גישה חדשה לניתוח השוואתי של multiprotein מכלולים בהתבסס על

הגישה המתוארת ההשוואתית, כמותית proteomic מטרתה קבלת תובנות לתוך הרכב של מתחמי multiprotein בתנאים שונים ומודגמת על ידי השוואת זנים שונים מבחינה גנטית. ניתוח כמותי כמויות שווה של שברים שונים מצפיפות סוכרוז שיפוע מעורבבות ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה.

הפרוטוקול הציג מספק כלי לניתוח של מתחמי multiprotein בקרום thylakoid, על ידי גילוי תובנות קומפוזיציה מורכבת בתנאים שונים. בפרוטוקול זה הגישה באה לידי ביטוי על ידי השוואת הרכב של החלבון האחראי מורכב עבור זרימה מחזורית אלקטרונים (CEF) בChlamydomonas reinhardtii, מבודדת מזנים שונים מבחינה גנטית. ההליך כולל בידוד של קרומי thylakoid, ואחרי הפרידה שלהם למתחמי multiprotein ידי צנטריפוגה סוכרוז שיפוע צפיפות, SDS-PAGE, immunodetection וספקטרומטריית השוואתית, כמותית מסה (MS) המבוססת על תיוג ההפרש מטבולים ⁽¹⁴ N / ¹⁵ N) של זנים נותחו. קרומי thylakoid solubilized דטרגנט נטענים על הדרגות צפיפות סוכרוז בריכוז כלורופיל שווה. לאחר ultracentrifugation, ההדרגות מופרדות לשברים, אשר נותחו על ידי המוני spectrometר"י מבוסס על נפח שווה. גישה זו מאפשרת החקירה של הרכב בתוך השברים השיפוע ויותר מכך כדי לנתח את התנהגות הנדידה של חלבונים שונים, המתמקדת בעיקר על ANR1, CAS, וPGRL1. יתר על כן, שיטה זו באה לידי ביטוי על ידי המאשר את התוצאות עם immunoblotting ובנוסף על ידי תמיכה בממצאים ממחקרים קודמים (זיהוי וההגירה PSI תלוי של חלבונים שתוארו בעבר להיות חלק מCEF-supercomplex כגון PGRL1, FNR, ו cyt ו). יש לציין, גישה זו היא ישימה לטיפול במגוון רחב של שאלות שלפרוטוקול זה יכול להיות מאומץ ודוגמה המשמשת לניתוחים השוואתיים של קומפוזיציה מורכבת multiprotein מבודד מהתנאים סביבתיים שונים.

תהליכי פוטוסינתזה בקרומי thylakoid של צמחים ואצות יכולים לתפקד במצב ליניארי והמחזורי. במהלך זרימת אלקטרונים ליניארי photosystem (LEF) אני (PSI), photosystem השנייה (PSII) ו ₆ / ו ב ציטוכרום סופו של דבר להעביר אלקטרונים ממים לNADP ¹ +, מוביל את הדור של NADPH ו-ATP ^2. בניגוד לכך, זרימה מחזורית אלקטרונים (CEF), אשר ידועה להיות מושרה בתנאים סביבתיים מגוונים כמו תנאי מדינה 2 ³ ואנאירוביים ^4, תוצאות מחדש הירידה של PSI חמצון על ידי הזרקה של אלקטרונים בחזרה לשרשרת העברת האלקטרונים. תהליך זה יכול להתרחש גם בצד של סטרומה ב ציטוכרום המורכב ₆ / F ¹ או בבריכת plastoquinone ⁵ ומייצר ATP, אך לא NADPH ^2.

מטרת הפרוטוקול המובא היא להדגים ספקטרומטריית מסה מ '(MS) המבוססethod לניתוח ההשוואתי, כמותי של מתחמי multiprotein בקרומי thylakoid של Chlamydomonas reinhardtii לקבל תובנות לתוך הרכב של מתחמים אלה בתנאים שונים (שהודגם על ידי השוואת זנים שונים מבחינה גנטית). גישה זו יושמה בפרסום על ידי Terashima et al. ב -2012 מראה ² רגולציה ⁺ תלויה Ca של CEF ב C. reinhardtii מתווך על ידי מורכב multiprotein כוללים החלבונים CAS, ANR1, וPGRL1 ^6. ההליך יהיה להיות מוסבר על ידי ניתוח יחסית הרכב CEF-supercomplex בשני זנים שונים מבחינה גנטית, ובכך מנצל את תיוג אחד משני זנים עם חנקן כבד ⁽¹⁵ N). בקצרה, הפרוטוקול כולל בין שאר הכנת קרומי thylakoid, ואחריו solubilization חומרי ניקוי וחלוקה של מתחמי פוטוסינתזה בשיפוע צפיפות סוכרוז. לאחר חלוקה של השיפוע, נבחר fractions של שני זנים מעורבבים המבוסס על נפח שווה, מופרד על ידי-SDS ואחרי עיכול וניתוח MS כמותיים שלאחר מכן בג'ל.

כפי שהוזכר לעיל, CEF הוא מושרה בתנאים סביבתיים שונים ופרסום מהשינה 2010 מדגים את הבידוד של CEF-supercomplex פונקציונלי ממדינה 2 תאים נעולים של ג reinhardtii ^7, אשר בוצע על ידי הפרדת קרומי thylakoid solubilized בשיפוע צפיפות סוכרוז במהלך ultracentrifugation. שונה מאיוואי et al. ^7, הפרוטוקול המובא מתאר את הבידוד של CEF-supercomplex מג אנאירובי גדל תרבויות reinhardtii על ידי ביצוע הליך חלופי. זה כולל שינויים בפרוטוקול בידוד thylakoid כמו גם הבדלים הנוגעים לצעד solubilization והפרדה של קומפלקסי חלבונים על ידי ultracentrifugation. בפרוטוקול הנוכחי, קרומי thylakoidהם מבודדים על ידי יישום ההליך בהוצאת Chua וBennoun ^8, ואילו המאגרים המשמשים להכנת thylakoid ידי איוואי et al. הכיל 25 Mes מ"מ, 0.33 M סוכרוז, 5 מ"מ MgCl _2, 1.5 מ"מ NaCl (pH 6.5) כפי שתואר ^9. Solubilization בוצע עם חומר ניקוי 0.7-0.8% (n-tridecyl-β-D-maltoside) ל30 דקות על קרח במקרה של איוי ועמיתים לעבודה, ואילו בשיטת solubilization המתוארת כאן מסתמכת על השימוש בחומרי ניקוי 0.9% (n -Dodecyl-β-D-maltoside (β-DM)) והיא מבוצעת רק 20 דקות על קרח. שני הקבוצות השתמשו 0.8 מ"ג כלורופיל לכל מיליליטר לsolubilization עם חומר הניקוי המתאים. להפרדה של קומפלקסים פוטוסינתטיים מקרומי thylakoid solubilized איוואי et al. מיושם ריכוזי סוכרוז בין 0.1-1.3 M, ואילו מחברים של פרוטוקול זה משמשים ריכוזים הנעים .4-1.3 מ 'ההבדל האחרון היא מהירות צנטריפוגה, שהוא נמוך יותר בהשוואה לeaפרסום rlier.

