multiprotein의 단지의 비교 분석을위한 새로운 접근 방식을 기반으로

기술 비교, 정량 프로테오믹스 방법은 서로 다른 조건에서 multiprotein의 단지의 조성에 대한 통찰력을 얻는 것을 목표로하고 유 전적으로 서로 다른 변종을 비교하여 보여줍니다. 정량 분석​​을 위해 자당 밀도 구배 상이한 분획 같은 부피는 질량 분석법에 의해 혼합되고 분석된다.

도입 된 프로토콜은 서로 다른 조건에서 복잡한 구성에 대한 통찰력을 공개함으로써, 틸라코이드 막에서 multiprotein의 단지의 분석을위한 도구를 제공합니다. 이 프로토콜의 접근 방식은 유 전적으로 서로 다른 계통에서 분리 인 Chlamydomonas reinhardtii의 순환 전자 흐름 (CEF), 복잡한 책임 단백질의 구성을 비교하여 보여줍니다. 절차의 차동 대사 라벨링 ⁽¹⁴ N / ¹⁵ N)에 근거 자당 밀도 구배 원심 분리, SDS-PAGE, 면역 및 비교 정량적 질량 분석 (MS)에 의해 multiprotein의 착물에 자신 분액하여 틸라코이드 막 분리를 포함 분석 변종. 세제 용해 틸라코이드 막은 동일한 엽록소 농도에서 자당 밀도 구배에로드됩니다. 초 원심 분리 한 후, 그라데이션은 대량 spectromet으로 분석 분획으로 분리된다공예 같은 부피에 따라. 이 접근법은 또한 구배 분획 내의 조성물의 조사 및 특히 ANR1, CAS 및 PGRL1에 집중 다른 단백질의 마이그레이션 동작을 분석 할 수있다. 또한,이 방법은 (이전의 연구에서 이전에 같은 PGRL1, FNR과 CEF-supercomplex의 일부가 설명 된 단백질의 식별 및 PSI에 의존하는 이주 연구 결과를 지원에 의해 면역 블롯과 부가 적 결과를 확인하여 설명된다 CYT F). 특히,이 방법은이 프로토콜을 채용 할 수 있고, 예를 들면 별개의 환경 조건으로부터 격리 multiprotein의 복합 조성물의 비교 분석을 위해 사용되는 질문의 광범위한 주소에 적용 가능하다.

식물과 조류의 틸라코이드 막에서 광합성 과정은 선형 및 순환 모드에서 작동 할 수 있습니다. 선형 전자 흐름 (LEF) 광계 I (PSI), 광계 II (PSII)와 시토크롬 B ₆ / F 동안 궁극적으로 NADPH와 ATP의 ² 세대로 이어지는 물에서 NADP + ^1에 전자를 전송할 수 있습니다. 반대로, 상태 ² 및 혐기성 조건 ⁰⁴ 위로 전자 수송 체인에 전자를 주입하여 산화 PSI의 재 환원의 결과와 같은 다양한 환경 조건에서 유발되는 것으로 알려져있다 환상 전자 흐름 (CEF). 이 과정은 시토크롬 B ₆ / F 복합체 ^1의 기질면에서 또는 플라 스토 퀴논 풀 ^5시에 하나 자리를 대신하고 ATP를 생성하지만 NADPH ² 수 있습니다.

제시된 프로토콜의 목적은 질량 분석계 (MS) 기반 m을 입증하는 것이다(유 전적으로 서로 다른 변종을 비교하여 예시) 다른 조건이 단지의 조성에 대한 통찰력을 얻을 수 인 Chlamydomonas reinhardtii의 틸라코이드 막에서 multiprotein의 단지의 비교, 정량 분석을위한 ethod. 이 방법은 테라지마 외 의해 출판물에 적용되었다. 2012 년 C.에 CEF의 칼슘 ^{2 +에} 의존 규제를 보여주는 단백질 CAS, ANR1 및 PGRL1 ^6를 포함하는 multiprotein의 복합에 의해 매개 reinhardtii. 절차는 비교적함으로써 라벨링 무거운 질소 (N ^15)와 두 균주 중 하나를 이용하고,이 유 전적으로 상이한 균주에서 CEF-supercomplex의 조성물을 분석하여 설명한다. 간략하게, 프로토콜은 세제 가용화 및 자당 밀도 구배에서 광합성 착체 분획 하였다 틸라코이드 막의 제조를 포함한다. 그라데이션의 분별 한 후, 골절을 선택두 균주의 tions 혼합, 같은 부피에 따라 인 - 젤 소화 이후 양적 MS 분석에 의해 다음 SDS-PAGE에 의해 분리된다.

위에서 언급 한 바와 같이, CEF는 다른 환경 조건에서 유도 된 2010 년에서 게시 상태에서 C. 2 잠긴 셀을 기능 CEF-supercomplex의 분리를 보여줍니다된다 초 원심 동안 자당 밀도 구배에 가용화 틸라코이드 막 분리에 의해 수행 된, ⁷ reinhardtii. 이와이 등. ⁷ 달리, 제시된 프로토콜은 혐기성 성장 C.에서 CEF-supercomplex의 분리를 설명 다른 절차에 따라 reinhardtii 문화. 이것은 틸라코이드 분리 프로토콜의 변화뿐만 아니라 가용화 단계에 관한 차이와 초 원심 분리에 의해 단백질 복합체의 분리를 포함한다. 본 프로토콜, 틸라코이드 막버퍼가 이와이 등으로 틸라코이드 제조에 사용하면서, Chua의 및 Bennoun ^(8)에 의해 발표 된 절차를 적용하여 격리하는 알. ⁹ 설명 된대로 25 mM의 메스, 0.33 M 수크로오스, 5 mM의 _MgCl2를 1.5 mM의 염화나트륨 (산도 6.5)이 포함되어 있습니다. 여기에 설명 된 가용화 방법은 0.9 %의 세제의 사용에 의존하면서 가용화는, 이와이와 동료의 경우 얼음 위에 30 분 동안 0.7 ~ 0.8 %의 세제 (N-데실-β-D-말토 사이드)를 수행 하였다 (N - 도데 실-β-D-말토 (β-DM)) 및 얼음에 20 분 동안 수행된다. 두 그룹은 각각의 세제로 가용화 ML 당 엽록소의 0.8 MG를 사용했습니다. 이 프로토콜의 저자의 농도 범위를 사용하는 반면 가용화 틸라코이드 막에서 광합성 복합체의 분리를위한 이와이 외., 0.1-1.3 M 사이 수크로오스 농도를 적용 0.4-1.3 M. 마지막 차이로부터 비해 낮다 원심 속도이며, 개에rlier 출판.

