وهناك طريقة HPLC Lectin لإثراء هضميدات انتقائية الغليكوزيلاتي من العينات البيولوجية المعقدة

كانوا يعملون Lectin - مترافق الخرز بوروس عن HPLC. خدم معايير ببتيد سكري والضوابط الإيجابية والسلبية. MARS - 14 المستنفد ، كان chromatographed تربسين هضم البلازما البشرية والتدفق من خلال (FT) ، والكسور التي جمعت ملزمة لتحاليل ESI-LC-MS/MS. وقد أثرى Glycopeptides في جزء ملزمة مقارنة FT.

Glycans هي فئة هامة في مرحلة ما بعد متعدية التعديلات. العثور على عادة تفرز خارج الخلية والجزيئات ، وهياكل غليكان إشارة إلى الحالة الداخلية للخلية. Glycans على الخلايا السرطانية تميل إلى أن تكون وفيرة والحامض اللعابي فوكوز الأنصاف. نقترح أن يتم استغلال هذه المتغيرات المرتبطة بالسرطان غليكان العلامات البيولوجية للتنمية تهدف إلى تشخيص المرض في مرحلة مبكرة. تبعا لذلك ، قمنا بتطوير الطيف الكتلي على أساس سير العمل الذي يتضمن اللوني على المصفوفات تقارب تشكلت من lectins ، والبروتينات التي تربط غليكان هياكل محددة. اقترنت تساهمي في lectins خمان ؛ بلسان أسود (SNA) وبرتقالية Aleuria (العال) ، والتي تربط الحامض اللعابي وفوكوز ، على التوالي ، إلى حبات بوروس (النظم البيولوجية التطبيقية) ، ومعبأة في أعمدة PEEK لارتفاع ضغط اللوني السائل (HPLC). باختصار ، كان المنضب البلازما من البروتينات fourteen الأكثر وفرة باستخدام نظام إزالة تقارب متعددة (MARS - 14 ؛ اجيلنت). وفي الوقت نفسه تقلصت البلازما التربسين - هضمها والمنفصلين في التدفق من خلال والكسور ملزمة SNA أو HPLC AAL. تم علاج الكسور مع PNGaseF لإزالة N - مرتبطة glycans ، وتحليلها بواسطة LC-MS/MS على النخبة QStar. وقد تم تحليل البيانات باستخدام برنامج التميمة. تضمنت الضوابط الإيجابية التصميم التجريبي ، وfucosylated sialylated glycopeptides الإنسان واكتوفيرين السلبية تسيطر عالية من glycopeptides مانوز السكيراء البيرة ، التي كانت تستخدم لمراقبة النوعية من التقاط lectin. الميزات الرئيسية لهذا العمل تشمل استنساخ مستمدة من تنسيق HPLC ، وتحديد الإيجابية للأسر وglycopeptides PNGaseF المعاملة من الزخارف الخاصة Asn-Xxx-Ser/Thr deamidated ، وتقييم الجودة باستخدام معايير بروتين سكري. كما تضمن البروتوكول التحسين تحديد نسبة المواد المناسبة للبدء في قدرة العمود ، وتحديد التقاط الأكثر كفاءة ومخازن شطف ، ورصد PNGaseF المعاملة لضمان deglycosylation الكامل. التوجهات المستقبلية تشمل استخدام سير العمل لتنفيذ هذه التجارب اكتشاف مطياف الكتلة المستندة على البلازما من مرضى سرطان الثدي والأفراد السيطرة.