Solubilization של קרומי thylakoid עם חומרי ניקוי nonionic אחרי חלוקה צפיפות סוכרוז שיפוע כבר הותקן במספר רב של מחקרים החל 1980s עד היום ^{7, 9-14} וגם היישום של תיוג חילוף חומרים של חלבונים הוא שיטה נפוצה בתחום פרוטאומיקה. הגישה המתוארת חלה תיוג ¹⁵ N חילוף חומרים לאחד משני הזנים בהשוואה ידי culturing אותו בנוכחותם של חנקן כבד כמקור חנקן יחיד בצורה של ¹⁵ N NH ₄ Cl, אשר שולב כל חומצות אמינו שמובילות למסה משמרת בהתאם לרצף חומצות אמינו של הפפטיד. בעת ניתוח תערובת של ¹⁴ N ^ו15 N בתוך אחד MS לרוץ, משמרת מסה זו יכולה לשמש כדי לקבוע את מקורם המדגם עבור כל הפפטיד ופפטיד היחסי ניתן לחשב שכיחותם מייצגת שכיחותם היחסית עבור להתכתבing חלבון ^15.

מחקרי פרוטאומיקה כמותיים רבים על ג reinhardtii זמין, אשר משווה כמות מוגדרת של חלבון כדי לנתח שינויים בproteome בין תנאי ניסוי (למשל שינויים בproteome בשל תזונתי ^16-19 או אור לחץ ^20,21). בהשוואה למחקרים אלה, בגישה שהוצגה כיום כמויות שווה של דגימות משולבות ונותחו. התקנה זו מאפשרת ללמוד את התנהגות הנדידה של חלבונים בתוך השיפוע ויותר מכך כדי לנתח את ההרכב של מתחמים שונים ביחס לזנים הנחקרים.

שיטה זו להיות מוסברת על ידי בעיקר להתרכז בשלושה חלבונים: המועמד הראשון הוא CAS חלבון חיישן סידן מקומי הכלורופלסט, אשר הוצג להיות מעורבים בצילום ההסתגלות בג reinhardtii ^22. סידן נחשב אות חשובהing יון למסלולים אשר מופעלים כתוצאה מלחצים ביוטיים ואביוטי שונים סופו של דבר מוביל לשינויים בביטוי גנים ותא פיזיולוגיה ²³ והוצעו כי כלורופלסטים עשויים לתרום לסלולרי Ca ^{2 +} איתות באמצעות חלבון CAS ^22,24,25. החלבון השני הוא ANR1 (תגובה אנאירובית 1 ^6), חלבון שהוצג להיגרם תחת תנאי גידול anoxic בג reinhardtii ^26. יש לציין, CAS, כמו גם ANR1 זוהו כיחידות משנה של CEF-supercomplex ויותר מכך, על ידי שימוש בגישות גנטיות הפוכה, זה היה הוכיח כי שני החלבונים תורמים מבחינה תפקודית לCEF in vivo ^6, תומכים בתפקידם כיחידות משנה תפקודית של חלבון מורכב זה. החלבון השלישי הוא חלבון thylakoid PGR5-Like 1 (PGRL1), שהוצג להיות מעורבים בCEF בChlamydomonas ^4,27 כמו גם בארבידופסיס ^5,28 והיה גם identified בעבודתו של אל איוואי et. ⁷

גישה זו יוצגו על ידי המציג את התוצאות של שני ניסויים שונים: wildtype (WT) לעומת זן ΔPSI ²⁹ (לעומת), מציג מחיקה של גן psab, קידוד לphotosystem החיונית למקטע, שהוא גם חלק מ CEF-supercomplex וWT לעומת pgrl1 עקום החוצה רצף ^4. עבור כל אחד מניסויים אלה בהרכב הכמותי של CEF-supercomplex בין ¹⁵ N-ומתח ¹⁴ N שכותרתו הושווה.

1. Culturing של Chlamydomonas

1. ג הבא reinhardtii זנים ששימשו במחקר הנוכחי: cc124 WT, cw15-arg7 WT (auxotroph הלקוי וארגינין תא קיר), זן ΔPSI מוטציה ²⁹ ומתח עקום החוצה pgrl1 ^4.
2. כל הזנים גדלו בטריס-אצטט פוספט (TAP) בינוני ^30, ב ° C25 בעוצמה מתמשכת אור 20-50 μE / מ ² שניות ורועד ב120 סל"ד. התרבות של ΔPSI צריכה להיות עטופה בנייר אריזה דק לחשיפה לאור של <5 μE / מ ² שניות.
3. התרבויות של זני שכותרתו (ΔPSI וcc124 WT, בהתאמה) הכילו 7.5 מ"מ ¹⁵ N NH ₄ Cl, ואילו התרבויות לזני nonlabeled (WT cw15-arg7 וpgrl1, בהתאמה) הכילו 7.5 מ"מ ¹⁴ N ₄ Cl NH. תאים צריכים לגדול במשך לפחות ארבעה generatיונים כדי להשיג את תיוג ומלא חייבים להיות כל הזמן בשלב צמיחה מעריכית.
4. ביום שלפני תחילת הניסוי לספור ולדלל תאים לצפיפות של 1 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר בנפח של לפחות 750 מיליליטר / מתח.

שים לב ששני סוגים של מילויים צפיפות סוכרוז רציפים מתוארים בפרוטוקול הבא. הדרגתיים בצפיפות סוכרוז photosystem פי טקהאשי et al. ⁹ משמשים להפריד קומפלקסי חלבוני פוטוסינתזה השונים מthylakoids המבודד וsolubilized במהלך צנטריפוגה על הלילה וצריך להיות מוכן היום לפני (ראה פרוטוקול 2) והדרגתי בצפיפות סוכרוז thylakoid ⁸ מיושמים בהליך בידוד thylakoid (ראה פרוטוקול 3).