자당 밀도 구배 분획 하였다 비이 온성 세제 틸라코이드 막의 가용화 이미 1980 년대부터 또한 단백질의 대사 라벨링 애플리케이션 프로테오믹스 분야에서 널리 방법 오늘 ^{7, 9-14까지} 이르는 수많은 연구에 적용되어왔다. 기재된 접근 방법은 대량으로 이어지는 모든 아미노산에 도입되어 ¹⁵ N _NH4Cl 등의 형태로 단독 질소원으로서 무거운 질소의 존재를 배양하여이 비교 균주 중 하나에 대해 ¹⁵ N 대사 라벨링 적용 펩티드의 아미노산 서열에 따라 시프트. 한 MS는 실행 시간 이내 ¹⁴ N ¹⁵ N의 혼합물을 분석 할 때, 이러한 질량의 변화는 각 펩티드와 존재비는 대응 대해 상대적인 풍부함을 나타내는 계산 될 수 상대 펩타이드 샘플 원점을 결정하는데 사용될 수있다단백질 ^15을 보내고.

C.에 많은 정량 프로테오믹스 연구 reinhardtii는 실험 조건 ^(16-19으로 인해 영양소 나 가벼운 스트레스 ^{(20, 21)에} 대한 프로테옴의 예를 들어 변경) 사이의 프로테옴의 변화를 분석하는 단백질의 정량 비교하는, 사용할 수 있습니다. 그 연구에 비해, 현재 제시된 방법에 샘플 같은 부피가 결합되고 분석된다. 이 설정은 그라데이션 내에서 단백질의 이동 동작을 연구하고 또 연구 균주에 대한 다른 단지의 구성을 분석 할 수 있습니다.

이 방법은 주로 세 가지 단백질에 집중하여 설명한다 : 첫 번째 후보는 C.에 사진 순응에 관여하는 것으로 나타났다 엽록체 지역화 칼슘 센서 단백질 CAS입니다 reinhardtii ^22. 칼슘은 중요한 신호로 간주됩니다마지막으로 유전자 발현 및 세포 생리학 ^23의 변화에 선도적으로 인해 다른 생물과 비 생물 적 스트레스에 활성화되고,이 엽록체가 CAS 단백질 ^22,24,25를 통해 신호 ⁺ 세포의 ^칼슘에 기여할 수 있음을 제안 된 경로에 이온을 주입. 두 번째 단백질은 ANR1 (혐기성 반응 1 ^6), C.에서 무산소 성장 조건에서 유도 표시했다 단백질이다 reinhardtii ^26. 특히, CAS 등 ANR1은 CEF-supercomplex 더욱이, 역방향 유전자 접근법을 사용함으로써,이 두 단백질이 단백질 복합체의 기능적 서브 유니트로서의 역할을지지 생체 ⁶ CEF 기능적 올릴 것을 증명 하였다 소단위로 확인 하였다. 세 번째 단백질은 클라 미도 모나스 ^4,27뿐만 아니라 애기 장대 ^5,28에 CEF에 참여하는 것으로도 ID이었다 틸라코이드 단백질 PGR5 - 드 1 (PGRL1)입니다이와이 외 여러분의 작업에 entified. ⁷

, 야생형 (WT) (대) ΔPSI ²⁹ 균주 대 psab 유전자의 삭제를 나타내는도의 일부입니다 제가 소단위 필수 광계, 코딩 :이 방법은 두 가지 실험의 결과를 표시하여 표시됩니다 CEF-supercomplex 및 WT 대 pgrl1 노크 아웃 변형 ^4. 그 실험의 각 ¹⁵ N과 ¹⁴ N-라는 변형을 비교 한 사이의 CEF-supercomplex의 양적 구성.

1. 클라 미도 모나스의 배양

1. 다음 C. reinhardtii 균주는 본 연구에 사용되었다 : WT의 cc124, WT의 cw15-arg7 (세포 벽 결핍과 아르기닌 영양 요구 주), ΔPSI 변이주 ²⁹ pgrl1 노크 아웃 변형 ^4.
2. 모든 균주 연속 빛 20 ~ 50의 강도 μE / m ² 초, 120 rpm에서 진탕 트리스 - 아세테이트 - 인산염 (TAP) - 매체 ^(30), 25 ° C에서 성장했다. ΔPSI의 문화는 <5 μE / m ² 초 빛의 노출에 대한 몇 가지 조직 종이로 포장되어야한다.
3. nonlabeled 균주 (각각 WT cw15-arg7 및 pgrl1)의 문화가 7.5 밀리미터 ¹⁴ N NH ₄ 망할 CIA를 포함하는 반면 (각각 ΔPSI 및 WT의 cc124)라는 균주의 배양, 7.5 mM의 ¹⁵ N NH ₄ 망할 CIA가 포함되어 있습니다. 세포는 적어도 네 generat라는 성장이이전체 라벨과를 달성하기 위해 이온은 기하 급수적 인 성장 단계에서 보관해야합니다.
4. 실험 개수 및 적어도 750 ㎖ / 스트레인의 체적 1 × ¹⁰⁶ 세포 / ml의 밀도로 세포를 희석 시작 하루전.

불연속 자당 밀도 구배의 두 가지 유형은 다음과 같은 프로토콜에 설명되어 있음을 양해 바랍니다. 광계 자당 밀도 구배 타카하시 외. ^{9에있어서} 틸라코이드 자당 밀도 구배보기 (프로토콜 2 참조) 전에 오버 박 원심 동안 격리 및 가용화 틸라코이드에서 다른 광합성 단백질 복합체를 분리하고 일 대비해야하는 데 사용되며 ⁸ (프로토콜 3 참조) 틸라코이드 격리 절차에 적용됩니다.

