Un metodo HPLC lectina per arricchire Peptidi selettivamente glicosilata da campioni biologici complessi

Lectina coniugato perline POROS sono stati impiegati per HPLC. Standard glicopeptide serviti come controlli positivi e negativi. MARS-14 impoverito, tripsina-digerito plasmatiche umane è stato cromatografato e flow-through (FT) e le frazioni legato raccolti per analisi ESI-LC-MS/MS. Glicopeptidi sono stati arricchiti nella frazione legata, rispetto a FT.

Glicani sono una classe importante di modificazioni post-traduzionali. Tipicamente presenti su secreto e molecole extracellulari, strutture glycan segnalare lo stato interno della cellula. Glicani sulle cellule tumorali tendono ad avere abbondante acido sialico e frazioni fucosio. Proponiamo che queste associata al cancro varianti glycan essere sfruttata per lo sviluppo di biomarcatori volti a diagnosticare in fase iniziale della malattia. Di conseguenza, abbiamo sviluppato una spettrometria di massa a base di flusso di lavoro che incorpora cromatografia su matrici di affinità formata da lectine, proteine ​​che si legano strutture glycan specifici. Le lectine Sambucus nigra (SNA) e Aleuria aurantia (AAL), che legano l'acido sialico e fucosio, rispettivamente, sono state accoppiate in modo covalente a microsfere POROS (Applied Biosystems) e confezionata in colonne PEEK per cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC). In breve, il plasma è stato impoverito dei quattordici proteine ​​più abbondanti con un sistema di rimozione più affinità (MARS-14; Agilent). Impoverito plasma è stato tripsina-digerito e separati in flow-through e le frazioni vincolato da SNA o AAL HPLC. Le frazioni sono stati trattati con PNGaseF per rimuovere N-glicani legate, e analizzati da LC-MS/MS su Elite QStar. I dati sono stati analizzati utilizzando il software Mascot. Il disegno sperimentale inclusi controlli positivi-fucosylated e sialylated umano glicopeptidi e lattoferrina negativo glicopeptidi mannosio controlli alto da Saccharomyces cerevisiae, che sono stati utilizzati per monitorare la specificità di cattura lectina. Le caratteristiche principali di questo flusso di lavoro includono la riproducibilità derivato dal formato HPLC, l'identificazione positiva dei glicopeptidi catturato e PNGaseF trattati dai loro motivi Asn-Xxx-Ser/Thr deamidato, e valutazione della qualità utilizzando standard glicoproteina. Protocollo di ottimizzazione incluso anche determinare il rapporto appropriato di materiale di partenza alla capacità di colonna, individuando la cattura più efficiente e buffer di eluizione, e il monitoraggio della PNGaseF-trattamento per garantire la piena deglycosylation. Direzioni future includono l'utilizzo di questo flusso di lavoro di effettuare la spettrometria di massa a base di esperimenti di scoperta sul plasma da pazienti affetti da tumore al seno e individui di controllo.

1) Preparare lectina coniugato colonne POROS

1. Indossare una maschera per la protezione contro l'inalazione di Poros-AL perline durante le fasi di 1,1-1,2. Pesare la quantità desiderata di perline POROS (100 mg beads/300 microlitri di volume finale) e trasferire in una provetta pulita eppendorf.
2. Lavare le perline con l'aggiunta di 1 ml di soluzione salina tampone fosfato (PBS). Perle di pellet per centrifugazione in una microcentrifuga alla massima velocità per 3 minuti. Rimuovere il surnatante e ripetere il lavaggio.
3. Pesare la quantità desiderata di lectina non coniugato (1 - 4 mg / 200 perline microlitri) e trasferirlo in una provetta pulita eppendorf. Aggiungi PBS per formare un 5 - 20 mg / ml soluzione. Riserva di 25 ml di questa soluzione.
4. Trasferire la soluzione rimanente lectina ai talloni POROS. Aggiungi cyanoborohydride di sodio ad una concentrazione finale di 50 mm. Posizionare il tubo su una sedia a dondolo e reagire notte a temperatura ambiente. (Nota:. Cyanoborohydride sodio è tossico e deve essere gestito in una cappa aspirante I rifiuti contaminati devono essere smaltite in modo appropriato.)
5. Pellet le perline POROS come al punto 1.2. Rimuovere il surnatante e salvarli come il post-coniugazione soluzione.
6. Lavare le perline con 1 mL di tampone tempra (1 M Tris-Cl, pH 7,4). Perline pellet come al punto 1.2 e in modo sicuro surnatante.
7. Bloccare i siti rimanenti reattivi sulle palle POROS con 1 mL di tampone tempra. Aggiungi cyanoborohydride di sodio ad una concentrazione finale di 50 mm. Posizionare il tubo su una sedia a dondolo e incubare a temperatura ambiente per 30 min.
8. Perline pellet come al punto 1.2 e scartare il surnatante.
9. Lavare con 1 ml di perline 1 M NaCl. Perline pellet surnatante e gettarlo. Ripetere quattro volte per un totale di cinque lavaggi. Le perle sono ora pronti per il confezionamento.
10. Per determinare la quantità di proteina che è stato coniugato con le perline POROS, eseguire un test di concentrazione di proteine ​​sulle soluzioni lectina pre-coniugato e post-coniugati. La differenza di concentrazione è la quantità di proteina che è stato coniugato con le perline. La quantità di proteina coniugata per volume cordone uguale la concentrazione di lectina sul perline. Concentrazioni di lectina target sono tra 2 -20 mg / ml.