2. הכנת עירובי צפיפות photosystem סוכרוז

1. למילוי הדרגתיים שלושה פתרונות מניות יש צורך:
   1. 2 M סוכרוז
   2. 10% β-DM בH ₂ O
   3. 0.5 M tricine, pH 8.0 (NaOH)
2. באמצעות מניות אלה, להכין את הפתרונות הבאים:

   ריכוז:	1.3 M	1.0 M	0.85 M	0.7 M	0.65 M	0.4 M
   2 M סוכרוז	13 מיליליטר	10 מיליליטר	8.5 מיליליטר	7 מיליליטר	6.5 מיליליטר	4 מיליליטר
   10%46;-DM	100 μl	100 μl	100 μl	100 μl	100 μl	100 μl
   0.5 M tricine	200 μl	200 μl	200 μl	200 μl	200 μl	200 μl
   H 2 O	6.7 מיליליטר	9.7 מיליליטר	11.2 מיליליטר	12.7 מיליליטר	13.2 מיליליטר	15.7 מיליליטר

3. השתמש בצינורות צנטריפוגה x 89 מ"מ 14 מ"מ ויוצקים הדרגתיים לאט לאט, מתחיל עם פתרון צפיפות סוכרוז הגבוה ביותר לפתרון צפיפות נמוך יותר.
4. יוצקים רק 1 מיליליטר כל אחד ל1.3 ו1.0 M פתרונות ו2 מ"ל לשאר הפתרונות.
5. השאר הדרגתיים לילה בחדר הקר.

3. אנאירובי אינדוקציה ובידוד של Thylakoid ממברנות ⁸

1. לפני שמתחיל עם הבידוד של קרומי thylakoid, לגרום לתנאים אנאירוביים ידי מבעבע עם ארגון במשך 4 שעות. המבעבע יכול להתבצע באמצעות פיפטה זכוכית בculturing צלוחיות עם ערבוב מתמיד של התרבות עם בר ומערבב מגנטי.
2. התחל עם הבידוד של קרומי thylakoid ידי pelleting התאים 5 דקות ב2,500 XG, resuspend במאגר H1 (0.3 M סוכרוז, 25 HEPES מ"מ (pH 7.5), 5 מ"מ MgCl _2).
   (שים לב שכאשר מתחילים עם הבידוד של sh דגימות קרומי thylakoidולד לשמור על קרח, כדי למנוע פירוק חלבונים, בכל צעדי צנטריפוגה מבוצעים על 4 מעלות צלזיוס ועבודה עם כפפות מומלצת בחום כדי למנוע זיהום קרטין).
3. תאים גלולה במשך 5 דקות ב2,500 XG, resuspend במאגר H1.
4. לשבור את התאים עם שני קטעים באמצעות nebulizer עם לחץ חנקן של 1,500 hPa (לזנים ללא דופן תא לעשות רק קטע אחד).
5. ספין למטה תאים למשך 7 דקות ב2,500 x גרם.
   (לאחר שלב זה supernatant צריך להיות בצבע ירוק בהיר, אם לא, שבירת התא לא הייתה מוצלחת.)
6. תאי resuspend במאגר H2 (0.3 M סוכרוז, 5 מ"מ HEPES (pH 7.5), 10 mM EDTA (pH 8.0)) ותאי גלולה 10 דקות ב 32,800 x גרם.
7. תאי resuspend במאגר H3 (1.8 M סוכרוז, 5 מ"מ HEPES (pH 7.5), 10 mM EDTA (pH 8.0)) וhomogenize גלולה קדר (אין חלקיקים ירוקים צריכים להישאר בסופו של שלב זה עובד) עם.
8. הכן הדרגתיים צפיפות סוכרוז thylakoid באמבטיהes (25 מ"מ x 89 מ"מ) על ידי הפעלה בתחתית בשכבה של 12 מיליליטר H3 חיץ עם תאים, יוצק שכבה אמצעית של 12 מיליליטר חיץ H4 (1.3 M סוכרוז, 5 מ"מ HEPES (pH 7.5), 10 mM EDTA ( pH 8.0)) ועל חיץ H5 העליון 12 מיליליטר (0.5 M סוכרוז, 5 מ"מ HEPES (pH 7.5), 10 mM EDTA (pH 8.0)). היזהר בעת המזיגה הדרגתיים ולהימנע מהערבוב של שלוש שכבות.
9. איזון עם H5 חיץ והדרגות צפיפות צנטריפוגה thylakoid סוכרוז לשעה 1 ב70,700 x גרם.
10. הסר להקות thylakoid מהדרגות צפיפות סוכרוז thylakoid ולדלל אותם עם מאגר H6 הנפח מתאים (5 HEPES מ"מ (pH 7.5) 10 mM EDTA (pH 8.0)).
11. ספין למטה תאים ב XG 37,900 עבור 20 דקות. אם גלולה היא לא חזק, יותר חיץ H6 נדרש לצעד צנטריפוגה זו.
12. Resuspend thylakoids בחיץ H6 נפח קטן ולהמשיך בנחישות של ריכוז כלורופיל.

4. קביעת ריכוז הכלורופיל ^{ביום 31}

1. קביעת סכום כלורופיל מתבצעת עם אצטון 80%.
2. מערבבים 995 μl אצטון 80% ו -5 μl של thylakoids במאגר H6 (דילול 1:200).
3. וורטקס במשך כמה שניות עד שלא יישארו חלקיקים ירוקים ולאחר מכן ספין למטה ב14.1 XG במשך 5 דקות.
4. קח את supernatant ולמדוד את ההכחדה ב663.6 ו646.6 ננומטר ו750 ננומטר, בהתאמה.
5. לחשב את כמות הכלורופיל באמצעות נוסחאות הבאות:
   1. (- _{646,6 0,00255} * E * E .01225 _663.6) גורם לדילול * C _Chl [מ"ג / מיליליטר] =
   2. C _Chl [מ"ג / מיליליטר] _b = (.02031 * E _{646.6-0.00491} * _663.6 E) גורם לדילול *
   3. C _Chl [מ"ג / מיליליטר] = C _Chl C + _{Chl ב}