2. 광계 자당 밀도 구배 준비

1. 그라디언트를 붓는 세 주식 솔루션이 필요합니다 :
   1. 2 M 자당
   2. H ₂ 10 % β-DM O
   3. 0.5 M 트리 신, pH가 8.0 (수산화 나트륨)
2. 이러한 주식을 사용하여, 다음과 같은 솔루션을 준비 :

   농도 :	1.3 M	1.0 M	0.85 M	0.7 M	0.65 M	0.4 M
   2 M 자당	13 ML	10 ㎖	8.5 ML	7 ML	6.5 ML	4 ML
   10 %46;-DM	100 μL	100 μL	100 μL	100 μL	100 μL	100 μL
   0.5 M 트리 신	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL
   H 2 O	6.7 ML	9.7 ML	11.2 ML	12.7 ML	13.2 ML	15.7 ML

3. 14mm X 89mm의 원심 분리기 튜브를 사용하여 낮은 밀도 솔루션에 가장 높은 자당 밀도 솔루션을 시작, 아주 천천히 그라데이션을 붓는다.
4. 솔루션의 나머지 부분에 대한 1.3 및 1.0 M 솔루션 및 2 ㎖ 만 1 ㎖를 각각 붓는다.
5. 추운 방에서 하룻밤 그라데이션을 남겨주세요.

3. 혐기성 유도 및 틸라코이드 막 ^8의 분리

1. 틸라코이드 막의 분리 시작 전에 4 시간 동안 아르곤으로 버블 링시킴으로써 혐기성 조건을 유도한다. 버블 링은 자기 교반 막대로 배양 일정한 혼합하면서 플라스크 배양에서 유리 피펫을 통해 수행 될 수있다.
2. 2,500 XG에서 5 분 동안 세포를 펠렛으로 틸라코이드 막 분리 시작, H1 버퍼에 resuspend (0.3 M 자당, 25 mM의 HEPES (산도 7.5), 5 mM의 _MgCl2를).
   (주의하시기 바랍니다 틸라코이드 막 샘플 쉬의 분리로 시작하는 경우단백질 분해를 방지하기 위해 얼음에 보관해야 울드, 모든 원심 분리 단계는 4 ° C에서 수행되는 장갑 작업을 강력하게 각질 오염을 방지하는 것이 좋습니다.)
3. 2,500 XG, H1 버퍼에 resuspend에서 5 분 펠렛 세포.
4. 1500 고전력 증폭기의 질소 압력 분무기를 통해 두 구절 세포를 파괴 (세포 벽이없는 변종에 대해 하나의 통로를 수행).
5. 2,500 X g에서 12 분 동안 세포를 스핀 다운.
   (이 단계 후 상등액을하지 않을 경우, 세포의 파괴에 성공하지 못한, 밝은 녹색이어야합니다.)
6. H2 버퍼 (0.3 M 자당, 5 mM의 HEPES (산도 7.5), 10 mM의 EDTA (산도 8.0)) 및 32,800 X g에서 10 분 동안 펠렛 세포를 Resuspend 세포.
7. H3 버퍼를 Resuspend 세포 (1.8 M 자당, 5 mM의 HEPES (산도 7.5), 10 mM의 EDTA (산도 8.0))와 포터 (녹색이 입자가이 작업 단계의 마지막에 남아 있어야합니다)와 펠렛을 균질화.
8. 욕조에 틸라코이드 자당 밀도 구배를 준비12 ㎖의 H3의 층으로 맨 아래에 시작하여 에스는 (25mm X 89mm) 12 ㎖를 H4 버퍼의 중간 계층을 부어 세포와 버퍼 (1.3 M 자당, 5 mM의 HEPES (산도 7.5), 10 mM의 EDTA ( 산도 8.0))와 최고 12 ML H5 버퍼에 (0.5 M 자당, 5 mM의 HEPES (산도 7.5), 10 mM의 EDTA (산도 8.0)). 그라디언트를 주입 할 때주의하고, 3 개의 층으로 혼합하지 마십시오.
9. H5는 X g 70,700에서 1 시간 동안 버퍼와 원심 분리기 틸라코이드 자당 밀도 구배와 균형.
10. 틸라코이드 자당 밀도 구배에서 틸라코이드 밴드를 제거하고 적절한 볼륨 H6 버퍼 (5 mM의 HEPES (산도 7.5) 10 mM의 EDTA (산도 8.0))로 희석.
11. 20 분 동안 37,900 XG에서 세포를 스핀 다운. 펠릿 타이트하지 않으면 더 H6 버퍼는이 원심 분리 공정을 위해 요구된다.
12. 작은 볼륨 H6 버퍼에 틸라코이드를 재현 탁하고 엽록소 농도의 결정을 진행합니다.

4. 엽록소 농도 ^31의 결정

1. 클로로필 량의 결정은 80 % 아세톤으로 수행된다.
2. 995 μL에게 80 %의 아세톤과 H6 버퍼에 틸라코이드의 5 μL (희석 1:200)를 섞는다.
3. 몇 초 동안 소용돌이 녹색이​​ 입자가 남아 다음 5 분 동안 14.1 XG에 스핀 다운 할 때까지.
4. 상층 액을 각각 663.6 및 646.6 ㎚, 750 ㎚에서 흡광을 측정합니다.
5. 다음과 같은 수식을 사용하여 엽록소의 양을 계산합니다 :
   1. C _엽록소 [㎎ / ㎖] = (0.01225 * E _{663.6-0.00255} * E _646,6) * 희석 계수
   2. C _{엽록소 B} [㎎ / ㎖] = (0.02031 * E _{646.6-0.00491} * E _663.6) * 희석 계수
   3. C _엽록소 [㎎ / ㎖ = C _엽록소 + C _{엽록소의 B}

