著者は、アシスタントと科学的な議論について Tessem とハンコックのラボのメンバーに感謝したいと思います。著者は、アンドリュー ・ ニールソン博士 (バージニア工科大学) がココア派生エピカテキン単量体の一部を提供することをありがちましょう。本研究は、JST に糖尿病アクション ・ リサーチと教育財団からの助成金によって支えられました。

1. 細胞培養
<ol><li>文化 INS 1 派生 10% 牛胎児血清 (FBS)、1% ペニシリン-ストレプトマイシン、10 mM HEPES、グルタミン 2 mM、1 mM ピルビン酸ナトリウム 0.05 mM 2-メルカプトエタノール9,10,11 と添加 RPMI 1640 年に 832/13 β 細胞 ,12,13。</li>
	<li>完全な RPMI 1640 メディアの 8 mL を追加して 10 分 Neutralize トリプシンの 37 ° C で培養、0.25% トリプシンの 2 mL を使用して T75 フラスコから 832/13 セルを削除します。</li>
	<li>診断を使用してセルをカウントし、ステップ 1.2 で 900 μ L の PBS からの細胞容積の 100 μ L を希釈します。</li>
	<li>6 2 × 106セル/ml の密度でプレート 832/13 セルはよく料理します。</li>
	<li>呼吸の実験を開始する前に 48 h 37 ° C および 5% CO2で加湿のインキュベーターでの細胞を培養します。</li>
</ol>2. 高解像度呼吸用細胞の調製
<ol><li>
ココアの派生エピカテキン単量体と 832/13 セルを扱います。
	<ol>
<li>37 ° C、5% CO2で加湿のインキュベーターでめっき後 24 h の 832/13 細胞を培養します。</li>
		<li>めっき後メディア 24 h に変更し、車両制御 (3 ウェルズ) や 100 nM ココア モノマー (3 井戸)、37 ° C、5% CO2で加湿のインキュベーターで追加 24 h (合計 48 h) の文化に続いて 832/13 セルを扱います。</li>
		<li>1 低グルコース分泌の試金 (SAB) のバッファー 5 分吸引バッファー x 832/13 セルを洗浄し、変更低血糖 SAB x 1 時間ごと、3 時間の低血糖 SAB x 1 に 832/13 セルを孵化させなさい。<ol>
<li>33.32 g の NaCl、KCl、1.73 g、KH2PO4MgSO4 0.7 g の 0.82 g を 10 x SAB と H2O 500 mL の最終巻を追加。滅菌フィルター最終的な解決策。</li>
			<li>0.25 M CaCl235 %bsa 溶液、NaHCO3 0.21 g 0.57 mL 作る低血糖 SAB SAB、100 μ L の 45% のグルコース、1 M HEPES、1 mL の 2 mL x 10 の 10 ml × 1 H2O に 100 mL の最終巻を追加。滅菌フィルター最終的な解決策。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
クルクミンと 832/13 セルを扱います。
	<ol>
<li>37 ° C、5% CO2で加湿のインキュベーターでめっき後 48 時間 832/13 細胞を培養します。</li>
		<li>1 低血糖 SAB x 5 分吸引バッファーの 832/13 セルを洗浄し、変更低血糖 SAB x 1 時間ごと、3 時間の低血糖 SAB x 1 に 832/13 セルを孵化させなさい。</li>
		<li>1 低血糖 SAB x 3 時間培養の 2.5 時間後バッファーを吸引し、車両制御と低グルコース SAB または 30 分の 40 μ M クルクミン x 1 のセルを孵化させなさい。次の孵化、バッファーを吸引します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
高解像度の呼吸のトリプシンで細胞を収穫
	<ol>
<li>1 低血糖 SAB x 3 時間培養後 250 μ L/ウェル 0.25% トリプシンのプレートからセルを削除します。</li>
		<li>車両制御または 4 ml を 15 mL の円錐管に SAB の関心の複合治療 3 井戸からトリプシンのセルを結合します。</li>
		<li>診断を使用してセルをカウントし、ステップ 2.3.2 で 900 μ L の PBS からの細胞容積の 100 μ L を希釈します。</li>
		<li>低糖各商工会議所の適切な濃度で 3 mL にする SAB x 1 のセルの適切な数を希釈します。データは、1 × 106セル/mL の濃度が最も有効であることを示します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