5. טעינה של עירובי צפיפות photosystem סוכרוז

1. לחשב את סכומי thylakoids, β-DM וחיץ H6 כי יש צורךלכל צבע:
   1. כל שיפוע צריך להיות עמוס בנפח כולל של 700 μl עם 0.8 מ"ג / מיליליטר כלורופיל ב0.9% β-DM (לפזר β-DM בH ₂ O), למלא את הנפח שנותר עם ​​חיץ H6.
2. לsolubilization להכין aliquots שונים עם thylakoids, β-DM וחיץ H6 לכל שיפוע.
3. עזוב את הדגימות ל20 דקות על קרח עם ערבוב באופן קבוע (היפוך) כל (צעד solubilization) כמה דקות.
4. צנטריפוגה במהירות המרבית (14,000 XG) במשך 10 דקות ב 4 ° C.
   (לאחר צנטריפוגה, גלולה צריכה להיות קטנה ולבנבן ואילו את supernatant הוא ירוק כהה.)
5. טען supernatant על ההדרגות.
6. איזון עם H6 חיץ וספין באמצעות ultracentrifuge ב134,470 XG הלילה (14 hr) ב 4 ° C.
   (שים לב שההפרדה המוצלחת של קומפלקסים פוטוסינתטיים באמצעות הדרגתיים צפיפות סוכרוז photosystem כפי שהוצג בפרוטוקול זה היא השיג רק כשמנצלגרם מבודד טרי thylakoids, שכן חיזוי לsolubilization והפרדה מורכבת קשה לעשות כאשר עובד עם ממברנות thylakoid שהוקפאו בעבר.)

6. חלוקה של עירובי צפיפות photosystem סוכרוז

1. קח תמונות של ההדרגות.
2. לנקב חור בחלק התחתון של הצינור באמצעות מחט והדרגות fractionate ב500 צינורות μl. לחלופין, חלוקה יכולה גם להתבצע באמצעות צלחת 96 היטב (microplate).
3. בעת השימוש בmicroplate, לקבוע הספיגה של השברים שיפוע השונים ב675 ננומטר.
   (בדגימות שלב זה ניתן לאחסן ב-80 ° C לכמה שבועות.)

7. SDS-PAGE וimmunodetection

(שים לב שרק להשוואה של WT לעומת ΔPSI ניתוח כתם מערבי שבוצע כדי לבחור את השברים עבור MS-ניתוח שלאחר מכן. לניסוי WT לעומת pgrl1 frפעולות נבחרו בדרך של הספיגה בברים השונים.)

1. 30 μl הנפרד של כל חלק משיפוע WT וΔPSI על 13% ג'ל polyacrylamide SDS ^32.
2. ביצוע ניתוח כתם מערבי ³³ באמצעות הנוגדנים הבאים: ANR1 (TEF7) ^26, PGRL1 ^34, CAS ^6, PSAD מקטע PSI ³² וD1 מקטע ליבת PSII. השתמש בכל הנוגדנים עם דילול של 1:1,000 (לטכניקת זיהוי chemiluminescence משופרת), פרט לנוגדן D1, שאמור להיות בשימוש עם דילול של 1:10,000.
3. בהתבסס על התוצאות של immunodetection, לקחת את שברי השיא של ANR1, PGRL1 וPSAD לWT וΔPSI (כאן שברים 6 ו13, בהתאמה), לערבב 30 μl של שבריר 6 מ WT וΔPSI ולעשות את אותו הדבר עם חלק מ13 שני ההכנות ולהפריד אותם שוב על 13% ג'ל polyacrylamide SDS.
4. להשוואת כמותית של WT לעומת pgrl1 לקחת Cשברים EF-supercomplex כפי שנקבע על ידי מדידת הספיגה בשברי שיפוע השונים ומערבבים 30 μl של שני הדגימות ואחרי הפרדה על 13% ג'ל polyacrylamide SDS.
5. כתם להקות חלבון עם פתרון Coomassie (85% חומצה זרחנית, אמוניום סולפט 757 מ"מ, .1.2% מתנול Coomassie כחול מבריק, 20%) עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר או מעל הלילה ב 4 ° C.
6. כדי להסיר כתמים נוקבים, לשטוף מספר פעמים עם DDH ₂ O.
7. חותכים את הנתיבים לחתיכות ג'ל 1 מ"מ ולהמשיך בעיכול בג'ל.
   (לחלופין, יכולות להיות מיובשות דגימות כמה דקות בצנטריפוגה בואקום ומאוחסנות במשך כמה שבועות לפני שתמשיך בעיכול בג'ל.)

8. עיכול בג'ל (השתנה מבצ'נקו et al. ³⁵⁾

שים לב להכין את כל המאגרים ופתרונות זמן קצר לפני השימוש ולקחת את בקבוקי זכוכית עבור מאגרים המכילים אצטוניטריל (ACN).
זהירות! עבודה עם ACN עלולה להיות מזיקה; מידע נוסף ניתן להוריד מ: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927335 (2013).