5. 광계 자당 밀도 구배로드

1. 필요한 틸라코이드, β-DM 및 H6 버퍼의 양을 계산각 그라데이션 :
   1. 각 그라데이션은 0.9 % β-DM (H ₂ O에서 β-DM을 용해) 0.8 ㎎ / ㎖ 엽록소와 700 μL의 총 부피로로드해야합니다, H6 버퍼와 나머지 볼륨을 작성하십시오.
2. 가용화 각 그라데이션 틸라코이드, β-DM 및 H6 버퍼와 다른 분취를 준비합니다.
3. 정기적으로 (반전) 몇 분 간격 (가용화 단계)를 혼합 얼음에 20 분 동안 샘플을 둡니다.
4. 4 ℃에서 10 분 동안 최대 속도 (14,000 XG)에서 원심 분리기
   (상층 액은 진한 녹색 동안 원심 분리 한 후, 펠릿은 작고 흰해야합니다.)
5. 그라디언트에 뜨는을로드합니다.
6. H6 버퍼와 4 ℃에서 (14 시간) 밤새 134,470 XG에서 초 원심 분리기를 사용하여 회전과 균형
   (저기서 때이 프로토콜에 제시된 광계 자당 밀도 구배를 이용하여 광합성 단지의 성공적인 분리 만 달성된다는 점에 유의하시기 바랍니다가용화하고 복잡한 분리에 대한 예측이 전에 냉동 된 틸라코이드 막 작업을 할 때 만드는 어렵 기 때문에 g 갓 틸라코이드을입니다.)

6. 광계 자당 밀도 구배 분류

1. 그라디언트의 사진을 촬영합니다.
2. 500 μL를 튜브에 바늘과 분별 그라디언트를 사용하여 튜브의 바닥에 구멍을 천공. 대안 적으로, 분별 증류는 96 - 웰 플레이트 (마이크로)를 사용하여 수행 될 수있다.
3. 마이크로 플레이트를 사용하는 경우, 675 nm에서 다른 그라데이션 분획의 흡광도를 결정한다.
   (이 단계 샘플에서 몇 주 동안 -80 ° C에 저장할 수 있습니다.)

7. SDS-PAGE 및 면역 검출

(만 ΔPSI 대 WT의 비교를 위해 웨스턴 블롯 분석은 이후 MS 분석의 분수를 선택하기 위해 수행 된 것을 양해 해 주시기 바랍니다. 실험 WT 대 pgrl1 FR동작은 다른 분획의 흡광도에 의해 선택되었다.)

1. 13 % SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 ³² WT 및 ΔPSI 그라데이션의 각 부분의 분리 30 μL.
2. ANR1 (TEF7) ²⁶ PGRL1 ^(34), CAS ^(6), PSI의 서브 유닛 PSAD ^(32)와 광계 핵심 서브 유닛 D1 : 다음과 같은 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석 ^(33)를 수행합니다. 1:10,000의 희석으로 표기 D1 항체를 제외하고 (강화 된 화학 발광 검출 기법을위한)의 1:1,000 희석액과 함께 모든 항체를 사용한다.
3. 면역의 결과를 바탕으로, WT 및 ΔPSI에 대한 ANR1, PGRL1 및 PSAD의 피크 분획 (각각 여기에 분수 6, 13,) 가지고 WT 및 ΔPSI에서 분수 6의 30 μl를 혼합 비율 13에서와 동일한 작업을 수행 모두 준비하고 13 % SDS 폴리 아크릴 아미드 겔에서 다시 분리.
4. WT 대 pgrl1의 정량적 인 비교를 위해 C 취다른 그라데이션 분획의 흡광도를 측정하여 결정하고 13 % SDS 폴리 아크릴 아미드 겔에서 분리 한 다음 두 샘플의 30 μL를 혼합으로 EF-supercomplex 분획.
5. 4 ℃에서 상온 이상 밤 2 시간 동안 쿠마 용액 (85 ​​% 인산, 757 MM의 황산 암모늄, 1.2 % 쿠마 화려한 파란색, 20 % 메탄올)와 단백질 밴드를 얼룩
6. 불특정 얼룩을 제거하려면, DDH ₂ O와 여러 번 세탁
7. 1mm 젤 조각으로 차선을 차단하고있는 젤 소화를 진행합니다.
   (다른 방법으로, 샘플은 진공 원심 분리기에 몇 분을 건조하고있는 젤 소화를 계속하기 전에 몇 주 동안 저장할 수 있습니다.)

8. 에서 젤 소화 (셰브첸코 등. ^35에서 수정 된)

곧 사용하기 전에 모든 버퍼 및 솔루션을 준비하고 아세토 니트릴 (ACN)를 포함하는 버퍼 유리 병을 위해주의하시기 바랍니다.
주의! ACN과 함께 작업하는 것은 해로울 수 있습니다, 자세한 내용은에서 다운로드 할 수 있습니다 http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927335 (2013).

