule di nylon, raccogliendo cripte in un tubo da 50 ml.
   13. Centrifugare a 100 xg per 5 minuti a 4 ° C, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di PBS freddo ghiaccio con 2x cripte anti-anti e trasferirli in una provetta da 15 ml. Ripetere il lavaggio ancora una volta.
   14. Lavare le cripte una volta con 10 ml ghiacciata ADF, avanzata DMEM / F-12 (Dulbecco "s Modified Eagle Medium / Ham" s F-12) - 2x anti-anti.
   15. Lavare le cripte una volta con 10 ml ADF - 1x anti-anti.
   16. Contare le cripte con un emocitometro. Regolare il volume della soluzione cripta e trasferire in una provetta da 1,5 ml in modo che la concentrazione finale quando cripta risospeso sarà 100-500 cripte per 50 ml di miscela proteica gelatinosa (Matrigel). Centrifugare a 100 xg per 5 min a 4 ° C e risospendere cripte nella miscela proteica gelatinosa.
   17. Tavola 50 ml di sospensione gelatinosa cripta - miscela proteica per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti (area di crescita: 2 cm ^2), ponendo attenzione la goccia di sospensione al centro di ciascun pozzetto. Mantenere la piastra in una di CO _2, 37 ° C incubatore per ~ 30 minuti fino a quando la sospensione si solidifica.
   18. Aggiungere 500 supporti freddo ghiaccio cultura completa ml (ottimo DMEM / F12 con 1x contro - contro, 10 mM 4- (2-idrossietil) -1 acid-piperazineethanesulfonic (HEPES), 1x Glutamax, 1x B27 supplemento, 1x N2 Supplement, 1 mM N-acetil-L-cisteina (NAC), 50 ng / ml di fattore di crescita epidermico (EGF), 100 ng / mlZucca, 500 ng / ml R-spondina).
       1. Ricostituire fattori di crescita nello 0,1% albumina sierica bovina (BSA) in PBS.
2. Cripta organoide cultura e del passaggio:
   1. Passaggio organoidi cripta 14-21 giorni dopo la semina (o secondo necessità) come segue:
      1. Cambia i media ogni venerdì e lunedì. Il mercoledì, sostituire la metà della media con mezzi freschi.
   2. Rimuovere il terreno di coltura. Lavare il campione due volte con 500 microlitri di PBS a intervalli di 5 min.
   3. Rimuovere PBS e rompere delicatamente la miscela proteica gelatinosa con un P1000 sterile punta micro pipetta.
   4. Aggiungi terreni di coltura 1 ml completa di un singolo pozzo e risospendere le organoidi in 1 ml di media.
   5. Interrompere delicatamente i organoidi con un P1000 pipettando su e giù 20-30x (controllare sotto il microscopio per una corretta dissociazione organoide con una buona resa cripta, fino a quando una tecnica consistente si sviluppa).
   6. Trasferire le cripte in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml;centrifugare a 100 xg a 4 ° C, 5 min.
   7. Lavare il pellet due volte con 1 ml di terreno di coltura completo.
   8. Split a un rapporto di 1: 3 o 1: 6 come necessario, cripte risospeso in 50 microlitri Matrigel per pozzetto. Procedere come descritto in precedenza (sezione 1.1.16-18).
3. Cripta di congelamento organoide:
   1. Rimuovere il terreno di coltura. Lavare il campione in 500 l di PBS.
   2. Disperdere la miscela proteica gelatinosa con una punta P1000 pipetta.
   3. Aggiungere 1 ml di media per un singolo pozzo e risospendere le organoidi in 1 ml di media.
   4. Rompere delicatamente le organoidi con un P1000 pipettando su e giù 20-30x.
   5. Trasferire i organoidi in una provetta da 1,5 ml. Centrifugare a 100 xga 4 ° C, 5 min.
   6. Lavare il pellet due volte con 1 ml di terreno di coltura completo.
   7. Cripte risospendere in 500 microlitri di congelamento media.
   8. Trasferimento cripte ad un cryotube, posizionare il tubo in un contenitore di congelamento e conservare in freezer -80 ° C overnight.
   9. Trasferimento cripte di liquido N ₂ serbatoio.
      1. Recuperare organoidi cripta congelati rapidamente scongelamento in un bagno a 37 ° C Acque. Lavare con 500 microlitri mezzi di coltura completo una volta, centrifugare a 100 xg, 5 min e risospendere in miscela proteica gelatinosa e cultura come descritto sopra. Per una migliore ripresa, aggiungere inibitore ROCK (Y-27632) per il supporto di congelamento.