1. לשטוף חתיכות ג'ל עם> 10 כרכים של DDH ₂ O (~ μl 200) ל30 שניות.
2. דגירה חתיכות ג'ל עם 300 μl של 25 מ"מ NH ₄ HCO ₃ דקות ל15 עם רעד, להסיר נוזלי.
3. דגירה חתיכות ג'ל עם 300 μl של 25 מ"מ NH ₄ HCO ₃ ב50% ACN (להכין על ידי ערבוב ACN ו50 מ"מ NH ₄ HCO ₃ ביחס של 1:1) לדקות 15 עם רעד, להסיר נוזלי.
4. אם חתיכות ג'ל עדיין כחולות, חזור על NH ₄ HCO ₃ וNH ₄ HCO ₃ / ACN שוטף עד שרוב Coomassie מוסר.
   (למרות שחלק הארי של מכתים Coomassie יש להסיר, זה לא הכרחי לdestain חתיכות ג'ל לחלוטין.)
5. הוספה של ACN 100 μl מייבש את חתיכות ג'ל למשך 5 דקות. חתיכות ג'ל צריכה לכווץnd נראה לבן לגמרי.
6. להסיר כמה שיותר ACN ככל האפשר ולהמשיך בעיכול טריפסין. לחלופין, ניתן לאחסן דגימות ב-20 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות.
7. הוספת 10-20 μl ללהקה של 20 ng / μl טריפסין ב10% ACN / 25 מ"מ NH ₄ HCO ₃ (טרי מדולל), לשמור על דגימות קרח.
8. לאחר 30 דקות, לבדוק אם כל הפתרון היה שקוע ולהוסיף עוד חיץ טריפסין, במידת צורך. חתיכות ג'ל צריכה להיות מכוסות לחלוטין עם חיץ טריפסין. שמור דגימות על קרח.
9. השאר חתיכות ג'ל לעוד 90 דקות על קרח כדי להרוות אותם עם טריפסין.
   (שלב קריטי: התשואה של פפטידים tryptic מגדילה באופן משמעותי עם הגדלת פעמים דגירה על קרח, כנראה בגלל דיפוזיה האיטית של האנזים לתוך מטריצת polyacrylamide זה יש צורך יש עודף קטן של פתרון המכסה את חתיכות ג'ל, כדי למנוע שהחתיכות. נופל יבש במהלך הדגירה הלילה.)
10. לעכל ב37 מעלות צלזיוס למשך 4-6 שעות. לניסויים הדורשיםהתאוששות הפפטיד מקסימלי, לעכל בן לילה.
11. לאחר עיכול ספין למטה חיץ מרוכז.
12. צינורות Sonicate במשך 5 דקות כדי elute פפטידים ו צנטריפוגות שוב.
13. איסוף supernatant ולהעביר אותו לצינור חדש.
14. מבצע חילוץ פפטיד עם 80 μl של 30% ACN 1% חומצה / פורמית (FA) באמבטיה קולית ל15 דקות.
15. מבצע חילוץ עם 80 μl של 30% ACN / 1% FA באמבטיה קולית ל15 דקות.
16. מבצע חילוץ עם 80 μl של 70% ACN / 1% FA באמבטיה קולית ל15 דקות.
17. שוב וsupernatant הבריכה צנטריפוגה עם eluate המוקדם.
    (FA משמש כדי להשבית טריפסין ולהגדיל את מסיסות פפטיד).
18. פתרון פפטיד יבש בצנטריפוגה ואקום לחלוטין.
    (בשלב זה ניתן לאחסן דגימות במשך כמה שבועות ב-20 מעלות צלזיוס לפני שתמשיך עם MS-ניתוח.)
19. פפטידים resuspend ב 6 μl MS חיץ (5% ACN, 0.1 V / V-FA, מים) וsonicate במשך 2-5 דקות.
20. צנטריפוגה דגימות maximuמהירות מ 'במשך 5 דקות כדי להסיר את חלקיקי חומר.
21. השתמש 4 μl של supernatant לניתוח ספקטרומטריה.

9. MS-ניתוח נתונים עם "Proteomatic"

ניתוח הנתונים בוצע עם תוכנת קוד הפתוח "Proteomatic" (אשר ניתן להוריד בhttp://www.proteomatic.org/), פלטפורמה המאפשרת לדור והשלמת צינורות הערכת נתונים MS / MS, באמצעות תוכנה מסחרית וחופשית ^36. בקצרה, ההגדרות מתוארות להלן ניתן למצוא מידע מפורט יותר ^ב6,26.

1. זיהוי וכימות של MS-נתונים
   זיהוי וכימות של חלבונים מWT הניסויים לעומת ΔPSI נעשו עם OMSSA (גרסת 2.1.4 ^{37) ו26} qTrace, בהתאמה, כפי שתוארו ^6,26. לניתוח MS-נתונים מהניסוי לעומת WT pgrl1 המעודכן הצינור הבא היה בשימוש:
   1. בנוסף לOMSSA ^37, חלבונים זוהו גם עם X! טנדם (גרסה 2013/02/01 ^38). שני האלגוריתמים יושמו על ידי חיפוש במסד נתונים שנוצרו על ידי שילוב של גרסת בסיס הנתונים מודל גן JGI Chlamydomonas 4.3 עם גרסת מסד הנתונים של אוגוסטוס 10.2 כמו גם מול מסד נתונים הצטרפו של צמח השדה מסדי נתונים BK000554.2 וNC_001638.1.
   2. MS ² זיהוי של פפטידים בוצע על ידי שימוש בגישה יעד דמה ^39. דמה עבור כל חלבון שנוצר על ידי באופן אקראי דשדוש פפטידים tryptic תוך שמירה על היתירות של פפטידים nonproteotypic.
   3. אימות סטטיסטי של פפטידים בוצעה עם qvality התוכנה (גרסת 0.3.3 ⁴⁰⁾ באמצעות הסתברות שגיאה אחורית (PEP) סף של פחות מ 0.01 והתוצאות סוננו עם סובלנות המונית מבשר של 5 עמודים לדקה.
   4. פפטידים מOMSSA ו-X! ריצות טנדם הצטרפו ולכמת עם qTrace ^{26 החלת צעדי המסנן הבא: דורשים MS 2 זיהוי, להוסיף שמות חלבון / מידע על קבוצה ודורשים גם פפטידים האחות.}

כדי לחקור האם יחסי חלבון היו שונים משמעותי אחד כלפי שני בשברי CEF-supercomplex המעורבים מWT וpgrl1, ניתוח סטטיסטי בוצע יישום SPSS התוכנה (גרסת 21). יחידות משנה של מתחם ₆ / f ציטוכרום b נבדקו אחד נגד שני, כמו גם החלבונים FNR, FTSH2 וHCF136 נגד תת יחידות PSI. יחסי פפטיד של כל ספירת סריקה לכל חלבון מכל ארבעת משכפל נבדקו התפלגות נורמלית עם מבחן שהפיר-ילקס. מאז אוכלוסיות פפטיד לא מתפלגות נורמלי (p <0.001), סטטיסטיקה פרמטרית בוצעה. ראשית, מבחן קרוסקל-ארהב יושם הערכת הבדלים משמעותיים בין קבוצות. רק אם בדיקה זו ניבאה הבדל משמעותיים בין קבוצות, ניתוח נוסף בוצע על מנת לחזות הבדלים משמעותיים בין שתי קבוצות בלתי תלויות עם מבחן מאן ויטני-U.