1. 30 초 동안 DDH ₂ O (~ 200 μL)의> 10 권과 젤 조각을 씻으십시오.
2. 흔들어 15 분간 25 mM의 NH ₄ HCO _3의 300 μL와 젤 조각을 품어 액체를 제거합니다.
3. 흔들어 15 분 (1:1의 비율로 ACN 50 mM의 NH ₄ HCO _3을 혼합하여 준비) 액체를 제거 50 % ACN에서 25 mM의 NH ₄ HCO _3의 300 μL와 젤 조각을 품어.
4. 겔 조각은 아직 블루 경우에, 쿠마의 대부분이 제거 될 때까지 NH ₄ HCO ₃ 및 NH ₄ HCO ₃ / ACN가 흘려 반복한다.
   (쿠마시 염색의 벌크가 제거되어야하지만, 완전히 겔 조각 destain 할 필요는 없다.)
5. 5 분 동안 젤 조각을 탈수 ACN 100 μl를 추가합니다. 겔 조각을 축소해야ND 완전히 흰색 본다.
6. 가능한 한 많은 ACN을 제거하고 트립신 소화를 진행합니다. 또한, 샘플 몇 주 동안 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
7. 20 NG의 밴드 당 20 μl를 추가 / 10 % 트립신 μL ACN / 25 mM의 NH ₄ HCO ₃ (갓 희석), 얼음에 샘플을 유지합니다.
8. 30 분 후 모든 솔루션이 흡수 된 경우, 확인하고 필요한 경우, 더 트립신 버퍼를 추가합니다. 젤 조각이 완전히 트립신 버퍼로 덮여해야합니다. 얼음에 샘플을 보관하십시오.
9. 트립신을 포화 얼음에 또 다른 90 분 동안 젤 조각을 남겨주세요.
   (긴급 단계 : 트립신 펩티드의 수율은 탓 폴리 아크릴 아미드 매트릭스에 효소의 느린 확산, 얼음 위에서 배양 시간이 증가함에 따라 상당히 증가 그것은 피할 겔 조각을 피복 용액의 작은 과량을 가질 필요가 있다고 조각. 하룻밤 배양 동안 건조한 가을.)
10. 4 ~ 6 시​​간 동안 37 ° C에서 소화. 필요로하는 실험최대 펩타이드 복구, 밤새 소화.
11. 소화 후 응축 된 버퍼를 스핀 다운.
12. 5 분 동안 초음파 처리 관은 다시 펩티드와 원심 분리기를 용출한다.
13. 상층 액을 수집하고 새로운 튜브로 전송할 수 있습니다.
14. 15 분 동안 초음파 욕조에서 30 % ACN / 1 % 포름산 (FA)의 80 μL와 펩타이드 추출을 수행합니다.
15. 15 분 동안 초음파 욕조에서 30 % ACN / 1 % FA 80 μL로 추출을 수행합니다.
16. 15 분 동안 초음파 욕조에서 70 % ACN / 1 % FA 80 μL로 추출을 수행합니다.
17. 이전 용출액을 다시 수영장을 뜨는 원심 분리기.
    (FA는 트립신을 불 활성화 및 펩타이드의 용해도를 증가시키는 역할을한다.)
18. 완전 진공 원심 분리기 드라이 펩타이드 솔루션을 제공합니다.
    (이 시점에서 시료를 MS 분석을 진행하기 전에 -20 ° C에서 몇 주 동안 저장할 수 있습니다.)
19. 6 μL MS 버퍼 (5 % ACN, 0.1 V / V FA, 물)과 2-5 분 동안 초음파 처리에 재현 탁 펩티드.
20. maximu 원심 분리기 샘플m의 속도로 5 분 미립자 물질을 제거합니다.
21. 질량 분석 분석을 위해 뜨는 4 μl를 사용합니다.

9. "Proteomatic"와 MS-데이터 분석

데이터 분석은 오픈 소스 소프트웨어 (http://www.proteomatic.org/에 다운로드 될 수있다) "Proteomatic"생성 및 MS / MS 데이터 평가 파이프 라인의 완료 사용하여 허용 플랫폼 하였다 무료 및 상용 소프트웨어 ^36. 간단히, 설정은 다음과 같습니다 더 자세한 정보는 ^6,26에서 찾을 수 있습니다.

1. MS 데이터의 확인 및 정량화
   ΔPSI 대 실험 WT에서 확인 및 단백질의 정량은 ^6,26 바와 같이, OMSSA (버전 2.1.4 ^37)와 각각 qTrace ^{26 일에} 수행되었습니다. 다음 업데이트 파이프 pgrl1 실험 WT 대에서 MS 데이터 분석에 사용 하였다 :
   1. OMSSA ^37뿐만 아니라, 단백질은 X로 확인되었다! 탠덤 (버전 2013년 2월 1일 ^38). 두 알고리즘 모두가 NCBI의 합류 데이터베이스에 대해 오거스타 데이터베이스 버전 10.2 등으로 JGI 인 Chlamydomonas 유전자 모델 데이터베이스의 버전 4.3을 결합하여 생성 된 데이터베이스에 대해 검색하여 적용된 BK000554.2 및 NC_001638.1을 데이터베이스.
   2. 펩티드의 MS ² 식별은 타겟 디코이 접근법 ^39을 사용하여 수행 하였다. 각 단백질 미끼는 nonproteotypic 펩티드의 중복을 유지하면서 무작위로 트립신 펩티드를 걸어 갔다에 의해 만들어졌습니다.
   3. 펩티드의 통계적 검증은 0.01 미만 및 결과는 5 ppm으로 전구체 질량 허용 오차로 여과 하였다 후방 오류 확률 (PEP) 임계 값을 사용하여 소프트웨어 qvality (버전 0.3.3 ^40)를 수행 하였다.
   4. OMSSA 및 X에서 펩티드! 탠덤 실행은 qTrace과 결합 및 정량화 ^{다음 필터 단계를 적용 (26)는 : MS 2의 확인이 필요합니다 단백질 이름 / 그룹 정보를 추가하고 두 자매 펩티드를 필요로합니다.}

단백질 비율은 WT와 pgrl1에서 혼합 CEF-supercomplex 분획에서 서로를 향해 크게 달랐다 여부를 조사하기 위해, 통계 분석은 SPSS 소프트웨어 (버전 21)를 적용 하였다. 시토크롬 B ₆ / F 복합체의 서브 유니트는 서로뿐만 아니라 단백질 FNR, FTSH2 및 PSI 소단위 대하여 HCF136 대해 시험 하였다. 네 복제물의 단백질 당 각 스캔 횟수의 펩티드 비는 샤피로 - 윌크스 테스트와 정규 분포에 대한 검사를했다. 펩티드 집단이 정상적으로 (p <0.001) 분배되지 않았기 때문에, 비모수 통계를 수행 하였다. 첫째, 크루스 칼 - 월리스 시험은 그룹 간 유의 한 차이를 평가에 적용 하였다. 이 테스트는 상당한 차이를 예측하는 경우에만그룹 사이의는 추가 분석은 맨 - 휘트니 U-테스트와 함께 두 개의 독립적 인 군 사이에 유의 한 차이를 예측하기 위해 수행되었다.