高解像度の呼吸の機械的解離でセルを収穫
	<ol>
<li>1 x 3 時間培養後低血糖、SAB は、それぞれに低グルコース SAB もゆっくりと機械的解離でプレートからセル 1000 μ L ピペット チップでピペッティングによる爆破 1 x の 1 mL を追加します。</li>
		<li>車両制御または呼吸のための 15 mL の円錐管に 3 mL SAB の合計への関心の複合治療 3 井戸からセルを結合します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 高解像度の呼吸
<ol><li>高解像度の呼吸の準備。
	<ol>
<li>高解像度の呼吸および呼吸の分析プログラムを起動して、デスクトップに接続します。</li>
		<li>両院から 70% エタノールを吸引します。45 分以上 70% エタノールでこれらの部屋を浸します。</li>
		<li>70% エタノール, 各ステップ後吸引で 2 回部屋を洗ってください。</li>
		<li>3 回で ddH2O、各ステップ後吸引チャンバーを洗います。</li>
		<li>DdH2O. 商工会議所プランジャーをすすいでください。これは、プランジャーとチタン ポートから残留エタノールをクリーンアップします。</li>
	</ol></li>
	<li>ポーラロ グラフ法による酸素センサーの校正。
	<ol>
<li>継続的に 2.0 データ記録間隔と 750 rpm、37 ° C でチャンバー内電磁攪拌バーを使用してバッファーを攪拌各 oxygraph 室に 2.4 x 低グルコース SAB バッファー 1 mL を追加 s f7 キーのボタンを押すと、タブを開く「システム」というラベルの付いた。プランジャーを押すすべての方法で、レンチの曝気設定に撤回し。安定した酸素流量が得られるまで 1 時間の最小値の平衡機をしましょう。</li>
		<li>実験の期間中、37 ° C でマシンを設定します。偏波電圧を 800 に設定 mV、f7 キーのボタンを押すと「酸素、O2」というラベルの付いたタブを開いて 2 ゲインを持つ。酸素濃度の変化が安定している間、少なくとも 30 分間 SAB バッファーの酸素濃度を平衡 (未満 2 pmol/(s*mL))。</li>
		<li>酸素濃度安定化、次の酸素濃度の変化が安定して酸素濃度変化のバック グラウンド測定を確立する地域を選択します。<ol>
<li>Shift キーを押し、マウスを左クリックして選択した領域でマウスをドラッグして領域を選択します。2 つの部屋のそれぞれに対応する、各トレースの選択した領域と"R1"への変更に関連付けられている文字をクリックします。</li>
			<li>左下の「O2校正」ボックスをダブルクリックして、画面の角を右、R1 として「空気校正」の「マークの選択」ボタンをクリック、衆参両院の「調整とクリップボードにコピーします」を選択。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>2.1.5 または 2.2.5 832/13 β 細胞の呼吸の評価は手順で準備。
	<ol>
<li>1 x 低グルコースお手元で 2.4 mL 各商工会議所 (車両処理細胞、化合物の処理セルと 1 つの室を用いて 1 つの区域) のサンプルを読み込む機械的解離方法 (測定後の-20 ° C で凍結) を使用する場合 (ビシンコニン酸) BCA アッセイによってタンパク質濃度の細胞サンプルの 0.5 mL を保持します。<ol>
<li>すべての方法プランジャーを押し、残留量を吸引します。750 rpm とすべての後続のステップの 37 ° C で実験を通して継続的に細胞をかき混ぜます。F4 をクリックしてサンプルが読み込まれるときに「セル」としてラベル付けによって印を作りなさい。</li>
			<li>30 分のサンプルを測定します。信号の安定化後、3.2.3 で説明するように低血糖状態 (2.5 mM グルコース) に対応する酸素濃度変化の領域を選択します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>信号の安定化に達した後は、注射器を使用してポートをロード チタンを通して各商工会議所に 45% 滅菌グルコース溶液 (16.7 mM 最終濃度) の 12.5 μ L を追加します。マーク測定「ブドウ糖」として治療を追加 3.3.1 に記載されているを確認します。Let の信号を安定させるため、安定した酸素流量を達成するまでに細胞呼吸を記録。3.2.3 で説明するように酸素濃度の変更のこの地域を選択します。16.7 mM グルコース読書、刺激条件7に対応します。</li>