גישת פרוטאומיקה כמותיים הציגה מטרה לאפיין את ההרכב של מתחמי multiprotein בקרומי thylakoid הודגמו על ידי הניתוח ההשוואתי של רכיבי CEF-supercomplex בג שונה מבחינה גנטית reinhardtii זנים. השיטה המתוארת בהצלחה יושמה על ידי Terashima et al. ⁶ וכוללת את הבידוד של קרומי thylakoid מתרבויות אנאירובי גדל, ואחריו solubilization חומרי ניקוי. בהמשך לכך, דגימות הועמסו על צפיפות סוכרוז שיפוע המבוססת על כמות כלורופיל שווה ומתחמים המופרדים על ידי ultracentrifugation. עבור MS-הניתוח כמוני כמויות שווה של שני שברים שיפוע מזנים שונים מעורבבות ויחסית ניתחו (איור 1). התוצאות שהוצגו כוללות השוואה של שבריר CEF-supercomplex בין WT cw15-arg7 וΔPSI כמו גם cc124 WT וpgrl1, בהתאמה.

ילדה = "jove_content"> להשוואה של מרכיבי CEF-supercomplex בין WT ושבריר מתח ΔPSI 6, מחסה CEF-supercomplex בWT והשבריר 13, שבריר השיא של ANR1 במתח ΔPSI, כפי שנחשף על ידי ניתוח immunoblot (2 א דמויות ו2B) נבחרו ^6. איור 3 מתאר את יחסי חלבון היחסי כWT / ΔPSI ⁽¹⁴ N / ¹⁵ N) במשך כמה ליבת PSI וחלבונים LHCI (חלבוני קצירת אור של PSI גם בשם חלבוני Lhca), כמו גם לחלבונים שהוקצו עם CEF-supercomplex. כצפוי, חלבוני ליבת PSI נמצאים רק בדגימות WT שהפגינו יחס אינסוף בשני השברים. Lhca2 וLhca9 מועשרים בWT, בעוד Lhca4 -6 ו-8 להראות רגולציה שונה בשני השברים. חשוב לציין כי חלבוני LHCI מסונתזים ונצברו בדרך כלל במוטצית ΔPSI ^41. השוואת פוליפפטיד של PSI-LHCIמורכב מג WT reinhardtii עם מורכב LHCI של המוטציה ΔPSI חשף כי הרוב המכריע של Lhca2 נראה, -3 ו -9 להיות רק קשור בחולשה לLHCI ויותר מכך שהנוכחות של ליבת PSI היא הכרחית ליציבות מחייבת. לעומת זאת, Lhca1, -4, -6, -7, ו-8 בצורה עצמאית מורכבת של ההרכבה של PSI ^14, מה שיכול להסביר את הרגולציה שונה של Lhca4, -6 ו -8 בניסוי הנוכחי.

לחלבונים ליוקצו עם CEF-supercomplex, זה יכול להיות הבחין בין אלה שנמצאים בשפע יותר בשבריר WT 6 ושבריר 13 של המוטציה ΔPSI, מראה הגירת PSI תלוי חזקה מוצגת על ידי יחס גבוה יותר מפעם אחת לשבריר 6 ו יחס נמוך יותר מאחד או לא זוהה בשבריר 13 (Lhcbm5, PGRL1, ANR1, CAS, PFD, HCF136 וו cyt) ואלה מראים לא (FNR, FTSH1, FTSH2, וATPC כל כך חזק, אבל בכל זאת לוקליזציה PSI תלוי ).

עם הניסוי הזה Terashima et al. ⁶ הפגינו PSI תלוי הגירת התנהגות לANR1 וCAS (איורים 2A-D ו איור 3), ובכך חושפים אותם כחלבונים חדשים של CEF-supercomplex, בעבר לא זיהו ^7. הממצאים של MS-הניתוח גם אושרו על ידי immunodetection ונתמך על ידי היישום של גנטיקה הפוכה כדי לאשר תפקיד פונקציונלי של חלבונים אלה לCEF in vivo ^6. יתר על כן, MS-גישה השוואתית זו תומכת בתוקף בתוצאות ממחקרים קודמים, על ידי המאשר את החלבונים שכבר הוכיחו להיות חלק מCEF-supercomplex כגון PGRL1, f cyt ^ו7 FNR, כמו גם Lhcbm5 ^7,9 להראות לוקליזציה PSI תלוי בשיפוע צפיפות סוכרוז, אשר ניתן להשוות ANR1 וCAS.

ההשוואה של חלק 6 ו13 של anr1 וΔPSI תוך שימוש באותה approacשעות (ראה איור S8 ⁶⁾ הפגינו הרכב דומה של CEF-supercomplex בanr1 והמגמה זהה לחלבוני ANR1, CAS וPGRL1 כפי שנחשף בניסוי WT לעומת ΔPSI. יש לציין,, נראים את סכומי CAS וPGRL1 למרות יחס החלבון של ANR1 בשבריר 6 (anr1 לעומת ΔPSI) ניתן להשוות את היחס של WT לעומת ניסוי ΔPSI להיות גבוה יותר בניסוי הקודם ויכולים להיות תוצאה של פיצוי עבור למטה הרגולציה של ANR1 ^6.

חוץ מזה, העשרת ANR1 וCAS בשבריר CEF-supercomplex אפשר גם להסיק את הגירת PSI תלוי של מספר חלבונים אחרים מניסוי זה. אלה הם שני metalloproteases תלוי ATP FTSH1 וFTSH2 כי לשחק תפקיד מהותי בשפלה של D1 חלבון מרכז תגובת PSII בכלורופלסטים ^42,43, חלבון prefoldin תחום המכיל, HCF136, שהוא גורם מכריע ליציבות או נאסף בנוסףly של PSII ⁴⁴ ומקטע γ של ATPase. ואילו לאחד מאוחר יותר, היחסים בין החלק 6 ו13 לא מראים הבדל כזה ברור, ניסויים נוספים צריכים להתבצע כדי לבדוק אם חלבונים האחרים עשויים גם להיות מועמדים של CEF-supercomplex.

כהוכחה לניסוי רעיון לגישה השוואתית זו, נתחנו את הרכב CEF-supercomplex בשני זנים, אשר לשניהם יש PSI, מה שמאפשר את היווצרות מורכבת זו. שברים המתאימים נבחרו על בסיס המדידות ספיגת של הדרגתיים המופרד. איורים 4 א ו -4 ב להראות את התוצאות להשוואת כמותית בין WT ומתח עקום החוצה pgrl1. יש לציין כי ANR1 וCAS לא השתנו להפליא בין WT וpgrl1. מעניין, HCF136 נראה להיות מועשר בWT, בעוד FTSH2 נראה להיות מועשר בpgrl1. Si סטטיסטיהבדל gnificant עבור שני חלבונים הנ"ל לכל PSI-יחידות משנה (כולל חלבוני LHCI) יכול להיות אישר.