도입 정량 프로테오믹스 방법은 유 전적으로 다른 C.에서 CEF-supercomplex 성분의 비교 분석에 의해 입증 틸라코이드 막에 multiprotein의 복합체 조성물을 특성화하는 것을 목표 긴장을 reinhardtii. 설명 메서드가 성공적으로 테라지마 등. ⁶ 적용 및 세제 가용화 혐기성 성장 문화의 틸라코이드 막,의 분리를 포함하고있다. 이어서, 샘플은 동일한 엽록소 량에 기초 자당 밀도 구배에로드되고 착체 초 원심 분리에 의해 분별된다. 양적 MS 분석에 대해 서로 다른 계통에서 두 그라데이션 분수 같은 부피 혼합 비교적 (그림 1) 분석된다. 제시된 결과는 중량 cw15-arg7 및 ΔPSI뿐만 아니라 각각 WT의 cc124과 pgrl1 사이의 CEF-supercomplex 분수의 비교를 포함한다.

면역 블롯 분석에 의해 계시 (그림 2A와 2B) ^6을 선택했다. 3 몇 PSI 코어와 LHCI 단백질 (또한 Lhca 단백질로 명명 PSI의 빛 수확 단백질)뿐 아니라 WT / ΔPSI ⁽¹⁴ N / ¹⁵ N)로 상대적으로 단백질의 비율을 나타낸다 그림 CEF-supercomplex 할당 단백질. 예상했던대로, PSI의 핵심 단백질은 모두 분수에 무한대 비율에 의해 입증 WT 샘플에서 발견된다. Lhca4가 -6 두 분수의 다른 규정을 보여 -8 동안 Lhca2 및 Lhca9은 WT에 충실. 그것은 LHCI 단백질이 ΔPSI 돌연변이 ⁽⁴¹⁾ 합성 일반적으로 축적하는 것이 중요합니다. PSI-LHCI의 폴리펩티드 비교C.에서 복잡한 ΔPSI 돌연변이의 LHCI 단지와 reinhardtii (WT)이 Lhca2의 대부분이, -3 및 -9 약하게 LHCI에 결합하고, 또한 PSI 코어의 존재가 안정적인 결합에 필요한 것 같다 것으로 나타났습니다. 반면, Lhca1, -4, -6, -7, -8은 본 실험에서 다른 Lhca4 규제, -6 -8을 설명 할 수있는, PSI ^(14)의 조립의 복잡한 독립을 형성한다.

CEF-supercomplex 할당되는 단백질의 경우, 분획 7에 대한보다 높은 비율로 표시 강한 PSI 의존 옮기는 ​​보여주는 WT 분획 6 ΔPSI 변이체의 분획 (13)에 더 풍부하고 그들 사이에서 구분 될 수 있고 보다 비율이 낮은 하나없는 부분 (13)에서 검출 (Lhcbm5, PGRL1, ANR1, CAS, PFD, HCF136 및 CYT의 F)와 같은 강한,하지만 그럼에도 불구하고 PSI에 의존하는 현지화 (FNR, FTSH1, FTSH2 및 ATPC하지 보여주는 그 ).

이 실험을 통해 테라지마 등. ⁶ CEF-supercomplex의 새로운 단백질이 이전에 ^7을 확인하지로하여 그들을 공개, ANR1 및 CAS (그림 2A-D와 그림 3)에 대한 PSI 의존 마이그레이션 동작을 보여 주었다. MS 분석의 결과는 면역에 의해 확인 및 생체 내 ⁶ CEF 이러한 단백질의 기능 역할을 확인하는 역 유전학의 응용 프로그램에 의해 지원되었다. 또한,이 비교 MS-접근 방식은 강하게 이미 표시하는 PGRL1, CYT의 F와 FNR ^7뿐만 아니라 Lhcbm5 ^7,9로 CEF-supercomplex의 일부가 입증 된 단백질을 확인하여, 이전 연구의 결과를 지원합니다 ANR1 및 CAS에 필적 자당 밀도 구배에서 PSI에 의존 현지화.

분획 10 및 ANR1 및 ΔPSI 13의 비교는 동일한 approac를 사용H (그림 S8 ⁶ 참조) ANR1에서 CEF-supercomplex 및 ΔPSI 대 실험 WT에 계시 된 단백질 ANR1, CAS 및 PGRL1에 대해 동일한 경향과 비슷한 구성을 보여 주었다. (ANR1 대 ΔPSI) 비율 6 ANR1의 단백질 비율이 ΔPSI 실험 대 WT의 비율에 비교 될 수 있지만 특히, CAS 및 PGRL1의 양이 이전의 실험에서 높은하고의 결과 일 수 있습니다 것 ANR1 ^6의 하향 조정에 대한 보상.

게다가, CEF-supercomplex 부분에 ANR1와 CAS의 농축 하나는이 실험에서 여러 가지 다른 단백질의 PSI 의존 마이그레이션을 추론 할 수있다. 이 엽록체의 광계 반응 센터 단백질 D1의 분해에 근본적인 역할을 두 개의 ATP 의존 메탈로 FTSH1 및 FTSH2있다 ^{42, 43,} 중요한 안정성 요인이거나 prefoldin 도메인 포함 단백질, HCF136, assemb광계 ^(44)의 LY와 ATP 아제의 γ 소단위. 나중에 하나, 분수 6과 13 사이의 비는 명확한 차이를 보이지 않는 반면, 추가 실험은 다른 단백질도 CEF-supercomplex의 후보가 될 수 있는지 여부를 확인하기 위해 실시해야합니다.

이 비교 방법에 대한 개념 실험의 증거로, 우리는이 복합체의 형성을 허용, 모두가 PSI이 두 균주의 CEF-supercomplex 성분을 분석했다. 각각의 분획을 분획 그라디언트 흡광도 측정에 기초하여 선택되었다.도 4a 및도 4b는 WT 및 pgrl1 녹아웃 균주 간의 양적 비교 결과를 나타낸다. 그것은 ANR1과 CAS가 현저하게 WT와 pgrl1 사이에 변경되지 않는 것을 지적해야한다. FTSH2이 pgrl1 풍부한 것 같다 흥미롭게도, HCF136은 WT에 농축 될 것으로 보인다. 통계의시(LHCI 단백질을 포함하여) 모든 PSI-서브 유닛에 상기 단백질 모두 gnificant 차이를 확인할 수 있었다.