2. Cripta organoide Metabolismo Assay

1. 24-ben Preparazione del piatto:
   1. Isolare e contare cripte secondo il protocollo (vedere la sezione 1.1 per l'isolamento cripta e la sezione 1.2 per il passaggio cripta).
   2. Cripte Risospendere in miscela proteica gelatinosa (100-200 cripte per 20 ml).
   3. Piastra cripta-gelatinosa sospensione miscela proteica in una piastra a 24 pozzetti test (assicurarsi che non vi siano almeno triplicato per ogni campione) e permettono la sospensione a solidificare a 37 ° C in CO ₂incubatore; quindi aggiungere 500 microlitri Terreni di coltura completo.
   4. Cripte cultura (come descritto nella sezione 1.1) e osservare al microscopio fino cripte crescere in organoidi completamente sviluppati.
2. Extracellulare Flux saggio:
   1. Cartuccia Hydrate durante la notte in un non-CO ₂ (0% CO _2), 37 ° C incubatore.
   2. Rimuovere il terreno di coltura e lavare organoidi due volte con 500 microlitri DMEM (senza: glucosio, L-glutamina, piruvato di sodio e bicarbonato di sodio, e con: rosso fenolo). Attendere 5 min.
   3. Aggiungere 675 ml per medie dimensioni, ben dosaggio (DMEM con 2 mM L-glutammina e 5 mm D-glucosio) in ciascun pozzetto.
   4. Controllare cripta organoidi morfologia microscopica per garantire che organoidi e miscela proteica gelatinosa sono intatti dopo i lavaggi. Incubare 1 ora in un non-CO _2, 37 ° C incubatore.
   5. Preparare 10 mM composti iniettabili (oligomicina, cianuro di carbonile-p-trifluoro-metossi-fenil-idrazone (FCCP), rotenone) nel terreno di coltura.
   6. Set-up della cartuccia caricando 75 ml di 10 micron composti iniettabili nei porti della sequenza della cartuccia: Port A - oligomicina; Port B - FCCP; e Port C - rotenone (Le concentrazioni finali durante il test sarà di 1 micron).
   7. Incubare cartuccia 30 min - 1 ora a 37 ° C in un non-CO ₂ incubatore.
   8. Allo stesso tempo, attivare la XF Analyzer e creare il modello di protocollo del test.
   9. Posizionare la cartuccia e la piastra di utilità in XF Analyzer ed eseguire "calibrare" cartuccia.
   10. Controllare organoidi cripta al microscopio per assicurarsi che essi sono attaccati alla miscela proteica gelatinosa.
   11. Cella di carico piastra di coltura nel protocollo dello strumento ed eseguire test.

Organoidi cripta sono state stabilite da 8 mesi C57BL / 6 topi nutriti purificato roditore dieta American Institute of Nutrition 76A (AIN76A). Organoidi cripta intestinali possono essere coltivate in coltura per lunghi periodi da un unico crypt (Figura 1A, singola freccia rossa). Organoidi crescono strutture cripta-come in 18-20 giorni in coltura (Figura 1B, frecce rosse). Cripte sono stati diversi passaggi ogni 3 settimane e organoidi recuperati in modo efficiente dopo ogni passaggio.

Seahorse strumentazione bioenergetica in grado di valutare i tassi di respirazione mitocondriale e glicolisi contemporaneamente in cellule in crescita in coltura in tempo reale. Abbiamo adattato questa tecnologia per eseguire il test del metabolismo organoide cripta. Con organoidi derivate da topi nutriti AIN76A dieta purificata per 8 mesi, abbiamo misurato:. 1 tasso di consumo di ossigeno, OCR mostrato nella Figura 2A - linea rossa che rappresenta il tasso di consumo di ossigeno (pmol / min) in organoidi cripta, il blu è thpozzi e di controllo solo con Matrigel (miscela proteica gelatinosa); 2. tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) mostrato in Figura 2B - linea rossa che rappresenta tasso di acidificazione extracellulare (mph / min) in organoidi cripta, il blu è pozzetti di controllo solo con la miscela proteica gelatinosa.

Figura 1:. Organoidi Cripta derivati ​​da 8 mesi vecchi topi C57BL / 6 cripte sono (A) 2-giorni o (B) 18-giorni di coltura. Scala: 100 micron.

Figura 2: bioenergetica dosaggio con organoidi derivati ​​da 8 mesi vecchi topi C57BL / 6. (A) tasso di consumo di ossigeno (OCR) è indicato; viene mostrato (B) tasso di acidificazione extracellulare (ECAR). Legenda: rosso - cripte, blu - di controllo, solo Matrigel. n = 3. Reagenti iniettati sequenziale - indicato dalle barre verticali blu - sono i seguenti: A, oligomicina; B, Carbonil cianuro-p-trifluorometossifenil idrazone (FCCP); C, rotenone.