יתר על כן, ₆ / יחידות משנה מורכבות ו ציטוכרום b CYT f ופטו הוצגו להיות שונה באופן משמעותי לcyt ב _6, ב cyt IV ₆ / f וPETC, בהתאמה. יש לציין, נראה f cyt להיות מוסדר עד-בpgrl1, בעוד cyt ב ₆ ורביעי ₆ / f ב cyt מעט למטה מוסדר, אם כי הרגולציה של סינתזה ו cyt כנראה כרוך cyt ב ₆ וcyt ב IV ₆ / f ⁴⁵ . PETC קידוד הגרעיני, שידוע גם בשם חלבון Rieske תערוכות רגולציה דומה כמו cyt ב ₆ וcyt ב ₆ / f IV (כלומר למטה רגולציה בpgrl1). זה בולט כמו ירידה או היעדר חלבון Rieske עדיין להוביל להצטברות של oth₆ / יחידות משנה ו cyt אה ב ~ 60% מרמת WT בג reinhardtii ^46. בנוסף, עד הוויסות של פטו בpgrl1 חשוב לציין, שכן מקטע קשור באופן רופף זה הוצג לצבור לרמות נמוכות בג reinhardtii מוטנטים החסרים גם ב cyt _{6, 6} / IV ו cyt b או PETC ^47, שהנם פחות נפוצים בpgrl1 לעומת WT בניסוי הנוכחי.

איור 1. זרימת עבודה ניסויית כמתואר לWT וΔPSI. תאים מסומנים מטבולית לפחות ארבעה דורות, תנאים אנאירוביים הנגרמים על ידי בעבוע ארגון במשך 4 שעות והקרומים thylakoid מבודדים באמצעות הפרדת שיפוע. Isolaקרומי טד solubilized באמצעות β-DM, הועמס על שיפוע סוכרוז צפיפות (עבור שני זני כמויות שווים של כלורופיל מיושמות בשלב זה) וcentrifuged לילה. השברים השיפוע שנאספו ונותחו על ידי SDS-PAGE כמו גם immunodetection כדי לקבוע החלוקה של חלבונים בתוך הצבע. כדי לזהות חלבונים עם הגירת PSI תלוי, כמויות שווה של שבריר WT CEF-supercomplex (מספר שבריר 6) ^ו15 שבריר N שהכותרת המתאים מזן ΔPSI היו מעורבים וניתח יחסית. כך נעשה גם עם שבר השיא של ANR1 במתח ΔPSI (חלק מספר 13). עבור MS-הגישה ההשוואתית, כמוני, דגימות חלבון המעורבות הופרדו על ידי-SDS, להקות חלבון הוכתמו פתרון כחול Coomassie, ואחרי עיכול בג'ל לפני MS-ניתוח. לחצו כאן לצפייה בהר"י הגדול יותרge.

איור 2. ANR1 וCAS להגר לאזורים נמוכה יותר בצפיפות בזן ΔPSI. :. הדרגתיים בצפיפות סוכרוז של thylakoids WT וΔPSI מבודד מהתנאים אנאירוביים הופרדו ל20 שברים B: immunodetection של ANR1 ב20 השברים של השיפוע מWT וΔPSI. בעוד חלבון זה הוא מקומי באזור גבוהה יותר בצפיפות בWT (חלק 6) זה השתנה עד לאזורים נמוכה יותר בצפיפות בזן ΔPSI (חלק 13) C:. הדרגתיים בצפיפות סוכרוז של WT וΔPSI thylakoids מבודד תנאים אנאירוביים הופרדו ל27 שברים D:. immunodetection של CAS ב27 השברים של השיפוע מWT וΔPSI. בעוד חלבון זה הוא מקומי לאo האזור גבוהה יותר בצפיפות בWT (שהגיע לשיא סביב חלק 7) הוא עבר עד לאזורים נמוכה יותר בצפיפות בזן ΔPSI (שהגיע לשיא סביב שבריר 19). (נתון זה שונה מTerashima et al. ^6). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

יחסי איור 3. יחסית חלבון שנקבעו בחלק 6 ו13 מWT וΔPSI על ידי ספקטרומטריית מסה כמותית. ברים 6 ו13 מWT כבר בהשוואה לשברים בהתאמה מזן ΔPSI ¹⁵ N שהכותרת. יחס החלבון היחסי שמייצגים שני משכפל ביולוגי ושלוש MS-ריצות מתוארים כWT / ΔPSI ⁽¹⁴N / ¹⁵ N) עבור שניהם ניתח שברים למעט f cyt, שזוהתה רק בחלק 6. כימות השוואתי מגלה כי ANR1 וCAS להראות הגירת PSI תלוי בשיפוע צפיפות סוכרוז (נתון זה שונה מTerashima et al. ^6). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 4. יחסי חלבון יחסית שנקבעו בשבריר CEF-supercomplex של WT וpgrl1 על ידי ספקטרומטריית מסה כמותית. : הדרגתיים סוכרוז צפיפות של WT וthylakoids pgrl1 מבודד מהתנאים אנאירוביים B:. יחסי חלבון יחסית between תאר את שבר CEF-supercomplex נובע מארבע חזרות שונות כמו WT / pgrl 1 ⁽¹⁴ N / ¹⁵ N). בניסוי זה ANR1 וCAS לא השתנו להפליא, בעוד FTSH2 וHCF136 תערוכת הבדלים משמעותיים בהשוואה לכל PSI-יחידות משנה (p ≤ 0.001 כפי שצוין על ידי *** באדום; HCF136: 1900 ₆ / יחידות משנה מורכבות f cyt ב CYT f ופטו הוצג להיות שונה באופן משמעותי מcyt ב _6, IV cyt ב ₆ / f וPETC, בהתאמה (p ≤ 0.001 כפי שצוין על ידי *** בכחול; cyt f : 2684 לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

מחקרי proteomic כמותיים שונים באמצעות תיוג איזוטופ יציב כבר פורסמו בשנים האחרונות. בניסויים אלה בדרך כלל שני מדגמים שונים בהשוואה, מתוכם מדגם אחד מתויג עם איזוטופ יציב. לאחר מכן חלבונים או פפטידים משני המדגמים משולבים ביחס שווה ומעובד יחד נוסף ^48. מחקרים כאלה לעתים קרובות מתכוונים להשוות תאים מוגדרים מבודדים סלולריים (למשל כלורופלסטים, מיטוכונדריה, או קרומי thylakoid) נחשפו לתנאי עקה שונים ^26,34,49 לחקור למעלה או למטה רגולציה של חלבונים מסוימים. הגישה המתוארת ההשוואתית, כמותית proteomic שואפת לנתח את ההרכב של מתחמי multiprotein בקרום thylakoid ו, בניגוד למחקרים האמורים, מבוססת על ערבוב באותו הנפח של דגימות לאחר הפרדת צפיפות סוכרוז של קרומי thylakoid נטענת בריכוז כלורופיל שווה בפני ultracentrifugation. שיטה זו יושמה בצורה יעילה על ידי Terashima et al. ⁶ שיחסית ניתחו את ההרכב של CEF-supercomplex מבודד מWT ומתח ΔPSI לזהות חלבונים נודדים PSI-dependently בשיפוע צפיפות סוכרוז.