2) Imballaggio della lectina coniugato perle POROS in una colonna PEEK

1. Assemblare il sistema di imballaggio (segue descrizione) e il supporto su un supporto ad anello in metallo. Il sistema è composto da imballaggio, dal basso verso l'alto, limitatore di pressione, colonna fine accoppiatore 1, fritta, colonna (2 x 50 mm), colonna accoppiatore end 2, connettore colonna, colonna fine accoppiatore 3, colonna (4,5 x 50 mm), fine accoppiatore colonna 4 e il montaggio finale. La colonna superiore funge da serbatoio per il materiale di imballaggio.
2. Risospendere le sfere POROS nel volume desiderato di tampone A (10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM di cloruro di sodio, cloruro di calcio 10 mM, 10 mM cloruro di magnesio). Se una colonna di imballaggio (~ 200 microlitri di volume letto), risospendere in 400 A. Buffer microlitri
3. Trasferimento coniugato perline POROS nella colonna superiore (il serbatoio). Aggiungi tampone A al serbatoio fino a quando il buffer raggiunge la cima della colonna. Posizionare con delicatezza il raccordo finale sulla parte superiore della colonna, cercando di evitare bolle d'aria nella colonna. Collegare il raccordo fine della colonna superiore per il sistema HPLC.
4. Pacco la colonna che scorre tampone A attraverso il sistema. Inizia con una portata di 0,5 ml / min. Aumentare la velocità di flusso di 0,5 mL / min ogni minuto fino a quando 4 mL / min o la pressione massima (3000 psi) è stato raggiunto. Continua alla portata massima possibile fino almeno 35 ml di tampone A sono passati attraverso la colonna.
5. Spegnere le pompe e permettere la pressione sulla colonna per scendere a <20 psi.
6. Delicatamente, smontare il sistema di imballaggio, a partire dall'alto. Quando la colonna 2 della fine accoppiatore è raggiunto, rimuovere con attenzione. Alcuni imballaggi sono da estrusione dalla parte superiore della colonna. Con una lametta o simili bordo affilato, rimuovere delicatamente le perline estrusione, lasciando una superficie delle sfere che è anche con la parte superiore della colonna. Non applicare la pressione ai talloni mentre fanno questo.
7. Sganciare la colonna confezionato dallo stand anello. Inserire una nuova fritta in un accoppiatore nuova fine e girare la colonna riempita oltre a collegare questo con la fritta / fine accoppiatore sul aperti (ex superiore) fine colonna.
8. Etichetta di colonna in modo appropriato. Ora è pronto per l'uso. Quando non in uso, la colonna possono essere memorizzati in PBS con sodio azide 0,02% a 4 ° C per un massimo di 6 mesi.