또한, 시토크롬 B ₆ / F 복잡한 서브 유닛은 F CYT 및 피토 각각 CYT의 B _6, CYT의 B ₆ / F의 IV 및 PETC에 크게 다른 것으로 나타났다. 특히, CYT의 F는 CYT의 B ₆ CYT의 B ₆ / F의 IV는 약간 아래로 규제하는 동안 CYT의 F 합성의 조절은 아마 CYT의 B ₆ CYT의 B ₆ / F의 IV ^(45)을 포함하지만, pgrl1에서 상향 조절 될 것으로 보인다 . 또한 Rieske 단백질로 알려져 핵 인코딩 PETC는 CYT의 B ₆ CYT의 B와 유사한 규제를 보여줍니다 ₆ / F의 IV (pgrl1있는 즉, 아래로 조절). 이 Rieske 단백질의 감소 또는 부재로 비춰지고는 여전히 OTH의 축적으로 이어질어 CYT의 B ₆ / F 서브 유닛에 ~ C에서 WT 수준의 60 % reinhardtii ^46. 이 느슨하게 결합 서브 유닛이 C의 감소 수준으로 축적하는 것으로 이후 또한, pgrl1있는 피토의 위로 규칙은주의하는 것이 중요하다 reinhardtii 본 실험에서 WT에 비해 pgrl1 덜 풍부 CYT의 B _6, CYT의 B ₆ / F의 IV 또는 PETC ^47, 하나 부족한 돌연변이.

그림 1. WT와 ΔPSI에 도시 된 바와 같이, 실험 워크 플로우. 세포는 신진 대사 이상 4 대에 표시되어, 혐기성 조건은 4 시간 동안 아르곤 버블 링에 의해 유도되어 틸라코이드 막 구배 분리를 통해 격리됩니다. 솔테드 막은 자당 밀도 구배 (두 균주 엽록소 같은 양이이 단계에서 적용되는)에로드 하룻밤 원심 분리, β-DM을 사용하여 용해된다. 구배 분획을 SDS-PAGE 등 구배 내 단백질의 분포를 결정하기 위해 면역 의해 수집하고 분석 하였다. PSI에 의존 마이그레이션, WT CEF-supercomplex 분수 (분수 번호 6) 같은 부피 및 ΔPSI 변형에서 해당 ¹⁵ N-라는 부분에 단백질을 식별하기 위해 혼합 비교적 분석했다. 동일은 ΔPSI 변형 (일부 번호 13)에 ANR1의 피크 부분으로 이루어졌다. 비교 양적 MS-접근 방식, 혼합 단백질 샘플 단백질 밴드가 이전의 MS 분석에 젤 소화 한 후, 쿠마시 블루 용액으로 염색, SDS-PAGE에 의해 분리되었다. 큰 IMA를 보려면 여기를 클릭하십시오GE.

그림 2. ANR1와 CAS는 ΔPSI 변형의 저밀도 지역으로 이동한다. A :. 혐기성 조건에서 분리 WT 및 ΔPSI 틸라코이드 자당 밀도 구배가 20 분획으로 분리 된 B : WT와 ΔPSI에서 그라디언트의 20 분수에 ANR1의 면역 검출. 이 단백질은 WT에 고밀도 영역에 지역화하는 동안 (일부 6)는 ΔPSI 변형 (부분 13)에 저밀도 지역에 이동까지이며, C :. WT 및 ΔPSI 자당 밀도 구배가 분리 틸라코이드 혐기성 조건은 27 분획으로 분리 된 D :. CAS의 면역 검출을 WT 및 ΔPSI에서 그라디언트의 27 분수. 이 단백질은 t을 지역화하는 동안O (분획 7 주위 피킹) WT의 고밀도 영역은 그것 (분획 19 주위 피킹) ΔPSI 균주에서 저밀도 영역으로 시프트 업이다. (이 그림은 테라지마 등. ^6에서 수정 된). 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3. 상대 단백질 분획 6에서 결정된 비율과 양적 질량 분석에 의한 WT 및 ΔPSI 13. 분수 6 WT에서 13은 ¹⁵ N-라는 ΔPSI 균주에서 각각의 분수와 비교되었다. 같은 WT / ΔPSI ⁽¹⁴ 개의 생물 복제하고 세 MS-실행을 나타내는 상대 단백질의 비율이 그려져있다모두 N / N ^(15))는 단지 조각 6에서 식별 된 CYT의 F의 예외와 분획을 분석 하였다. 이 비교 정량화 ANR1 및 CAS (이 그림은 테라지마 등. ^6에서 수정 된). 자당 밀도 구배의 PSI 의존 마이그레이션을 보여줄 것을 보여 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4. 양적 질량 분석하여 CEF-supercomplex WT의 분수와 pgrl1 결정 상대 단백질의 비율. A : 혐기성 조건에서 고립 된 자당 (WT)의 밀도 구배 및 pgrl1의 틸라코이드 B :. 상대 단백질 비율 betweeN 개의 서로 다른 반복 실험에 따른 CEF-supercomplex 분수는 도시 WT / pgrl 1 ⁽¹⁴ N / ¹⁵ N) 등. FTSH2 및 HCF136 빨간색으로 ***로 표시된 바와 같이 0.001 ≤ 모든 PSI-서브 유닛 (P에 비해 유의 한 차이를 전시하면서이 실험에서 ANR1와 CAS는 현저하게 변경되지 않습니다 HCF136 : 1900 B ₆ / F 복잡한 서브 유닛은 F CYT과 파란색 ***로 표시된 바와 같이 피토는 CYT의 B ₆ 0.001 ≤ 각각 CYT의 B ₆ / F의 IV 및 PETC (P 크게 다른 것으로 나타났다; CYT F : 2684 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