1) إعداد lectin - مترافق الأعمدة بوروس

1. وضع على قناع للوقاية من استنشاق بوروس - AL الخرز خلال الخطوات 1،1-1،2. تزن من أصل المبلغ المطلوب من الخرز بوروس (100 ملغ beads/300 الحجم النهائي ميكرولتر) ونقل في أنبوب إيبندورف نظيفة.
2. تغسل حبات مع اضافة 1 المالحة الفوسفات مخزنة مل (PBS). الخرز بيليه بواسطة الطرد المركزي في microcentrifuge في أقصى سرعة لمدة 3 دقائق. إزالة طاف وتكرار الغسيل.
3. تزن من أصل المبلغ المطلوب من lectin unconjugated (1 -- 4 ملغ / 200 حبات ميكرولتر) ونقل إلى أنبوب إيبندورف نظيفة. إضافة برنامج تلفزيوني لتشكيل 5-20 ملغ / مل حل. 25 احتياطي ميكرولتر من هذا الحل.
4. نقل حل lectin المتبقية إلى حبات بوروس. إضافة cyanoborohydride إلى تركيز الصوديوم النهائية من 50 ملم. وضع أنبوب على الكرسي الهزاز والتفاعل بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. (ملاحظة : يجب التخلص cyanoborohydride الصوديوم السامة ويجب التعامل معها في غطاء من الدخان الملوث النفايات بشكل مناسب.)
5. بيليه حبات بوروس كما في الخطوة 1.2. إزالة طاف وحفظه ليكون هو الحل في مرحلة ما بعد الاقتران.
6. تغسل حبات مع 1 مل الاحتياطي الرواية (1 M - CL تريس ، ودرجة الحموضة 7.4). الخرز بيليه كما في الخطوة 1.2 و بأمان تجاهل طاف.
7. حجب المواقع المتبقية على التفاعل مع حبات بوروس 1 مل الاحتياطي الرواية. إضافة cyanoborohydride إلى تركيز الصوديوم النهائية من 50 ملم. وضع أنبوب على الكرسي الهزاز ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
8. الخرز بيليه كما في الخطوة 1.2 وتجاهل طاف.
9. تغسل حبات مع 1 مل من كلوريد الصوديوم M 1. الخرز وتجاهل بيليه طاف. كرر أربع مرات عن ما مجموعه خمسة يغسل. الخرز على استعداد الآن لحزمة.
10. لتحديد كمية البروتين الذي كان مترافق مع حبات بوروس ، إجراء فحص تركيز البروتين على الحلول lectin قبل مترافق وآخر مترافق. الفرق في تركيزات هو مقدار البروتين الذي كان مترافق مع الخرز. كمية البروتين في حجم حبة مترافق يساوي تركيز lectin على الخرز. تركيزات lectin الهدف ما بين 2 -20 ملغ / مل.

2) التعبئة وlectin - مترافق الخرز بوروس في عمود PEEK

1. تجميع نظام التعبئة (وصف يلي) ، والدعم الذي يقف على سطح معدني الحلبة. نظام التعبئة يتكون من ، من الأسفل إلى الأعلى ، restrictor الضغط ، في نهاية العمود مقرنة 1 ، فريت ، العمود (2 × 50 ملم) ، في نهاية العمود 2 مقرنة ، موصل العمود ، عمود نهاية مقرنة 3 ، العمود (4.5 × 50 ملم) ، 4 مقرنة نهاية العمود وتركيب الغاية. العمود العلوي بمثابة خزان للمواد التعبئة والتغليف.
2. Resuspend حبات بوروس في حجم الاحتياطي المطلوب من A (10 ملي تريس العازلة ، ودرجة الحموضة 7.4 ، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم ، كلوريد الكالسيوم 10 ملم ، 10 ملم كلوريد المغنيسيوم) إذا التعبئة عمود واحد (~ 200 حجم السرير ميكرولتر) ، في 400 ألف resuspend الاحتياطي ميكرولتر
3. نقل مترافق الخرز بوروس في العمود العلوي (الخزان). إضافة العازلة ألف إلى الخزان حتى تصل إلى المنطقة العازلة أعلى العمود. المكان المناسب نهاية برفق على الجزء العلوي من العمود ، في محاولة لتجنب فقاعات الهواء في العمود. توصيل المناسب نهاية العمود العلوي للنظام HPLC.
4. حزمة العمود A العازلة التي تتدفق من خلال النظام. تبدأ مع معدل تدفق 0.5 مليلتر / دقيقة. زيادة معدل تدفق كل 0.5 دقيقة مل / دقيقة حتى تم التوصل إلى إما 4 مل / دقيقة أو الضغط الأقصى (3000 رطل). يستمر على معدل التدفق إلى أقصى حد ممكن حتى لا يقل عن 35 مل من الاحتياطي ومرت من خلال العمود.
5. إيقاف المضخات والسماح للضغط على العمود أن تنخفض إلى 20 رطل <.
6. بلطف ، وتفكيك نظام التعبئة ، بدءا من القمة. عند الوصول إلى نهاية العمود 2 مقرنة ، وإزالة بعناية. وينبغي أن تكون معبأة بعض المواد البثق من أعلى العمود. بشفرة حلاقة أو حافة حادة مماثلة ، ويمسح برفق بعيدا الخرز البثق ، وترك على سطح حبة أن حتى مع الجزء العلوي من العمود. لا يتم تطبيق الضغط على حبات أثناء القيام بذلك.
7. فك الارتباط العمود معبأة من الوقوف الحلبة. مكان فريت جديدة في نهاية مقرنة الجديدة وتحويل العمود معبأة أكثر لتوصيل هذا مع مقرنة فريت / نهاية نهاية مفتوحة على العمود (أعلى سابقا).
8. تسمية العمود بشكل مناسب. وهو الآن جاهز للاستخدام. عندما لا تكون قيد الاستعمال ، قد يتم تخزين العمود في برنامج تلفزيوني مع أزيد الصوديوم 0.02 ٪ عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.

