שיטה לקטינים HPLC להעשיר פפטידים סלקטיבי-glycosylated מ דגימות ביולוגיות מורכבות

לקטינים, מצומדות חרוזים פורוס הועסקו על HPLC. סטנדרטים Glycopeptide שימש שולטת חיוביים ושליליים. מאדים 14 מדולדל, טריפסין-מתעכל פלזמה האדם היה chromatographed ו flow-through (FT) וכן שברים מחויב שנאספו עבור ניתוחים ESI-LC-MS/MS. Glycopeptides היו מועשר בשבריר מחויב לעומת FT.

Glycans הם המעמד החשוב של הפוסט translational שינויים. נמצא בדרך כלל על מופרש ומולקולות תאית, מבנים glycan האות מצב פנימי של התא. Glycans על תאים סרטניים נוטים להיות חומצה sialic שפע moieties fucose. אנו מציעים כי אלו סרטן הקשורים וריאנטים glycan ניתן לנצל לפיתוח סמנים ביולוגיים שנועדו לאבחן בשלב מוקדם של המחלה. בהתאם לכך, פיתחנו ספקטרומטריית מסה מבוססי זרימת עבודה המשלבת כרומטוגרפיה על מטריצות זיקה נוצר לקטינים, חלבונים הנקשרים glycan מבנים ספציפיים. Sambucus לקטינים nigra (SNA) ו Aleuria aurantia (אאל), אשר נקלטות חומצה fucose sialic ו, בהתאמה, היו מצמידים קוולנטית כדי חרוזים פורוס (Applied Biosystems) וארז לעמודות הצצה עבור כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC). בקצרה, פלזמה היה מדולדל של עשר חלבונים הנפוץ ביותר בשימוש זיקה מרובים הסרת מערכת (Mars-14, Agilent). היה מדולדל פלזמה טריפסין-מתעכל מופרדים זרימה דרך שברים מחויב SNA או אאל HPLC. שברים טופלו PNGaseF להסיר N-linked glycans, ונותחו על ידי LC-MS/MS על עלית QStar. הנתונים נותחו באמצעות תוכנה Mascot. תכנון הניסוי כללו חיובי שולטת-fucosylated ו sialylated האדם glycopeptides ו לקטופרין השלילית שולטת גבוהה glycopeptides מנוז מ-Saccharomyces cerevisiae ששימשו כדי לפקח על סגוליות של לכידת לקטינים. התכונות העיקריות של זרימת עבודה זו לכלול את שחזור שמקורם בפורמט HPLC, זיהוי חיובי של glycopeptides בשבי PNGaseF שטופלו מן המוטיבים deamidated שלהם Asn-Xxx-Ser/Thr, והערכת איכות באמצעות סטנדרטים גליקופרוטאין. פרוטוקול אופטימיזציה כללה גם בקביעת יחס מתאים של חומר המוצא ליכולת טור, זיהוי ללכוד היעילה ביותר מאגרים elution, וניטור PNGaseF הטיפול כדי להבטיח deglycosylation מלא. כיוונים עתידיים כוללים באמצעות זרימת עבודה זו כדי לבצע ספקטרומטריית מסה מבוססי ניסויים הגילוי על הפלזמה של חולי סרטן השד ויחידים שליטה.

1) הכן לקטינים, מצומדות עמודות פורוס

1. שימו מסכה על מנת להגן מפני שאיפה של פורוס-AL חרוזים במהלך השלבים 1.1-1.2. תשקלי את הכמות הרצויה של חרוזים פורוס (100 מ"ג beads/300 נפח סופי μl) ולהעביר לתוך צינור Eppendorf נקי.
2. לשטוף חרוזים עם תוספת של 1 מ"ל בופר פוספט (PBS). גלולה חרוזים על ידי צנטריפוגה ב microcentrifuge במהירות המרבית במשך 3 דקות. הסר supernatant וחזור על לשטוף.
3. תשקלי את הכמות הרצויה של לקטינים unconjugated (1 - 4 מ"ג / 200 חרוזים μl) ומעבירים צינור Eppendorf נקי. הוסף PBS להקים 5-20 מ"ג / מ"ל ​​פתרון. רזרב 25 μl של פתרון זה.
4. מעבירים את הפתרון לקטינים הנותרים החרוזים פורוס. הוסף cyanoborohydride נתרן לריכוז סופי של 50 מ"מ. מניחים את הצינור על כיסא נדנדה ולהגיב הלילה בטמפרטורת החדר. (הערה:. Cyanoborohydride נתרן הוא רעיל ויש לטפל במנדף קטר פסולת מזוהמות חייב להיות מסולק כראוי.)
5. גלולה פורוס חרוזים כמו בשלב 1.2. הסר supernatant ולשמור כפתרון שלאחר נטיה.
6. לשטוף עם חרוזים הצפת 1 מ"ל מרווה (1 טריס M-Cl, pH 7.4). חרוזים גלולה כמו בשלב 1.2 בבטחה להשליך supernatant.
7. חסימת האתרים תגובתי הנותרים על חרוזים פורוס עם הצפת מרווה 1 מ"ל. הוסף cyanoborohydride נתרן לריכוז סופי של 50 מ"מ. מניחים את הצינור על כיסא נדנדה ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
8. גלולה חרוזים כמו בשלב 1.2 וזורקים supernatant.
9. לשטוף עם חרוזים 1 מ"ל 1 M NaCl. גלולה חרוזים להשליך supernatant. חזרו על התרגיל ארבע פעמים עבור סכום כולל של חמישה שוטף. החרוזים מוכנים כעת לארוז.
10. כדי לקבוע את כמות החלבון כי היה מצומדות של חרוזים פורוס, לבצע ריכוז חלבון assay על הפתרונות לקטינים מראש מצומדות ופוסט מצומדות. ההבדל בריכוזים הוא כמות חלבון זה היה מצומדות של חרוזים. כמות החלבון מצומדות לכל נפח חרוז שווה את הריכוז של לקטינים על החרוזים. לקטינים ריכוזי היעד הם בין 2 ל -20 מ"ג / מ"ל.