ההישג של אסטרטגיה זו מוכח על ידי העובדה כי MS-התוצאות נתמכו גם על ידי immunodetection. בנוסף, Terashima et al. יכול לאשר את הממצאים ממחקרים קודמים (כלומר הגירת זיהוי וPSI תלוי של חלבונים שתוארו כבר להיות חלק מCEF-supercomplex, כגון PGRL1, FNR, ו f cyt ^7). זיהוי של ANR1 וCAS כרכיבי רומן של CEF-המכונות ⁶ מגלה גישה זו ככלי חזק מאוד ויעיל. יש לציין, CEF-supercomplex המבודד הוצג בפעילות חוץ גופית, ובכך הוכיח את הטיהור המוצלחת של פונקציהtional multiprotein מורכב ^6. תחולתה של גישה זו גם לשני זנים של שהן יוצרת CEF-supercomplex בא לידי ביטוי בהשוואה בין WT וpgrl1.

באופן כללי, בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לסקור קומפוזיציות מורכבות בזנים או תנאים שונים כפי שהיא מתגלה על ידי זיהוי של חלבונים שלא זוהו בעבר כי הם copurified עם שבריר CEF-supercomplex (כלומר העשרת FTSH1, FTSH2, PFD, וHCF136 ב שבריר CEF-supercomplex). אם חלבונים אלה הם מועמדים אפשריים חדשים של מורכבות זו וכדי לשפר את ההבנה שלנו להסדרת FTHS2, HCF136 שונה, כמו גם עבור ₆ / יחידות משנה ו cyt b כפי שנחשפו על ידי ההשוואה של WT וpgrl1, ניסויים נוספים נדרשים.

מלבד היתרונות שתוארו בגישה זו, יש לנתקצעדי אל קריטיים שצריכים להילקח בחשבון בזהירות בעת עבודה עם פרוטוקול זה: שבירת תאים עם nebulizer היא הצעד החשוב הראשון. אם פתיחת התאים לא מתבצעת באופן תקין, התשואה של thylakoids הבודד תהיה נמוכה למדי, ועלולה לגרום לכמעט שום גילוי של CEF-supercomplex לאחר צנטריפוגה במשך הלילה. השיבוש המוצלח של תאים ניתן להסיק מהצבע הירוק הבהיר של supernatant לאחר צנטריפוגה. לעומת זאת, אם הלחץ במהלך ההפרעה תא גבוה מדי, חלקי supercomplex עלולים להתפורר וcofactors החשוב עלול ללכת לאיבוד. צעד נוסף המשפיע על התשואה של thylakoids הוא resuspension של תאי קדר עם. זה חייב להיעשות בזהירות ובסופו של שלב זה רק מעט חלקיקים ירוקים צריכים להישאר. יתר על כן, להכנת צפיפות סוכרוז הדרגתיים ביום שלפני, כמו גם עבור solubilization של מתחמי קרום, זה מאוד חשובדווקא אחרי פרוטוקול זה במונחים של ריכוז β-DM, שכן זה הוא חיוני כדי להשיג thylakoids solubilized מלא ⁵⁰ ולכן גם לטיהור של CEF-supercomplex. צעד solubilization כבר ביצע בהצלחה אם גלולה קטנה, לבנבן הוא ציין לאחר צעד צנטריפוגה שלאחר מכן. עוד נקודה קריטית שצריך להיות מוזכרת כאן היא הזמן של ultracentrifugation על הלילה. הדרגתיים בצפיפות סוכרוז צריך להיות centrifuged לפחות שתים עשרה שעות כדי להשיג הפרדה מלאה של הקומפלקסים פוטוסינתטיים.

למרות שהפרוטוקול מודגם באמצעות ג reinhardtii לניתוח ההשוואתי של הרכב CEF-supercomplex בשני זנים שונים מבחינה גנטית, זה בקלות להתאמה גם למגוון רחב של שאלות אחרות, כגון ניתוחים ההשוואתיים של קומפוזיציה מורכבת multiprotein מבודד מסביבה / ניסיוני ברורתנאים או על ידי שימוש בסוגים אחרים של חלוקה. הדרישות היחידה של גישה זו הן שאורגניזם המודל יכול להיות מעובד בתרבית תאים, הוא מסוגל להשתמש באמוניום כמתחמי מקור חנקן וחלבון יכול להיות מופרדת על ידי הדרגתיים בצפיפות סוכרוז, הוכחת יישום רחב של שיטה זו. ליישום עתידי של חלוקה SDS-PAGE זה של גישת ¹⁴ N / ¹⁵ N דגימות המעורבות ולאחר עיכול בג'ל יכול להיות מוחלף על ידי יישום הכנת מדגם בעזרת מסנן שיטה (FASP). שיטה זו כוללת את היישום של חומרי ניקוי חזקים לsolubilization במטרה "לנקות" proteome לפני העיכול ולקבל פפטידים מטוהרים, מונע את החסרונות של גישת העיכול בג'ל שיכול לעכב התאוששות פפטיד, אף אחד לא צריך לשקול את זה בג'ל עיכול מתואר להיות חזק לזיהומים שעשויים להפריע לעיכול ^51.

המחברים מצהירים שום אינטרס כלכלי מתחרה.

MH מודה תמיכה מ" דויטשה Forschungsgemeinschaft "(DFG). מחבר תרומות: MH תוכנן מחקר; KT, JS ו MT ביצע מחקר וניתחו את הנתונים; KT וMH כתב העיתון.