3) برنامج لطريقة HPLC

1. سوف تفاصيل البرمجة HPLC الخاص تختلف وفقا لمواصفات البرمجيات المصنعة. نحن نستخدم نموذج Michrom HPLC MG4. على هذا الجهاز ، يتم بناء الطرق والوصول إليها تحت علامة التبويب "إعداد" في أعلى الشاشة. برنامج الأسلوب التالي :
   

   مرة	معدل التدفق (ميكرولتر / دقيقة)	A ٪	٪ B
   00:00	50	100	0
   09:00	50	100	0
   09:01	500	0	100
   13:50	500	0	100
   13:51	3000	100	0
   19:50	3000	100	0

   
   عازلة ج : 10 ملي تريس العازلة ، ودرجة الحموضة 7.4 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، كلوريد الكالسيوم 10 مم ، 10 مم كلوريد المغنيسيوم
   العازلة B : 0.5 حامض الخليك M
   وينبغي أن تكون مبرمجة للكشف عن الأشعة فوق البنفسجية لقراءة عند 280 نانومتر 0:00 حتي 19:50. ينبغي تعديل العمودي للكشف عن مستويات منخفضة الامتصاصية ، على سبيل المثال ، 0 -- 50 للاتحاد الافريقي.
2. إذا كان الاوتوماتيكى متوفرا ، برنامج الجدول الزمني التالي لجمع الكسور. خلاف ذلك ، وجمع الكسور باليد كما هو مبين عند تنفيذ اللوني.
   

   كسر	تأخير لجمع عينات من الحقن	مدة جمع (دقيقة)
   التدفق من خلال	2.8	4.1
   ملزم	9	2.6

4) إعداد العينات للHPLC

1. قبل استخدامها في هذا البروتوكول ، ينبغي المنضب بلازما الإنسان من البروتينات 14 الأكثر وفرة باستخدام عمود المريخ (اجيلنت ؛ سانتا كلارا ، كاليفورنيا). ينبغي المنضب البلازما ، اكتوفيرين الإنسان وinvertase الخميرة تكون فردية التربسين ، وتهضم المحلاة كما هو موضح سابقا ^1.
2. لإعداد lectin محددة لاكتوفيرين القياسية ، نفذ اللوني على 50 ميكروغرام تربسين هضم اكتوفيرين على AAL إما أو العمود SNA باستخدام الأسلوب في الجزء 3. وسوف تحتوي على الكسر ملزمة lectin محددة glycopeptides اكتوفيرين. تحييد العينات كما هو الحال في الجزء 4.4 ، وكما هو الحال في الجزء desalt 6. Resuspend العينة في 1 ألف الاحتياطي مل العينة الناتجة جاهز للاستخدام.
3. ثلاثة مكررات التجريبية سوف يتم تنفيذها. للتحضير العينة لمدة ثلاثة مكررات ، إضافة 3 بمول من التربسين - هضمها invertase و 1 ميكرولتر من lectin محددة لاكتوفيرين (إما AAL - LAC SNA أو أمريكا) إلى 30 ميكرولتر المريخ المستنفد ، تربسين هضم المعادلة البلازما (PE). يتم تعريف المؤسسة العامة ، حيث بلغ حجم البلازما non-processed/intact/original التي استمدت كمية معينة من البلازما المجهزة (MARS - المنضب وتربسين هضم). إضافة العازلة ألف لعينة من أجل التوصل إلى الحجم النهائي من 330 ميكرولتر.
4. إضافة العازلة تحييد (1 M تريس الرقم الهيدروجيني 8.0) ، إلى قارورة العينة التي ستجمع شطافة. وعدد وحجم قارورة كنت تعمل مع تعتمد على القيود التي تفرضها الاوتوماتيكى الخاص. لبارادايم MG4 ، واحد يجمع فيال التدفق من خلال جمع واثنين شطافة. وسوف يتطلب ما يقرب من 1.5 مل تريس العازلة لتحييد 1 مل من شطافة. الهدف هو تحييد الحموضة 7،0-8،0 ؛ اختبار درجة الحموضة ورقة الاختبار النهائي مع مؤشر الرقم الهيدروجيني.

