복잡한 생물 학적 샘플에서 선택적으로 - glycosylated 펩티드을 풍요롭게하는 렉틴 HPLC 방법

렉틴 - 복합 POROS 비즈는 HPLC를 위해 고용되었다. 당펩타이드 기준은 긍정적이고 부정적인 컨트롤을 역임 하였다. MARS - 14 고갈, 트립신 - 소화 인간의 플라즈마는 chromatographed와 흐름 -을 통해 (FT)와 바운드 분수는 ESI-LC-MS/MS 분석을 위해 수집되었다. FT에 비해 Glycopeptides는 바운드 분수에 풍부했다.

Glycans 게시할 - translational 수정의 중요한 클래스입니다. 일반적으로 분비 및 세포 분자에있는, glycan 구조는 세포의 내부 상태를 신호. 종양 세포에 Glycans 풍부한 sialic 산성 및 fucose의 moieties이 필요한 경우가 많다. 우리는이 암 관련 glycan 변종이 초기 단계 질병을 진단하기위한 biomarker 개발에 이용할 것을 제안합니다. 따라서, 우리는 대량 lectins, 특정 glycan 구조를 바인딩 단백질의 형성 친화 매트릭스에서 크로마 토그래피를 통합 분광 기반의 워크플로우를 개발했습니다. 각각 sialic 산성 및 fucose를 묶어 lectins Sambucus 니그라 (SNA)과 Aleuria aurantia (AAL)는, covalently POROS 비즈 (응용 Biosystems)로 결합하고 고압 액체 크로마 토그래피 (HPLC)에 대한 피크 컬럼으로 포장했다. 간단히, 플라즈마는 여러 친화 제거 시스템 (; 애질런트 MARS - 14)를 사용하여 열네 가장 풍부한 단백질의 고갈되었다. 고갈 플라즈마 트립신 - 소화와 흐름을 통하여 SNA 또는 AAL HPLC에 의해 구속 분수로 분리되었다. 분수는 N - glycans 링크를 제거하는 PNGaseF 취급하고 QStar 엘리트에 LC-MS/MS로 분석되었다. 데이터 마스콧 소프트웨어를 사용하여 분석했다. 실험 설계는 제어 - fucosylated 및 sialylated 긍정을 포함하는 인간 락토페린의 glycopeptides 및 Saccharomyces에서 부정적인 제어 높은 mannose glycopeptides cerevisiae가 - 렉틴 캡처의 특이성을 모니터링하는 데 사용되었습니다. 이 워크플로의 주요 기능은 당단백질 표준을 사용하여 HPLC 형식들은 deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr 주제에서 캡처 PNGaseF - 처리 glycopeptides의 긍정적인 식별 및 품질 평가에서 파생 재현성을 포함합니다. 프로토콜 최적화는 또한, 열 용량 자료를 시작 가장 효율적인 캡처 및 용출 버퍼를 파악하고, 전체 deglycosylation을 보장하기 위해 PNGaseF - 치료를 모니터링의 적절한 비율을 결정 포함되어 있습니다. 미래의 방향 유방암 환자 및 제어 개인의 플라즈마 질량 분석법에 기반 검색 실험을 수행하기 위해이 워크플로우를 사용하여 포함됩니다.

1) 렉틴과 - 복합 POROS 열 준비

1. 1.2 - 1.1 단계 동안 POROS - AL 비즈의 흡입을 방지하기 위해 마스크를 쓰세요. POROS 비즈의 원하는 금액 (100 MG beads/300 μl 최종 볼륨)을 무게와 깨끗한 eppendorf 튜브에 전송할 수 있습니다.
2. 1 ML 인산 버퍼 호수 (PBS)의 추가로 구슬을 씻으십시오. 3 분 최대 속도 microcentrifuge에서 원심 분리하여 펠렛 비즈. 뜨는을 제거하고 세척을 반복합니다.
3. unconjugated 렉틴과의 원하는 금액 (1-4 MG / 200 μl 구슬)을 무게와 깨끗한 eppendorf 튜브에 전송할 수 있습니다. 5 형태로 PBS를 추가 - 20 MG / ML 솔루션. 이 솔루션의 보호 25 μl.
4. POROS 비즈에 남아있는 렉틴 솔루션을 전송합니다. 50 mm의 최종 농도 나트륨 cyanoborohydride를 추가합니다. 락커에 튜브를 삽입하고 실온에서 하룻밤 반응. (참고 :. 나트륨 cyanoborohydride은 독성이며 퓸 후드에서 처리되어야합니다 오염된 폐기물은 적절히 폐기해야합니다.)
5. 단계 1.2로 펠렛 POROS 비즈. 뜨는을 제거하고 사후 활용 솔루션으로 저장합니다.
6. 1 ML 담금질 버퍼 (1 M 트리스 - CL, 산도 7.4)으로 구슬을 씻으십시오. 단계 1.2에서 안전하게 같은 펠렛 비즈가 뜨는 폐기합니다.
7. 1 ML 담금질 버퍼로 POROS 비즈에 남아있는 반응 사이트를 차단합니다. 50 mm의 최종 농도 나트륨 cyanoborohydride를 추가합니다. 락커에 튜브를 삽입하고 30 분 실온에서 알을 품다.
8. 펠렛 단계 1.2로 구슬과 뜨는 폐기.
9. 1 ML 1 M NaCl과 구슬을 씻으십시오. 펠렛 비즈와 뜨는 폐기. 오 세척 총 네 번 반복합니다. 구슬 이제 팩을 준비가되었습니다.
10. POROS 비즈로 복합했습니다 단백질의 양을 확인하려면 사전 복합 및 사후 복합 렉틴 솔루션에 단백질 농도 분석을 수행합니다. 농도의 차이는 구슬로 복합했습니다 단백질의 금액입니다. 비드 볼륨 당 복합 단백질의 금액은 구슬에 렉틴의 농도 같습니다. 대상 렉틴과의 농도는 2 -20 MG / ML 사이입니다.