		<li>信号の安定化に達した後は、5 mM オリゴマイシン (2.5 μ M 最終濃度) 各チャンバーに読み込みポート経由の 1 μ L を追加します。マーク測定"OligoA"としてトリートメントを追加 3.3.1 に記載されているを確認します。Let の信号を安定させるため、安定した酸素流量を達成するまでに細胞呼吸を記録。3.2.3 で説明するように曲線のこの領域を選択します。オリゴマイシン A は ATP 合成酵素を阻害する、電子と酸化的リン酸化されない7のリークでは唯一酸素磁束発生します。</li>
		<li>信号の安定化に達した後は、最大呼吸が確立されるまで、1 μ L 単位で 1 mM FCCP を追加します。これは最大の共役呼吸を表します。3-4 μ L の間 FCCP 濃度である十分な (1.5-2.0 μ M 最終) INS 1 832/13 セルの最大の共役呼吸を誘発します。治療が追加されるときに、3.3.1 で説明したよう「FCCP」というラベルの付いた印を作りなさい。Let の信号を安定させるため、安定した酸素流量を達成するまでに細胞呼吸を記録。3.2.3 で説明するように曲線のこの領域を選択します。FCCP は、脱共役剤です。これは共役呼吸7を測定することができます。</li>
		<li>信号の安定化に達した後は、読み込みポートを介して各部屋に 5 mM アンチマイシン A の 1 μ L (最終濃度が 2.5 μ M) を追加します。治療が追加されるときに、3.3.1 で説明したよう「アンティア」というラベルの付いた印を作りなさい。Let の信号を安定させるため、安定した酸素流量を達成するまでに細胞呼吸を記録。3.2.3 で説明するように曲線のこの領域を選択します。 注: アンチマイシン A シトクロム C レダクターゼをバインド、ユビキノン酸化を抑制する、すべての呼吸をブロックします。これにより、呼吸7を完全に停止することができます。</li>
	</ol></li>
	<li>832/13 β 細胞タンパク質濃度と呼吸の正規化を測定します。
	<ol>
<li>BCA 法13を使用して測定蛋白質のサンプルをロードで保持されるサンプルの 0.5 mL を使用しています。</li>
		<li>製造元の指示に従って希釈せず、3 通で各サンプルを実行します。</li>
	</ol></li>
	<li>細胞をトリプシンから 832/13 β 細胞呼吸計算。<ol>
<li>計解析プログラムの F3 ボタンを押してアッセイに mL 使用あたりのセル数を入力します。単位をセル/mL に変更、細胞濃度を入力し、お手元に媒体を変更</li>
		<li>選択し O2校正フォーム 3.2.3 で説明するように入力データを正規化するバック グラウンド測定値を選択します。</li>
		<li>2.5 mM グルコース、16.7 mM グルコース、オリゴマイシン A、FCCP およびアンチマイシン A 3.3.1 に記載からの測定値の選択を行います。</li>
		<li>計解析プログラム内でタンパク質濃度を入力し、呼吸測定時にそれぞれの治療のため適切な平均値を選択後各商工会議所の測定値をエクスポートします。これは F2 をクリックして、クリップボードの機能に「コピー」を押します。その他の解析プログラムで使用するデータをエクスポートします。計算のため「O2斜面ネガティブ"値を使用します。</li>
		<li>車両の 3-5 独立した実行処理コントロールと天然化合物の INS 1 832/13 β 細胞の無傷の細胞呼吸に及ぼす影響を決定するための処理セルは、データをコンパイルします。</li>
	</ol></li>
	<li>832/13 β 細胞呼吸計算から機械的に細胞を分離しました。<ol>
<li>計解析プログラムの F3 ボタンを押して BCA アッセイからタンパク質計算を入力します。単位を mg に変更、BCA 濃度を入力し、お手元に媒体を変更</li>
		<li>選択し O2校正フォーム 3.2.3 で説明するように入力データを正規化するバック グラウンド測定値を選択します。</li>
		<li>2.5 mM グルコース、16.7 mM グルコース、オリゴマイシン A、FCCP およびアンチマイシン A 3.3.1 に記載からの測定値の選択を行います。</li>
		<li>計解析プログラム内でタンパク質濃度を入力し、呼吸測定時にそれぞれの治療のため適切な平均値を選択後各商工会議所の測定値をエクスポートします。これは F2 をクリックして、クリップボードの機能に「コピー」を押します。その他の解析プログラムで使用するデータをエクスポートします。計算のため「O2斜面ネガティブ"値を使用します。</li>
		<li>車両の 3-5 独立した実行処理コントロールと天然化合物の INS 1 832/13 β 細胞の無傷の細胞呼吸に及ぼす影響を決定するための処理セルは、データをコンパイルします。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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著者が明らかに何もありません。