5) تنفيذ اللوني

1. وسوف يعمل كل عينة فارغة والتي تتبع استخدام الأسلوب الموصوفة في الجزء 1. العمود ومخازن هي في درجة حرارة الغرفة في حين الاستخدام. يتم تخزين الأعمدة في 4 درجات مئوية ، في حين يتم تخزينها في مخازن درجة حرارة الغرفة.
2. نعلق إما AAL أو العمود lectin SNA لنظام تشغيل وHPLC طريقتين فارغة (ضخ الاحتياطي فقط). تأكد من أن العمود lectin يناظر اكتوفيرين lectin محددة (جزء 2).
3. اللوني للعينات البلازما الثلاثة ، حقن فارغة في كل عينة بين حقن ، ليصبح المجموع يدير هبلك 7. كسور من يدير فارغة لا يلزم أن يكون جمعها.

6) جمع الكسور Desalt

لكل جزء استخدام واحد 1 مل مياه الواحة HLB SPE خرطوشة على النحو التالي :

1. نعلق عدد الخراطيش المتعددة المطلوبة لفراغ.
2. الرطب مع كل خرطوشة ACN 1 مل 80 ٪ في حامض الفورميك 1 ٪ (على قياس الفراغ المتعددة يجب قراءة 5-20 lnHg).
3. خراطيش يوازن مع 1.5 مل حمض الفورميك 0.1 ٪ (على قياس الفراغ المتعددة يجب قراءة 5-20 lnHg)
4. حجم حمولة كاملة من عينة واحدة على خرطوشة واحدة (على قياس كهربائية متعددة يجب قراءة 2 -- 2.5 lnHg ، ومعدل التدفق يجب أن لا تتجاوز 1 مل / دقيقة)
5. يغسل مع خراطيش 3 × 1 مل حمض الفورميك 0.1 ٪ (على قياس كهربائية متعددة يجب قراءة 5-20 lnHg)
6. الببتيدات أزل / glycopeptides الى المسمى أنابيب إيبندورف مع 1 × 1 أسيتونتريل مل 80 ٪ في حامض الفورميك بنسبة 0.1 ٪. (ينبغي قياس كهربائية متعددة على قراءة 2-2،5 lnHg ، ومعدل التدفق يجب أن لا تتجاوز 1 مل / دقيقة) وينبغي استخدام أنبوب واحد لجمع كل خرطوشة.
7. تحييد شطافة بإضافة 60 ميكرولتر 0.5 بيكربونات الأمونيوم M لجمع كل أنبوب. الهدف neutrالحموضة alized غير 7،0-8،0 ؛ الحموضة ورقة الاختبار النهائي مع مؤشر الرقم الهيدروجيني.
8. تركيز الببتيد eluted / glycopeptides إلى 50 ميكرولتر ~ بواسطة تشغيلها على جهاز للطرد المركزي فراغ (على سبيل المثال ، وهو سافانت SpeedVac الحرارية) للساعة 2 ~ @ 35 درجة مئوية.