2) 피크 칼럼에 렉틴 - 복합 POROS 비즈 포장

1. 포장 시스템 (설명이 다음)를 조립하고 금속 링 스탠드에 지원합니다. 포장 시스템은 바닥에서 위로, 압력 제한기, 최종 칼럼 커플러 1, 프릿, 열 (2 X 50mm), 최종 열 커플러 2 열 커넥터, 최종 칼럼 커플러 3 열 (4.5 X 50mm)로 구성되어 있습니다 최종 칼럼 커플러 4 및 최종 피팅. 상단 열은 포장의 저수지 역할을합니다.
2. 버퍼의 원하는 볼륨의 POROS 비즈를 Resuspend (10 MM 트리스 버퍼, 산도 7.4, 150 MM 나트륨 염화물, 10 MM의 염화칼슘, 10 MM 마그네슘 염화물). 400 μl 버퍼 A.에 resuspend 하나의 열로 표시 (~ 200 μl 침대 볼륨)을 포장하는 경우
3. 상단 열 (저수지)에 복합 POROS 비즈를 전송합니다. 버퍼가 칼럼의 맨 위에 도달 때까지 저수지에 버퍼 추가합니다. 부드럽게 컬럼에서 공기 방울을 피하기 위해 노력하고, 컬럼의 상단에 최종 피팅을 넣으십시오. HPLC 시스템 상단 열의 최종 피팅에 연결합니다.
4. 시스템을 통해 버퍼를 흐르는하여 열을 팩. 0.5 ML / 분 유량을 시작합니다. 4 ML / 분 또는 최대 압력 (3000 PSI) 중 하나에 도달할 때까지 0.5 ML / 분 각 분에 의해 유량을 향상시킬 수 있습니다. 버퍼의 적어도 35 ML이가 열이 통과하기 전까지 가능한 최대 유량에서 계속합니다.
5. 펌프를 끄고 <20 PSI 드롭으로 컬럼에 압력을 수 있습니다.
6. 부드럽게, 상단부터, 포장 시스템을 분해. 최종 칼럼 커플러 2에 도달하면, 조심스럽게 제거합니다. 일부 포장 재료 칼럼의 상단에서 압출해야합니다. 면도날 또는 유사 날카로운 가장자리로 부드럽게 열 상단과 심지어는 구슬 표면을두고, 압출 구슬을 닦아. 이렇게하면서 비즈에 압력을 적용하지 마십시오.
7. 반지 스탠드에서 포장 열을 공격 중지. 새로운 최종 커플러에 새 프릿을 놓고 오픈 (이전 TOP) 열 끝에있는 프릿 / 끝 커플러와 이것을 연결하는 포장 컬럼을 넘기다.
8. 적절하게 열을 라벨. 이제 사용할 수 있습니다. 최대 6 개월까지 사용하지 않을 때, 컬럼은 4 0.02 % 나트륨 azide ° C로 PBS에 저장되어있을 수 있습니다 때.

3) 프로그램 HPLC 방법

1. 귀하의 HPLC 프로그래밍의 내용은 제조 업체의 소프트웨어의 구체적인 내용에 따라 달라집니다. 우리는 Michrom 패러다임 MG4 HPLC를 사용합니다. 화면의 상단에이 컴퓨터에, 방법은 건설되고있는 "설정"탭 아래에 액세스할 수. 다음 방법을 프로그램 :
   

   시간	흐름 속도 (μl / 분)	%	%의 B
   0시	50	100	0
   9시	50	100	0
   9시 1분	500	0	100
   13시 50분	500	0	100
   13시 51분	3000	100	0
   19시 50분	3000	100	0

   
   10 MM 트리스 버퍼, 산도 7.4, 150 MM 나트륨 염화물, 10 MM의 염화칼슘은 10 MM 마그네슘 염화물 : 버퍼
   버퍼 B : 0.5 M 아세트산의 산성
   UV 검출기는 0시에서 19시 50분에 280 nm의에서 읽을 프로그래밍해야합니다. . 50 AU - Y 축이 낮은 흡광도 레벨, 예를 들어, 0을 감지하는 조정해야합니다.
2. autosampler 사용 가능한, 프로그램 분수 수집에 대해 다음 일정있다면. 크로마 토그래피를 수행할 때 표시 달리, 손으로 분수를 수집합니다.
   