3) Programmare il metodo HPLC

1. I dettagli della programmazione del HPLC varierà a seconda delle specificità dei software del produttore. Usiamo un paradigma MG4 Michrom HPLC. Su questa macchina, i metodi sono costruiti e accedere sotto la scheda "Impostazioni" nella parte superiore dello schermo. Programmare il seguente metodo:
   

   Tempo	Portata (microlitri / min)	% A	% B
   00:00	50	100	0
   09:00	50	100	0
   09:01	500	0	100
   13:50	500	0	100
   13:51	3000	100	0
   19:50	3000	100	0

   
   Tampone A: 10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM di cloruro di sodio, cloruro di calcio 10 mm, 10 mM di cloruro di magnesio
   Buffer B: 0,5 M acido acetico
   Il rilevatore di raggi UV deve essere programmato per leggere a 280 nm 0:00-19:50. L'asse y deve essere regolato per rilevare a basso assorbimento livelli, ad esempio, 0 -. 50 UA.
2. Se un campionatore automatico è disponibile, programma il seguente calendario per la raccolta della frazione. In caso contrario, raccogliere le frazioni a mano, come indicato durante l'esecuzione di cromatografia.
   

   Frazione	Ritardo alla raccolta di iniezione del campione	Durata della raccolta (min)
   Flow-through	2,8	4,1
   Legato	9	2,6

4) Preparare i campioni per HPLC

1. Prima di utilizzare in questo protocollo, plasma umano dovrebbe essere impoverito del 14 proteine ​​più abbondanti, con una colonna MARS (Agilent, Santa Clara, CA). Impoverito plasma umano lattoferrina e invertasi lievito deve essere valutata individualmente tripsina-digerito e dissalati come descritto in precedenza ^1.
2. Per preparare la lectina specifica lattoferrina standard, eseguire la cromatografia su 50 ug-tripsina digerito lattoferrina oltre sia il AAL o la colonna SNA usando il metodo nella parte 3. La frazione legata conterrà lectina specifica glicopeptidi lattoferrina. Neutralizzare i campioni come nella parte 4.4, e desalt come in parte 6. Risospendere il campione in 1 ml di tampone A. Il campione risultante è pronto per l'uso.
3. Tre sperimentale replica verrà eseguita. Per la preparazione del campione per tre repliche, aggiungere 3 pmol di tripsina-digerito invertasi e 1 ml di lectina specifica lattoferrina (sia AAL-LAC o SNA-ALC) a 30 microlitri MARS-impoverito, tripsina-digerito, equivalenti al plasma (PE). Un PE è definito come il volume di plasma non-processed/intact/original da cui provengono una data quantità di trattati al plasma (MARS-tripsina impoverito e digerito). Aggiungi tampone A al campione di raggiungere un volume finale di 330 microlitri.
4. Aggiungi buffer di neutralizzazione (1 M Tris pH 8,0), per le provette del campione che raccoglierà eluato. Il numero e il volume di flaconcini di lavorare con dipenderà dalle costrizioni del campionatore automatico. Per il paradigma MG4, un flaconcino raccoglie la flow-through e due raccogliere l'eluato. Richiederà circa 1,5 ml Tampone Tris di neutralizzare 1 ml di eluato. PH neutralizzato obiettivo è 7,0-8,0; test del pH prova finale con una cartina di tornasole.

5) Eseguire la cromatografia

1. Tutte le piste vuote e il campione che seguono utilizzerà il metodo descritto nella parte 1. La colonna e buffer sono a temperatura ambiente durante l'uso. Le colonne sono conservati a 4 ° C, mentre i buffer vengono conservati a temperatura ambiente.
2. Attaccare o il AAL o la colonna lectina SNA al sistema HPLC ed eseguire due metodi vuoto (iniezione di buffer solo A). Assicurarsi che la colonna lectina corrisponde alla lectina specifica lattoferrina (Parte 2).
3. Cromatografo i tre campioni di plasma, l'iniezione di un vuoto tra ogni campione iniettato, per un totale di 7 corre HPLC. Frazioni da corre vuoto non devono essere raccolti.

6) Desalt raccolti frazioni

Per ogni frazione utilizzare uno da 1 ml Acque Oasis HLB cartuccia SPE come segue:

1. Fissare il numero di cartucce necessarie al collettore vuoto.
2. Bagnate ogni cartuccia con 1 mL ACN 80% in 1% di acido formico (vacuometro sul collettore dovrebbe leggere 5-20 lnHg).
3. Equilibrare cartucce con 1,5 ml di acido formico allo 0,1% (vacuometro sul collettore dovrebbe leggere 5-20 lnHg)
4. Carico intero volume di un campione su una cartuccia (Vuotometro sul collettore dovrebbe leggere 2 -. 2,5 lnHg, e portata non dovrebbe superare 1 ml / min)
5. Lavare le cartucce con 3 x 1 ml di acido formico allo 0,1% (Vuotometro sul collettore dovrebbe leggere 5-20 lnHg)
6. Peptidi eluire / glicopeptidi in tubi eppendorf etichettati con 1 x 1 mL acetonitrile 80% a 0,1% acido formico. (Vuotometro sul collettore dovrebbe leggere 2-2,5 lnHg, e portata non dovrebbe superare 1 ml / min.) Un tubo di raccolta unica dovrebbe essere utilizzato per ogni cartuccia.
7. Neutralizzare eluato con l'aggiunta di 60 microlitri di bicarbonato di ammonio 0,5 M per ogni tubo di raccolta. Obiettivo neutrpH è alized è 7,0-8,0; pH prova finale con una cartina di tornasole.
8. Concentrato peptidi eluiti / glicopeptidi a ~ 50 microlitri eseguendoli su una centrifuga a vuoto (ad esempio, Thermo Savant SpeedVac) per circa 2 ore a 35 ° C.

7) PNGase F-digestione

1. PH del campione di prova per assicurarsi che sia tra 7,0-8,0. Se necessario, aggiungere 50 bicarbonato di ammonio mM per aumentare il pH. Se il volume del campione finale è> 100 l, campione speedvac fino a quando non è tra 50-100 microlitri.
2. Aggiungere 0,5 microlitri (250 U) glicerolo senza F PNGase a ciascuna provetta ed incubare a 37 ° C durante la notte.

8) campioni Suggerimento Zip

1. A partire da PNGase F-digerito campioni, ziptip ognuno nel modo seguente.
2. Ziptip bagnato con 10 microlitri acetonitrile al 100%, seguita da 10 microlitri acetonitrile 80%, 0,1% di acido formico.
3. Equilibrare ziptip con 20 microlitri di acido formico 0,1%.
4. Caricare il campione attraverso la ziptip pipettando su e giù attraverso la matrice ziptip 10 volte.
5. Lavare la ziptip pipettando 10 microlitri di acido formico 0,1%, 5 volte.
6. Eluire il campione in una provetta eppendorf pulita con 10 microlitri acetonitrile 80%, 0,1% di acido formico.
7. Ripetere l'eluizione e aggiungere il secondo 10 microlitri nel tubo stesso.
8. Speedvac i campioni ad un volume di <2 microlitri.
9. Risospendere i campioni in 20 microlitri di acido formico 0,1%. I campioni sono ora pronti per l'analisi LC-MS/MS.

9) Risultati Rappresentante:

La coniugazione POROS rendimenti generalmente concentrazioni lectina sul tallone nel range di 2 - 20 mg / mL. Questo è ottimale per cromatografia di affinità.

Cromatografia lectina di tripsina-digerito MARS-impoverito plasma umano arricchisce tipicamente glicopeptidi nella frazione legata. Mentre il glicopeptidi sono PNGase F-trattati prima LC-MS/MS, essi sono identificati come peptidi con la N-linked sequenza consenso, NXS / T (dove X è un qualsiasi residuo, prolina), in cui l'asparagina è stato convertito in un acido aspartico attraverso l'azione di PNGase F. Peptidi con queste caratteristiche sono considerati peptidi deglicosilata (o "deglycopeptides"). In media la flow-through (FT) frazione da AAL o SNA cromatografia contiene deglycopeptides 2-4%, mentre il 30-50% dei peptidi recuperato nella frazione legata sono deglycopeptides. Di solito, usando una Elite QStar, 1000-1300 peptidi saranno identificati nella frazione FT, e 200-400 peptidi saranno identificati nella frazione legata. Due o più deglycopeptides invertasi distinte devono essere osservate nella frazione FT e due o più distinte deglycopeptides lattoferrina nella frazione legata (Tabella 1).

Tabella 1.

Questo protocollo fornisce un metodo rapido per isolare e identificare glicopeptidi in una glycan specifico modo. Come glicosilazione varia ampiamente all'interno di un organismo, in particolare durante lo sviluppo e la patogenesi, questa tecnica può essere applicabile per affrontare una vasta gamma di domande. In particolare, stiamo usando il metodo per arricchire selettivamente glicopeptidi che sono stati modificati con associata al cancro epitopi come primo passo verso la scoperta di biomarcatori.

Questo lavoro è stato sostenuto dal Technologies Proteomica clinica per il cancro iniziativa, 5U24CA126477-04.