7) PNGase F - الهضم

1. اختبار عينة الرقم الهيدروجيني للتأكد من أنه ما بين 7،0-8،0. إذا لزم الأمر ، إضافة بيكربونات الأمونيوم 50 ملم لزيادة درجة الحموضة. إذا كان حجم العينة النهائية> 100 ميكرولتر ، speedvac العينة حتى يتم بين 50-100 ميكرولتر.
2. إضافة 0.5 ميكرولتر (250 U) الجلسرين خالية F PNGase لكل أنبوب العينة واحتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل.

8) عينات تلميح الرمز

1. بدءا عينات من طراز F - PNGase هضمها ، ziptip كل واحد على النحو التالي.
2. الرطب ziptip مع أسيتونتريل ميكرولتر 10 100 ٪ ، تليها أسيتونتريل ميكرولتر 10 80 ٪ ، حمض الفورميك بنسبة 0.1 ٪.
3. يوازن ziptip مع 20 ميكرولتر حمض الفورميك بنسبة 0.1 ٪.
4. تحميل العينة على أن ziptip بواسطة pipetting صعودا وهبوطا من خلال مصفوفة ziptip 10 مرات.
5. غسل ziptip بواسطة pipetting 10 ميكرولتر حمض الفورميك بنسبة 0.1 ٪ ، و 5 مرات.
6. أزل العينة في أنبوب إيبندورف نظيفة مع أسيتونتريل ميكرولتر 10 80 ٪ ، حمض الفورميك بنسبة 0.1 ٪.
7. تكرار شطف وإضافة الثاني 10 ميكرولتر في الأنبوب نفسه.
8. Speedvac العينات إلى حجم ميكرولتر 2 <.
9. Resuspend عينات في 20 ميكرولتر حمض الفورميك بنسبة 0.1 ٪. نماذج جاهزة الآن لتحليلها من قبل LC-MS/MS.

9) الممثل النتائج :

واقتران بوروس غلة عادة على تركيزات حبة lectin في نطاق من 2 -- 20 ملغ / مل. هذا هو الأمثل لتقارب اللوني.

اللوني Lectin التربسين من البلازما البشرية ، يهضم المريخ المنضب يثري glycopeptides عادة في جزء محدد. كما يتم glycopeptides PNGase F - يعامل قبل LC-MS/MS ، يتم التعرف على أنها الببتيدات مع تسلسل الآراء N - مرتبط ، NXS / T (حيث X هو أي بقايا لكن برولين) ، الذي تم تحويل إلى الأسباراجين ويعتبر حمض الأسبارتيك من خلال عمل هضميدات F. PNGase مع هذه الخصائص أن الببتيدات deglycosylated (أو "deglycopeptides"). في المتوسط ​​، من خلال تدفق (FT) جزء من AAL اللوني أو SNA يحتوي deglycopeptides 2-4 ٪ ، في حين أن 30-50 ٪ من الببتيدات في استرداد جزء المربوطة deglycopeptides. عادة ، وذلك باستخدام QStar النخبة ، سوف يتم تحديد 1000-1300 الببتيدات في جزء FT ، وسيتم تحديد 200-400 الببتيدات في جزء محدد. ينبغي التقيد اثنين أو أكثر من deglycopeptides Invertase متميزة في جزء FT واثنين أو أكثر وضوحا في deglycopeptides اكتوفيرين الكسر منضم (الجدول 1).

الجدول 1.

هذا البروتوكول يوفر طريقة سريعة لتحديد وعزل glycopeptides بطريقة غليكان محددة. كما يختلف ارتباط بالغليكوزيل نطاق واسع داخل كائن حي ، لا سيما خلال تطوير والمرضية ، قد تكون قابلة للتطبيق هذه التقنية لمعالجة طائفة واسعة من الأسئلة. على وجه الخصوص ، نحن نستخدم أسلوب انتقائي لتخصيب glycopeptides التي تم تعديلها مع السرطان المرتبطة الحواتم كخطوة أولى نحو اكتشاف العلامات البيولوجية.

وأيد هذا العمل من قبل وتقنيات البروتين السريرية لمبادرة السرطان ، 5U24CA126477 - 04.