   분수	시료 주입에서 컬렉션에 지연	수집 기간 (분)
   흐름 -을 통해	2.8	4.1
   바운드	9	2.6

4) HPLC에 대한 샘플을 준비

1. 이 프로토콜에서 사용하기 전에, 인간의 플라즈마는 MARS 칼럼 (; 산타 클라라, CA 애질런트)를 사용하여 14 가장 풍부한 단백질의 소진해야합니다. 소진 플라즈마, 인간 락토페린 및 효모 invertase 개별적으로 트립신 - 소화하고 이전 ¹ 설명된대로 desalted해야합니다.
2. 렉틴과 특정 락토페린 표준을 준비하려면, 제 3의 방법을 사용하여 AAL 또는 SNA 열 중 50 개 이상의 UG 트립신 - 소화 락토페린에서 크로마 토그래피를 수행합니다. 바운드 분수는 렉틴 특정 락토페린의 glycopeptides 포함됩니다. 6 부에서와 부품 4.4로 샘플 및 탈염하다를 무력화. 결과 예제를 사용할 준비가 하나 ML 버퍼 A에서 샘플을 Resuspend.
3. 세 실험이 수행됩니다 복제합니다. 세 사람 샘플을 준비하려면 복제, 30 μl MARS - 고갈, 트립신 - 소화, 플라즈마 동일한 (PE)에 트립신 - 소화 invertase 3 pmol 및 렉틴 특정 락토페린 (중 AAL - 락 또는 SNA - LAC) 1 μl를 추가합니다. PE는 플라즈마 처리 (MARS -되었고, 트립신 소화)의 주어진 금액이 파생된하는 non-processed/intact/original 플라즈마의 볼륨으로 정의됩니다. 330 μl의 최종 볼륨에 도달하기 위해 샘플을 버퍼에 추가합니다.
4. eluate를 수집 샘플 튜브에, 중화 버퍼 (1 M 트리스 산도 8.0)를 추가합니다. 번호와 함께 일하는 튜브의 볼륨은 autosampler의 제약에 따라 달라집니다. MG4 패러다임 들어, 유리병은 흐름을 통해 두가 eluate를 수집 수집합니다. 그것은 약 1.5 ML 트리스 버퍼 eluate 1 ML를 무력화하기 위해 필요합니다. 대상 무력화 산도는 7.0-8.0이며 산도 표시기 용지로 테스트 테스트 최종 산도.

5) 크로마 토그래피를 수행

1. 에 따라 모든 공백 및 예제 실행은 제 1 부에 설명된 방법을 사용합니다. 열 및 버퍼는 사용하는 동안 실온에서 수 있습니다. 버퍼가 상온에서 저장하는 동안 열이 4 ° C에 저장됩니다.
2. HPLC 시스템 중 AAL 또는 SNA의 렉틴 칼럼을 첨부 두 빈 메소드를 (단지 버퍼 주사)를 실행합니다. 렉틴과 열이 렉틴 특정 락토페린 (2 부)에 해당 있는지 확인합니다.
3. 7 HPLC의 실행의 총, 각 주입 샘플 사이에 빈 주사, 세 플라즈마 샘플을 크로마토 그래프. 빈 실행에서 분수가 수집 필요가 없습니다.

6) 탈염하다는 분수를 수집

각각의 분율은 다음과 같이 1 1 ML 워터스 오아시스 HLB SPE 카트리지를 사용하는 경우 :