このプロトコルの目的は、高解像度の呼吸を使用してそのまま膵 β 細胞における呼吸速度を測定することです。このメソッドは、高められたブドウ糖のレベルに β 細胞応答の測定できます。プロトコルは、この自然に発生する単量体エピカテキンやクルクミン4,5プロトコルで示されて様々 な化合物の前処理でできます。他の種々 の化合物による治療は、前処理 (下図) または基本プロトコルに最小限の変更で呼吸器チャンバ内を扱うことにより、このプロトコルで使用できます。
様々 な方法では、このメソッドを変更することがあります。他のベータ細胞を使用できる;しかし、細胞数と SAB 洗浄時間は、実験的に決定する必要があります。プライマリの齧歯動物と人間の小島もされる可能性があります。しかし、細胞や膵島の同等の数を実験的に決定する必要があります。少なくとも 1 つの研究は、高解像度の呼吸15を使用して膵島の酸素消費量を測定しています。本研究は反応あたり 400 小島を必要が、グルコースによる呼吸変化を測定しなかった。主な組織は、高解像度 respirometers16,17でよく使用されます、その実験的トラブルシューティングの後そのまま島を悪用されました。しかし、このアッセイに必要な島の多数を与え、酸素消費量の測定の他の方法が適している主膵島呼吸の測定。
提案するプロトコルのいくつかの重要な手順があります。まず、細胞の十分な数を持っていることが重要です。私たちの研究は、1 × 106セル/mL の濃度で 832/13 β 細胞はグルコース刺激呼吸測定のための十分な表示します。0.5 x 10 を使用して測定6セル/mL 低グルコース刺激呼吸と低い信号対雑音比を示した。さらに、2 x 106セル/mL を用いた測定結果高のサンプルにサンプルのばらつきと頻繁に急速な細胞死につながった再酸素が必要な室の酸素の急速な携帯電話使用。この重要なステップをトラブルシューティングするために適切なセル数は指定したセルの行の決定実験。
2 番目の重要なステップは、高い血糖値に対応するベータ細胞を準備中です。RPMI 1640 培養液は、高血糖です。セルは、高グルコースから低血糖文化に移動しなければなりません。1 x 3 時間培養低グルコース SAB ~16.7 mM グルコース添加の重要な応答を持っている β 細胞に対して十分です。可変レスポンス グルコース添加で 3 h の結果よりも以下の期間を洗います。グルコース応答問題のトラブルシューティングは、SAB 洗浄時間の長さを増やすことで対処できます。
3 番目の重要なステップは、測定用セルを準備するための方法です。我々 のデータは、トリプシンと機械的解離両方を使用することができます、トリプシンが細胞結果より一貫した測定値とサンプル-サンプルのばらつき少ないを解放することを示します。ただしデータの強度が大きかったトリプシンを使用して作製した電池と、両方の方法で観察された傾向が維持されていた。細胞を削りなどの他のメソッドを使用する我々 のデータはトリプシンの使用はより少ないサンプル-サンプルのばらつきと18,19最も再現性のある結果であること示唆しています。
このアプローチの限界は次のとおりです。これは、唯一の 2 つの治療室ではまず、高スループット スクリーニング法ではありません。2 つのサンプルのそれぞれの実行マシンの準備時間を含め、3-4 時間の間に取る。第二に、比較的大規模な細胞濃度が ~2.2 mL 商工会議所ごとに必要なサンプル (または ~2.2 x 106セル) を与え、試金のため必要です。分析に必要な試料の量、ため主島のこのツールおよびプロトコルの使用は、大量供給が利用可能な場合を除き、限られています。この手法で呼吸のための島を使用している以前の研究は、400 〜 島/商工会議所15を使用します。大まかには、島ごとに 2 つのマウスから部屋20これは必要でしょう。3 グリセリンのセルが使用されていないので細胞透過性ではない化合物を使用して、個々 の電子チェーン コンポーネントに対する治療の効果を決定する機能は利用できません。
既存のメソッドに対してこのプロトコルの重要な利点の数があります。まず、このプロトコルは膜透過性化合物の滴定段階的にできます。これは、必要な濃度の正確な定量できるましょう。第二に、そのまま β 細胞の使用7ゾル性細胞質とミトコンドリアのグルコース代謝に及ぼす影響を照会することが可能します。これは私たちは解糖系の経路、グリセリンの細胞を使用するときに失われる観測への変更を示す表現型を観察することができます。第三に、そのまま細胞高いブドウ糖への応答を使用して、このアッセイのグリセリンのバリエーションで失われている β 細胞機能の指標としてことができます。最後に、このプロトコルは様々 な複数の化合物添加のベータ細胞の呼吸、呼吸を測定する他のツールにはない高級に及ぼす化合物を問い合せることができます。