2) אריזה לקטינים, מצומדות חרוזים פורוס הצצה לתוך עמודה

1. להרכיב את מערכת אריזה (תיאור להלן) ותמיכה אותו על דוכן טבעת מתכת. מערכת האריזה כוללת, מלמטה למעלה, צמצם לחץ, טור סוף מצמד 1, frit, עמודה (2 x 50 מ"מ), טור סוף מצמד 2, מחבר טור, טור סוף מצמד 3, עמודה (4.5 x 50 מ"מ), טור סוף מצמד 4 והתאמת סוף. העמודה העליונה משמשת כמאגר חומר האריזה.
2. Resuspend החרוזים פורוס בנפח הרצוי מאגר (10 mM טריס חיץ, pH 7.4, נתרן כלוריד 150 מ"מ, סידן כלוריד 10 מ"מ, 10 מגנזיום כלוריד mM). אם האריזה עמודה אחת (~ 200 נפח המיטה μl), resuspend א '400 הצפת μl
3. העברה מצומדת חרוזים פורוס לתוך הטור העליון (מאגר). הוסף חוצץ למאגר עד למאגר מגיע לראש הטור. בעדינות למקום הולם על סוף החלק העליון של העמוד, מנסה למנוע בועות אוויר בעמודה. חיבור מתאים לסוף הטור העליון למערכת HPLC.
4. חבילת הטור ידי הצפת זורם דרך מערכת. התחל עם קצב הזרימה של 0.5 mL / min. להגדיל את קצב הזרימה על ידי כל דקה 0.5 mL / min עד 4 או mL / min או את הלחץ המקסימלי (3,000 psi) הושג. המשך בקצב הזרימה המקסימלית האפשרית לפחות עד 35 מ"ל של הצפת עברו הטור.
5. כבה את משאבות לאפשר את הלחץ על הטור לרדת <20 psi.
6. בעדינות, לפרק את המערכת האריזה, החל מלמעלה. כאשר טור סוף 2 מצמד הוא הגיע, להסיר בזהירות. כמה חומר צריך להיות ארוז extruding מהחלק העליון של העמודה. עם סכין גילוח או קצה חד דומה, בעדינות לנגב את אגלי extruding, משאיר משטח חרוז זה גם עם החלק העליון של העמודה. אל תפעילו לחץ על החרוזים בעוד עושה את זה.
7. לנתק את הטור ארוז מדוכן טבעת. מניחים frit חדשים מצמד סיום חדש ולהפוך את הטור ארוז על להתחבר זה עם מצמד frit / סוף בקצה (העליון לשעבר) לפתוח עמודה.
8. תווית העמודה כראוי. עכשיו זה מוכן לשימוש. כאשר לא בשימוש, בעמודה ניתן לאחסן PBS עם אזיד הנתרן 0.02% ב -4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.