Abbiamo testato il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) delle cripte isolate da 8 mesi topi e cresciuti in organoidi ex vivo. Dopo la misurazione del tasso basale, il metabolismo cripta è stata valutata con l'aggiunta di oligomicina, il cianuro di carbonile -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) e rotenone, in sequenza.

Basale OCR e ECAR basale sono stati registrati 0-29 min (Figura 2A e 2B). Al ²⁹ min, oligomicina (dalla porta A) è stato iniettato in ciascun pozzetto (n = 3, sia per cripte e pozzetti di controllo). Oligomicina è un inibitore della sintesi di ATP. E 'usato per prevenire stato 3 (fosforilante) la respirazione. Così, oligomicina iniezione determinato una lieve riduzione OCR, dovuta al blocco della sintesi di ATP nei mitocondri, e le cripte commutato glicolisi per soddisfare la loro richiesta di ATP con un conseguente aumento ECAR. Al 64 ^° min, FCCP (from porta B) è stato iniettato in ciascun pozzetto. FCCP è un vettore ione mobile, trasporto di ioni idrogeno attraverso la membrana mitocondriale, con conseguente consumo di energia rapida senza necessità di produzione di ATP. OCR è aumentato a causa di disaccoppiamento e ECAR aumentate dopo le cripte hanno mantenuto la loro bilancio energetico con l'impiego glicolisi per produrre ATP, in tal modo la sintesi e la secrezione di acido lattico. Al 99 ^° min, rotenone (dal porto C) è stato iniettato in ciascun pozzetto. Rotenone è un inibitore mitocondriale. Pertanto, la terza iniezione portato ad una diminuzione OCR causa alterata funzione mitocondriale e spostato cripte ad uno stato più glicolitico mantenendo i valori ecar elevati.

Ci sono due conclusioni principali: 1) organoidi cripta da 8 mesi i topi sono stati coltivati ​​con successo attraverso più passaggi; 2) organoidi che era stato posto in coltura per 2 mesi dopo la derivazione mostrato una risposta metabolica a oligomicina, cianuro di carbonile-p-trifluoromethoxyphen ylhydrazone e rotenone. In questo modo, la capacità di glicolitico organoidi era stabile dopo 2 mesi in cultura, in linea con la relazione che organoidi da topi calorico limitati sono relativamente adattati in modo permanente alla crescita diverso e fenotipi metabolici nella cultura ^12.

Le procedure sperimentali descritte in questo protocollo saranno di grande importanza per gli studi metabolici di cripte intestinali. Il protocollo per l'isolamento cripta è adattato da Sato et al. ¹⁰ Il protocollo per lo studio del metabolismo cripta in piccoli intestinali culture organoide cripta utilizzando la tecnologia di analisi bioenergetica non e 'stato segnalato. Gli studi sul metabolismo organoide cripta può essere esteso ulteriormente l'introduzione di diverse variabili ai terreni di coltura e condizioni di analisi, come ad esempio diverse fonti di energia, inibitori e attivatori di segnalazione specifica e vie metaboliche, e le condizioni di ipossia che possono modulare vie metaboliche.

Cripta studi sul metabolismo organoide presentati possono essere applicati a mini-budella epiteliali normali e pazienti derivato di esplorare il programma di utilità per la valutazione precoce del rischio di malattia relativo e approcci che possono modulare il fenotipo metabolico e ridurre il rischio quindi. I saggi metabolici descritti introducono nuove strategie per l'eventuale valutazione del rischio relativo per lo sviluppo della malattia e per la diagnosi precoce di stato di malattia, la sua dissezione biochimica e molecolare e il potenziale di modulazione. In sintesi, si descrive un protocollo dettagliato per isolare piccole intestinacripte e l organoidi cultura cripta. Inoltre, si introduce un nuovo metodo per utilizzare cripta organoide cultura per determinare i tassi di acidificazione e di consumo di ossigeno extracellulari di studiare il metabolismo energetico cripta organoide. Ex vivo cripta organoide cultura metabolica profiling studi definirà nuove strategie per la comprensione della biologia intestinale.

Non ci sono informazioni.

Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni RO1 CA 135561, R01 CA151494, R01 CA174432 e P3013330 dal National Institutes of Health.

Vorremmo ringraziare Michele Houston, Elena Dhima e Dott.ssa Anna Velcich per i loro preziosi commenti nello sviluppo del protocollo di isolamento cripta.

Ringraziamo anche la formazione del diabete e Centro di Ricerca del Albert Einstein College of Medicine sostenuto da NIH P60DK20541, e il dottor Michael Brownlee e il dottor Xue Liang-Du, che dirigono e operano la struttura Seahorse, rispettivamente.