このメソッドの将来のアプリケーションは、H2O2レベルの呼吸測定と並行して、カルシウム、ATP などのパラメーターを計測する能力を含みます。このメソッドは、他の燃料の源は、脂肪酸やケトンなどの存在下で呼吸の測定もできます。最後に、いくつかの変更と呼吸測定を併用分泌のインスリン レベルを測定こともできます。

膵臓のベータ細胞の主な目的は、グルコース刺激によるインスリン分泌を介してシステムな場合を維持することです。Β 細胞感覚主低親和性、高容量グルコーストランスポーター GLUT2 によりブドウ糖の循環の生理学的変化 (ブドウ糖トランスポーター 2、Km 16.7 mM)1。循環のブドウ糖のレベルの上昇とこの高容量低親和性トランスポーターは β 細胞内でブドウ糖を細胞内に比例して増加を促進します。グルコースは解糖系、TCA サイクル (トリカルボン酸) 細胞 ATP (アデノシン三リン酸) レベルの上昇で、その結果ミトコンドリア呼吸代謝されます。高架の ATP 濃度は ATP 敏感な K+チャネル、膜の脱分極の結果をブロックします。膜の脱分極を引き起こす電圧依存性 Ca2 +チャネルの開口部と小胞の後続のリリース バインド インスリン顆粒2。Β 細胞機能不全を示し、低下し、コントロール不良インスリン分泌と最終的には β 細胞死3(T2D) 2 型糖尿病の特徴です。ダグラス T2D 用治療薬として維持または β 細胞機能を改善するメカニズムを使用できます。
研究は、天然の有益な効果を示している膵 β 細胞4植物化合物。これらの化合物増加 β 細胞の増殖、生存、またはグルコース刺激によるインスリン分泌に効果があります。例として、最近の研究は、エピカテキン単量体ミトコンドリア呼吸の増加を介してのグルコース刺激によるインスリン分泌を高め、レベル5の細胞の ATP を増加を実証しています。したがって、これらの化合物は機能の β 細胞を増やすことができますどのように理解質量は潜在的な治療としてこれらの化合物を活用することが重要です。
細胞呼吸は、ツールの数を測定できます。高解像度計グリセリンまたはそのままのセル人口6化学変調器の滴定の使用します。このツールは、このように幅広い情報を与える異なる濃度で様々 な化合物の添加を許可します。
糖代謝と β 細胞機能との間に親密な関係を考えると、細胞呼吸の測定が重要です。細胞呼吸の測定を行うことができます独自の利点と欠点の7,8のセットを持っているそれぞれのグリセリンまたは無傷のベータ細胞を使用して。Β 細胞の透過電子輸送チェーンのさまざまな側面を測定することができます、なしで β 細胞は、グルコース取り込み代謝呼吸を誘発するメカニズムに関しては。したがって、unpermeabilized のベータ細胞の呼吸の使用は、読み出しとして酸素消費量を使用して様々 な血糖値のレベルに対する β 細胞の応答を判断する非常に有用なテクニックです。
この手法の目的は、そのまま INS 1 の酸素消費量を測定する派生 832/13 β 細胞です。この手法では、条件刺激グルコース (ブドウ糖 16.7 mM) だけでなく、unstimulatory グルコース条件 (2.5 mM グルコース) に対する β 細胞の応答を判断出来ます。Unpermeabilized 細胞を私たちは複合体を個別にテストすることはできません私は、II または III の電子輸送チェーン、手法が複雑な IV 阻害 (オリゴマイシン A) 非呼吸 (FCCP カルボニル シアン化物 - を扱う測定を許可4-(フッ素系低分子) phenylhydrazone)、呼吸 (アンチマイシン A) を完全に抑制します。本研究は、2 つの自然発生する化合物、エピカテキン単量体とクルクミン、β 細胞呼吸に及ぼす影響と同様に、そのまま unpermeabilized 膵 β 細胞における呼吸の測定の有効性を示しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>O2k Core: Oxygraph-2k</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10000-02</td>
			<td>Instrument for high-resolution respirometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DatLab 6 Program</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>27141-01</td>
			<td>Computer program for analysing high-reolution respirometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INS-1 832/13 cell line</td>