3) תוכנית HPLC השיטה

1. הפרטים של תכנות HPLC שלך ישתנו בהתאם הפרטים של תוכנה של היצרן. אנו משתמשים HPLC פרדיגמה Michrom MG4. במחשב זה, שיטות בנויים לגשת תחת הלשונית "הגדרות" בחלק העליון של המסך. תוכנית בשיטה הבאה:
   

   זמן	קצב זרימה (μl / min)	%	% B
   00:00	50	100	0
   09:00	50	100	0
   09:01	500	0	100
   13:50	500	0	100
   13:51	3000	100	0
   19:50	3000	100	0

   
   הצפת: 10 mM טריס חיץ, pH 7.4, נתרן כלוריד 150 מ"מ, סידן כלוריד 10 מ"מ, 10 מגנזיום כלוריד mM
   מאגר ב ': 0.5 חומצה אצטית M
   גלאי UV צריך להיות מתוכנת לקרוא 280 ננומטר 0:00-19:50. ציר y צריך להיות מותאם כדי לזהות נמוכה ספיגת רמות, למשל, 0 -. 50 יחידות אסטרונומיות.
2. אם autosampler היא תוכנית זמין, את לוח הזמנים הבאים עבור אוסף חלק. אחרת, לאסוף את השברים ביד, כמצוין בעת ​​ביצוע כרומטוגרפיה.
   

   חלק	עיכוב לאוסף של הזרקה מדגם	משך האיסוף (דקות)
   זרימה דרך	2.8	4.1
   כבול	9	2.6

4) הכן דגימות HPLC

1. לפני שימוש בפרוטוקול זה, פלזמה אדם צריך להיות מדולדל של 14 חלבונים ביותר שופע באמצעות טור MARS (Agilent, סנטה קלרה, קליפורניה). מדולדלים פלזמה, אדם לקטופרין ו invertase שמרים צריך להיות בנפרד טריפסין-מתעכל desalted כפי שתואר לעיל ^1.
2. כדי להכין את לקטינים ספציפי לקטופרין סטנדרטי, לבצע כרומטוגרפיה על UG 50 טריפסין-מתעכל לקטופרין מעל או אאל או העמודה SNA בשיטת בחלק 3. חלק מחויב יכיל לקטינים ספציפי glycopeptides לקטופרין. לנטרל את דגימות כמו חלק 4.4, ו desalt כמו חלק 6. Resuspend המדגם ב 1 מ"ל הצפת א המדגם המתקבל הוא מוכן לשימוש.
3. שלושה ניסויים משכפל יבוצעו. כדי להכין מדגם שלושה משכפל, להוסיף 3 pmol של invertase-טריפסין מתעכל 1 μl של לקטינים ספציפי לקטופרין (או אאל-LAC או SNA-LAC) עד 30 μl מאדים מדולדל, טריפסין, מתעכל, ושווי פלזמה (PE). PE מוגדר בנפח הפלסמה non-processed/intact/original שממנו כמות נתונה של פלסמה מעובד (Mars-מדולל טריפסין מעוכל) נגזר. הוסף חוצץ המדגם להגיע נפח סופי של μl 330.
4. הוסף חוצץ נטרול (1 מ טריס pH 8.0), את בקבוקוני מדגם כי תאסוף eluate. מספר ונפח צלוחיות אתה עובד עם יהיה תלוי האילוצים של autosampler שלך. עבור הפרדיגמה MG4, אחד בקבוקון אוספת את הזרימה דרך שתי לאסוף את eluate. זה ידרוש כ -1.5 מ"ל טריס חיץ לנטרל 1 מ"ל של eluate. PH יעד לנטרל הוא 7.0-8.0; מבחן מבחן ה-pH הסופי עם נייר אינדיקטור pH.

5) בצעו כרומטוגרפיה

1. כל ריק מדגם פועל שאחריו יהיה להשתמש בשיטה המתוארת חלק 1. טור מאגרים הם בטמפרטורת החדר בזמן השימוש. עמודות מאוחסנות על 4 מעלות צלזיוס, בעוד מאגרים מאוחסנות בטמפרטורת החדר.
2. צרף גם את אאל או העמודה לקטינים SNA למערכת HPLC ולהפעיל שתי שיטות ריק (הזרקת הצפת בלבד). ודא כי עמודת לקטינים תואמת את לקטינים ספציפי לקטופרין (חלק 2).
3. כרומטוגרף שלוש דגימות פלזמה, הזרקת ריק בין כל דגימה מוזרק, עבור סכום כולל של 7 ריצות HPLC. שברים של ריצות ריק לא צריך להיות אסף.

6) Desalt שנאספו שברים

לשבריר אחד להשתמש באחד 1 מ"ל ווטרס אואזיס HLB SPE מחסנית כדלקמן:

1. צרף את מספר מחסניות נדרש סעפת ואקום.
2. רטוב כל מחסנית עם ACN מ"ל 1 80% חומצה פורמית 1% (מד ואקום על סעפת צריך לקרוא 5-20 lnHg).
3. לאזן מחסניות עם חומצה פורמית 0.1 מ"ל 1.5% (מד ואקום על סעפת צריך לקרוא 5-20 lnHg)
4. טען נפח שלם של דגימה אחת על גבי מחסנית אחת (מד אבק על סעפת צריך לקרוא 2 -. 2.5 lnHg, וקצב הזרימה לא יעלה על 1 mL / min)
5. לשטוף עם 3 מחסניות חומצה פורמית x 1 מ"ל 0.1% (מד אבק על סעפת צריך לקרוא 5-20 lnHg)
6. פפטידים Elute / glycopeptides שכותרתו לתוך צינורות Eppendorf עם אצטוניטריל 1 x 1 מ"ל 80% ב חומצה פורמית 0.1%. (מד אבק על סעפת צריך לקרוא 2-2.5 lnHg, ואת קצב הזרימה לא יעלה על 1 mL / min). צינורית אוסף יחיד אמור לשמש עבור כל מחסנית.
7. לנטרל eluate ידי הוספת 60 μl ביקרבונט 0.5 M אמוניום על כל צינור איסוף. יעד neutrpH alized הוא הוא 7.0-8.0; pH המבחן הסופי עם נייר אינדיקטור pH.
8. תתרכז פפטידים eluted / glycopeptides כדי μL 50 ~ ידי הפעלת אותם על צנטריפוגה ואקום (למשל, מלומד Thermo SpeedVac) עבור ~ 2 שעות @ 35 ° C.

7) PNGase F-העיכול

1. המדגם בדיקת pH כדי להבטיח שהוא בין 7.0-8.0. במידת הצורך, להוסיף 50 אמוניום ביקרבונט mM להגדיל את ה-pH. אם נפח דגימה סופית> 100 מדגם μl, speedvac עד שהוא μl בין 50-100.
2. הוספת 0.5 μl (250 U) גליצרול ללא F PNGase על צינור אחד מדגם לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

8) עצה דגימות Zip

1. החל PNGase F-מתעכל דגימות, ziptip כל אחד כדלקמן.
2. Ziptip רטוב עם אצטוניטריל 10 μl 100%, ואחריו אצטוניטריל 10 μl 80%, חומצה פורמית 0.1%.
3. לאזן ziptip עם חומצה פורמית μl 20 0.1%.
4. טען המדגם על ziptip על ידי pipetting אותה למעלה ולמטה באמצעות המטריצה ​​ziptip 10 פעמים.
5. שטפו את ziptip ידי pipetting 10 חומצה פורמית μl 0.1%, 5 פעמים.
6. Elute המדגם לתוך צינור Eppendorf נקי עם אצטוניטריל 10 μl 80%, חומצה פורמית 0.1%.
7. חזור על elution ולהוסיף את μl 10 second לתוך הצינור אותו.
8. Speedvac דגימות לנפח של 2 μl <.
9. דגימות Resuspend ב חומצה פורמית μl 20 0.1%. דוגמאות מוכנים כעת לניתוח על ידי LC-MS/MS.

9) נציג תוצאות:

נטיה פורוס בדרך כלל התשואות על חרוז ריכוזי לקטינים בטווח של 2-20 מ"ג / מ"ל. זה אופטימלי זיקה כרומטוגרפיה.

כרומטוגרפיה לקטינים של טריפסין-מתעכל מאדים מדולדל האדם פלזמה בדרך כלל מעשיר glycopeptides בשבריר כבול. כפי glycopeptides הם PNGase F-שטופלו לפני LC-MS/MS, הם מזוהים פפטידים עם רצף N-linked את הקונצנזוס, NXS / T (כאשר X הוא שאריות אבל פרולין), שבו asparagine שהומרה חומצה אספרטית דרך הפעולה של פפטידים PNGase פ עם מאפיינים אלה נחשבים deglycosylated פפטידים (או "deglycopeptides"). בממוצע את הזרימה דרך שבריר (FT) מ אאל או SNA כרומטוגרפיה deglycopeptides מכיל 2-4%, לעומת 30-50% של פפטידים התאושש בשבריר כבול הם deglycopeptides. בדרך כלל, באמצעות עלית QStar, 1000-1300 פפטידים יזוהו בשבריר FT, ו - 200-400 פפטידים יזוהו בשבריר כבול. שניים או יותר deglycopeptides Invertase ברורים צריכים להיות שנצפתה השבר FT ושני או יותר deglycopeptides ברורים לקטופרין בשבריר כבול (טבלה 1).

טבלה 1.

פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה עבור בידוד וזיהוי glycopeptides glycan באופן ספציפי. כפי glycosylation משתנה בהרחבה בתוך אורגניזם, במיוחד במהלך פיתוח בפתוגנזה, טכניקה זו עשויה להיות ישימה כתובת מגוון רחב של שאלות. בפרט, אנו משתמשים בשיטה באופן סלקטיבי להעשיר glycopeptides ששונו עם סרטן הקשורים epitopes כצעד ראשון לקראת גילוי סמן ביולוגי.

עבודה זו נתמכה על ידי טכנולוגיות proteomic קליניים בסרטן יוזמת, 5U24CA126477-04.