안정 동위 원소 표지를 사용하여 다른 정량 프로테오믹스 연구는 지난 몇 년에 출판되었다​​. 이 실험에서 일반적으로 두 개의 서로 다른 샘플을 하나의 샘플이 안정 동위 원소로 표지 된의, 비교됩니다. 그 후 두 샘플에서 단백질이나 펩티드는 동일한 비율로 결합되어 더욱 함께 ⁴⁸ 가공. 이러한 연구들은 조사를 위해 다른 스트레스 조건 ^26,34,49에 노출 된 정의 고립 된 세포 구획 (예를 들어, 엽록체, 미토콘드리아, 또는 틸라코이드 막)을 비교하려는 상향 또는 하향 조절 특정 단백질의. 설명한 비교 정량 프로테오믹스 방법은 틸라코이드 막의 multiprotein의 착물의 조성을 분석하는 것을 목표로하고, 상술 한 연구는 대조적으로, 전에 동일한 엽록소 농도로로드 틸라코이드 막의 자당 밀도 분리 후 샘플의 동일한 부피의 혼합에 기초 ultracentrifuga기. 이 방법은 비교적 효과적 WT 및 자당 밀도 구배에 PSI 의존적 마이그레이션 단백질을 식별 ΔPSI 균주로부터 단리 CEF-supercomplex의 조성을 분석 테라지마 외. ^(6)에 의해 도포 하였다.

이 전략의 과제는 MS-결과는하기 추가 면역 의해 지원된다는 사실에 의해 입증된다. 또한, 테라지마 등은. 이전의 연구에서 연구 결과를 확인 할 수 있습니다 (즉, 이미 PGRL1, FNR 및 CYT f를 ^7로 CEF-supercomplex의 일부로 설명 단백질의 식별 및 PSI에 의존 마이그레이션). CEF-기계 ^(6)의 새로운 구성 요소로 ANR1와 CAS의 식별은 매우 강력하고 효율적인 도구로이 방법을 보여준다. 특히, 생체 활동에 전시 된 고립 된 CEF-supercomplex가함으로써 기능의 성공적인 정화를 시연⁶ multiprotein의 단지를 tional. 이 방법의 적용은 두 균주 CEF-supercomplex은 WT와 pgrl1 간의 비교에 의해 설명된다 형성 둘.

CEF-supercomplex 부분 (즉,에 FTSH1, FTSH2, PFD 및 HCF136의 농축과 copurified되어 이전에 알 수없는 단백질의 식별에 의해 계시 일반적으로,이 방법은 다른 변종 또는 조건의 복잡한 성분을 조사하는 데 사용할 수 있습니다 CEF-supercomplex 부분). 이 단백질이 복합체의 가능한 새로운 후보와 WT와 pgrl1의 비교에 의해 계시 FTHS2, HCF136의 다른 규정에 대한 우리의 이해를 향상시킬뿐만 아니라, CYT의 B ₆ / F 서브 유닛에 대한 여부, 추가 실험이 필요합니다.

이 방법의 기술 장점 외에, 끊다가이 프로토콜을 사용하여 작업을 할 때 신중하게 고려 될 필요가 알 중요한 단계 : 분무기와 세포의 파괴는 첫 번째 중요한 단계입니다. 세포의 열기가 적절한 방법으로 수행되지 않은 경우, 고립 된 틸라코이드의 수율이 다소 낮은 것입니다 이상 밤 원심 분리 후 CEF-supercomplex의 거의 모든 감지 될 수 있습니다. 세포의 성공적인 중단 원심 분리 후 상층 액의 밝은 녹색 색상에서 유추 할 수있다. 세포 분열시 압력이 너무 높으면 반대로, supercomplex의 부분 분해 될 수 있으며 중요한 보조 인자가 손실 될 수있다. 틸라코이드의 수율에 영향을 미치는 또 다른 공정은 도공과 셀 재 부유이다. 이주의 깊게 수행되어야하며이 단계의 끝에 만 약간 녹색 입자를 유지해야한다. 자당 밀도 준비 막 복합체의 가용화뿐만 아니라 전날 그라디언트 게다가, 그것은 매우 중요이 CEF-supercomplex의 정화도 따라서 완전히 용해 틸라코이드 ^50을 얻기 위해 매우 중요하고 있기 때문에 정확하게, β-DM 농도의 관점에서이 프로토콜을 따릅니다. 작은 흰 펠릿 이후 원심 분리 단계 후에 관찰되는 경우, 가용화 단계가 성공적으로 수행되었다. 여기에 언급해야하는 또 다른 중요한 점은 하룻밤 동안 초 원심의 시간입니다. 자당 밀도 구배는 광합성 복합체의 완전 분리를 달성하기 위해 적어도 십이시간 원심 분리되어야한다.

C. 프로토콜을 사용하여 설명된다하더라도 두 유 전적으로 서로 다른 계통의 CEF-supercomplex 성분의 비교 분석을 위해 reinhardtii, 이러한 독특한 환경 / 실험에서 분리 multiprotein의 복잡한 구성의 비교 분석과 같은 다른 질문의 넓은 범위에 쉽게 적응할 수있다조건 분별 또는 다른 유형을 이용하여. 이 방법의 유일한 요구 사항은 모델 생물은 세포 배양에서 배양 될 수 있고,이 방법의 폭 넓은 응용을 보여주는, 자당 밀도 구배에 의해 분리 될 수있는 질소원 및 단백질 복합체로서 암모니아를 사용할 수있는 것이있다. 혼합 ¹⁴ N / ¹⁵ N 샘플 및 이후의 젤 소화의이 방법 SDS-PAGE 분별의 미래 응용 프로그램의 필터 원조 샘플 준비 (FASP) 방법을 적용하여 교체 할 수 있습니다. 하나의 젤 것을 고려해야하지만이 방법은 소화하기 전에 프로테옴을 "정리"하고 정제 된 펩티드를 얻기 위해, 펩타이드 복구를 억제 할 수있는 젤 소화 방식의 단점을 방지 목표로 가용화에 대한 강한 세제​​의 응용 프로그램을 포함 소화는 소화 ^51를 방해 할 수 오염에 대한 강력한 것으로 설명되어 있습니다.

저자는 더 경쟁 금융이자를 선언하지 않습니다.

MH는 "도이치 Forschungsgemeinschaft"(DFG)의 지원을 인정합니다. 저자 공헌 : MH 연구 설계, KT, JS 및 MT 연구를 수행하고 데이터를 분석, KT와 MH는 종이를 썼습니다.