			<td>Duke University Medical Center</td>
			<td>NONE</td>
			<td>Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curcumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7727</td>
			<td>Pre-treatment of beta cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cocoa epicatechin monomer</td>
			<td>Virginia Polytechnic Institute and State University</td>
			<td>NONE</td>
			<td>Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td>832/13 beta cell media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>832/13 beta cell media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4458</td>
			<td>832/13 beta cell media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3662</td>
			<td>832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>GLL01</td>
			<td>832/13 beta cell media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td>832/13 beta cell media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>832/13 beta cell media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271</td>
			<td>Component of 10x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>Component of 10x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>Component of 10x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td>Component of 10x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td>Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Component of 1x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35% BSA Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7979</td>
			<td>Component of 1x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Component of 1x SAB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>459844</td>
			<td>Washing Oxygraph O2k Chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>Chemicals for respiration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>Chemicals for respiration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anitmycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Chemicals for respiration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23225</td>
			<td>For determining protein concentration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution respirometry to measure mitochondrial function of intact beta cells in the presence of natural compounds

高解像度の呼吸は、分離ミトコンドリア、細胞、組織の酸素消費量の測定が可能です。Β 細胞は、高グルコース濃度に応じてインスリン分泌を制御血糖レベルが体内で重要な役割を果たします。インスリン分泌は、糖代謝とミトコンドリアの呼吸によって制御されます。したがって、そのまま β 細胞呼吸を測定する糖尿病の治療として β 細胞機能を改善することが不可欠です。Β 細胞の細胞呼吸のグルコース濃度の増加の効果を測定することができますを派生そのまま 832/13 プラグイン-1 を使用します。このプロトコルは、ベータ細胞の呼吸を可能にする効果を決定する種々 の化合物の存在の有無で測定することができますそのまま細胞の呼吸に化合物を与えられました。低 (2.5 mM) または高グルコース (16.7 mM) の条件の存在下で β 細胞呼吸に及ぼすクルクミン、エピカテキン単量体、2 つの自然発生する化合物を示します。この手法は、様々 な化合物が異なるグルコース濃度の存在下でそのまま β 細胞呼吸に及ぼす影響を決定する使用できます。

準備され、プロトコルで説明されているように収穫 INS 1 832/13 β 細胞は酸素消費量 (図 1 a) 様々 な化学的介入に基づく変調を示します。呼吸の増加が観測される時グルコース濃度は 16.7 mM グルコース (図 1 b) に増加します。そのままセルはオリゴマイシン A と扱われるとき呼吸が減少します。この呼吸は、基底、nonphosphorylating 呼吸状態として定義されているリークと呼ばれます。最大呼吸は、ベータ細胞を脱共役剤 FCCP ETS 呼吸または電子輸送システム呼吸として定義されている処理するとき達成されます。最後に、呼吸はアンチマイシン A、細胞の非呼吸の酸素消費量は、ROX (残留酸素消費量) というレッテルと扱われるとき 0 にドロップされます。
セル数の違いはこの手法から得られたデータの質を大きく変えます。グルコース誘発する呼吸は、0.5、1、および 2 x 106セル/mL (図 2 a-2 C) で測定しました。細胞数および BCA を使用して蛋白質の試金のタンパク質濃度濃度を算出した 3 つのテストのセルに対応する (図 2 D)。0.5 x 10 を使用して測定6セル/mL グルコース刺激呼吸 (図 2 a)、および ETS のみは、高められた呼吸に関連付けられている証明が重要であると示されました。これは、低細胞数は結果低信号で結果を混同する雑音比を示唆しています。同様に、2 x 106セル/mL での測定は、その統計的有意性 ETS 測定 (図 2) に到達することだけによって示される有意な変動でまた起因しました。これはおそらくサンプルからサンプルに大きい変動につながったアッセイ中にチャンバーに複数回再酸素を必要とするためです。これらのデータを示す 1 × 106セル/mL の濃度が呼吸分析に必要な測定の重要なグルコース刺激呼吸、リークと ETS の結果 (図 2 b と2 e)。
このプロトコルでは呼吸のためのセルを削除するための 2 つの方法が掲載されています。37 ° C で測定が完了したときにあるトリプシンを使用してセルを削除するにはクルクミン (図 3 a) の有無、呼吸測定を示しますグルコース刺激による呼吸のメンテナンス漏れと ETS の呼吸。未処理細胞に対するクルクミン扱われる細胞の比較説明これらの呼吸パラメーター (図 3B-C) のいずれかに変更します。ココア エピカテキン単量体 (図 3 D) の有無、呼吸測定もグルコース刺激による呼吸の維持を示しますリークと ETS の呼吸。ココア エピカテキン単量体処理細胞の未処理細胞への比較は、2.5 mM と 16.7 mM グルコースだけでなくリークと ETS の呼吸 (図 3E-F)、高められた呼吸を示します。これらのデータは、クルクミンが 832/13 ベータ細胞の呼吸を高めない間ココア エピカテキン単量体 (図 3) を示しています。クルクミンは、14ホスホジエステラーゼ活性を阻害することによってインスリン分泌を高めるために示されています。そのクルクミンがミトコンドリアの機能を調節することによってインスリン分泌を高めないが示唆された.我々 は既に、ココア エピカテキン単量体の存在下で文化がミトコンドリアの電子伝達鎖5のさまざまなコンポーネントの発現を誘導することを実証しました。また (オリゴマイシンによって誘導される) リーク状態に高められた呼吸が観測されたと ETS (FCCP による電子輸送システム)。このツールの使用は、将来の研究のための潜在的なターゲットの数を示しています。