1. 진공 매니폴드에 필요한 카트리지의 개수를 연결합니다.
2. 1% 개미 산성 1 ML 80 % ACN (- 20 lnHg를 매니폴드에 진공 게이지 5를 참조한다) 각 카트리지를 젖었어.
3. 1.5 ML 0.1 %의 개미의 산성 (- 20 lnHg 매니폴드에서 진공 게이지 5를 참조한다)와 카트리지를 평형
4. 한 카트리지 (. - 2.5 lnHg을하고, 유량이 1 ML / 분 넘지 않아야 매니폴드에서 진공 게이지 2를 참조한다)에 한 샘플의 전체 볼륨을로드
5. 3 X 1 ML 0.1 %의 개미의 산성 (- 20 lnHg 매니폴드에서 진공 게이지 5를 참조한다)와 카트리지를 씻으십시오
6. 로 Elute 펩티드 / glycopeptides은 0.1 % 개미 산성 1 X 1 ML 80 % acetonitrile로 eppendorf 튜브를 표시. 단일 수집 튜브 각 카트리지에 사용해야합니다 - (2.5 lnHg을하고, 유량은 1 ML / 분 넘지 않아야 매니폴드에서 진공 게이지 2를 참조한다.).
7. 각 수집 튜브 60 μl 0.5 M의 탄산수 소 암모늄을 추가하여 eluate를 무력화. 대상 neutralized 산도는 7.0-8.0입니다, 산도 표시기 용지와 시험 최종 산도.
8. ~ 2 시간 @ 35도 ° C. (예, 써모 사반트 SpeedVac) 진공 원심 분리기에 그들을 실행하여 eluted 펩티드 / ~ 50 μL에 glycopeptides을 집중

7) PNGase F - 소화

1. 그것을 보장하기 위해 테스트 샘플 산도 7.0 사이 - 8.0. 필요한 경우 산도를 증가 50 MM의 탄산수 소 암모늄을 추가합니다. 최종 샘플 량은 50-100 μl 사이까지> 100 μl, speedvac 예제입니다.한다면
2. 37 ° C 야간 각 샘플 튜브와 부화 0.5 μl (250 U) 글리세롤 무료 PNGase의 F를 추가합니다.

8) 우편 팁 샘플

1. PNGase F - 소화 샘플로 시작, 다음과 같이 각각의 하나를 ziptip.
2. 10 μl 100 % acetonitrile, 10 μl 80 % acetonitrile, 0.1 % 개미 산성 다음과 젖은 ziptip.
3. 20 μl 0.1 %의 개미의 소산과 ziptip을 평형.
4. ziptip 매트릭스를 통해 10 번 그것을 pipetting 아래로 ziptip에 샘플을로드합니다.
5. 10 μl 0.1 %의 개미의 산, 5 번 pipetting하여 ziptip 씻으십시오.
6. 10 μl 80 % acetonitrile, 0.1 % 개미 산성과 깨끗한 eppendorf 튜브에 샘플을 Elute.
7. 용리를 반복하고 같은 튜브에 두 번째 10 μl를 추가합니다.
8. <2 μl의 볼륨에 샘플을 Speed​​vac.
9. 20 μl 0.1 %의 개미의 산이 Resuspend 샘플. 샘플 지금 LC-MS/MS로 분석 준비가되어 있습니다.

9) 대표 검색 결과 :

20 MG / ML - POROS의 활용은 일반적으로 2의 범위에서 - 비드 렉틴 농도를 산출. 이것은 친화도 크로마 토그래피 최적입니다.

트립신 - 소화 MARS - 고갈 인간 플라즈마의 렉틴 크로마 토그래피는 일반적으로 바운드 분수에 glycopeptides을 풍요롭게. glycopeptides가 PNGase 이전 LC-MS/MS에 F - 대우, 그들은 N - 연결 합의 순서와 펩티드로 식별되며, 아스파라긴가로 변환되어있는 NXS / T (여기서 X는 어떤 잔류물하지만 프롤린됩니다) 이러한 특성을 가진 PNGase F.의 펩티드의 작업을 통해 아스파르트산는 deglycosylated 펩티드 (또는 "deglycopeptides")로 간주됩니다. 바운드 분수에서 가져온 펩티드의 30-50%가 deglycopeptides 반면 평균 흐름을 통해 AAL 또는 SNA 크로마 토그래피에서 (FT) 분수, 2-4 %의 deglycopeptides가 포함되어 있습니다. 일반적으로 QStar 엘리트를 사용하여, 1000-1300 펩티드는 FT 분율에 표시됩니다, 그리고 200-400 펩티드는 바운드 분수에 표시됩니다. 두 개 이상의 서로 다른 Invertase의 deglycopeptides는 FT 분율과 바운드 분율 (표 1)에 두 개 이상의 별개의 락토페린의 deglycopeptides에서 관찰해야합니다.

표 1.

이 프로토콜은 glycan 특정 방식으로 glycopeptides를 분리하고 확인하는 빠른 방법을 제공합니다. 글리코 실화 특히 개발과 pathogenesis 동안 생체 내에 광범위하게 다릅니다,이 기술은 질문의 다양한 해결하기 위해 적용할 수 있습니다. 특히, 우리는 선택 biomarker 발견을 향한 첫 단계로서 암 관련 epitopes로 변경되었습니다 glycopeptides을 풍요롭게하는 방법을 사용하고 있습니다.

이 작품은 암 대책, 5U24CA126477 - 04에 대한 임상 Proteomic 기술에 의해 지원되었다.