細胞をトリプシン削除する代わりに、機械的解離もを実行できること提示の洗浄技術は、37 ° c. で完了したとき呼吸測定は、クルクミンやココア エピカテキン単量体 (図 4 a-c) の有無で行われました。これらのデータは、しかし感度が減少するよう、細胞のトリプシン前処理との傾向が維持されているを示しています。コントロールとココアのエピカテキン単量体は、グルコース刺激を維持する細胞治療、増加のサンプル-サンプルのばらつきによるグルコース刺激呼吸がリークと ETS の呼吸、クルクミン細胞のみ保持されます。トリプシン セル準備の傾向は、(図 4-F) 維持された、機械的解離によって導入された大きいサンプル-サンプルのばらつきの推定上のすべてのパラメーターの意義が減少しましたし、タンパク質の濃度ではなく、セルの数を正規化します。
これらのデータは、そのまま INS 1 832/13 β 細胞の呼吸を測定するこのプロトコルを使用することができることを示しています。さらに、我々 のプロトコルは信号対雑音比を最大化するために正確な測定のための最適なセル数とセルを準備するための方法を示唆しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57053/57053fig1.jpg"> 図 1: そのまま 832/13 β 細胞の代表的な呼吸曲線。そのまま 832/13 ベータ細胞のオリゴマイシン 2.5 mM 16.7 mM グルコース、グルコース 2.5 μ M (図 1 a)、2 μ M FCCP (カルボニル シアン化物 -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) と 2.5 μ M アンチマイシン A の呼吸測定します。16.7 mM グルコース] セクション (図 1 b) の拡張であるグルコース刺激による呼吸の増加を示す. します。セルは、1 x 106セル/mL の濃度を測定しました。リークは、基底、nonphosphorylating 呼吸状態を指します、ETS は、電子伝達系の共役の呼吸容量、ロックスは、ミトコンドリアの呼吸が阻害される後残留酸素消費量を指します。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57053/57053fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57053/57053fig2.jpg"> 図 2: 832/13 β 細胞のグルコース誘導性の呼吸測定に必要な数の決定します。そのまま 832/13 β 細胞呼吸 (A) 0.5 × 106セル/mL (B) 1 x 10 の6セル/mL、または (C) 2 つの 106セル/mL の濃度で測定されます。(D) 蛋白質濃度 0.5 x 10 の6セル/mL、1 x 106セル/mL、および 2 × 106セル/mL に対応します。(E) 0.5 x 10 の6セル/mL、1 x 10 の6セル/mL、および 2 × 106セル/mL で呼吸の比較。未満 2.5 mM 2.5 μ M 16.7 mM グルコース、グルコースを測定した呼吸オリゴマイシン、2 μ M FCCP および 2.5 μ M アンチマイシン A の条件。2.5 と 16.7 mM グルコースと呼吸は、β 細胞のグルコース刺激呼吸応答を示しています。オリゴマイシン後呼吸漏れ呼吸 (基底、nonphosphorylating 呼吸状態) を示します。FCCP 後呼吸 (カルボニル シアン化物 -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) 治療 (電子輸送システム、ETS の呼吸容量の共役) を示します。n = 6 の独立した実行します。データ平均 ± SEM. として表示されます * p < 0.05 * * p < 0.01 * * * p < 0.001、* * * p < 0.0001。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57053/57053fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57053/57053fig3.jpg"> 図 3: トリプシンを使用して、リリース後 832/13 β 細胞の呼吸測定。単量体のココア エピカテキンの有無で 832/13 β 細胞培養やクルクミンと呼吸をトリプシンを使用してセルを解放した後測定しました。未満 2.5 mM 2.5 μ M 16.7 mM グルコース、グルコースを測定した呼吸オリゴマイシン、2 μ M FCCP および 2.5 μ M アンチマイシン A の条件。2.5 と 16.7 mM グルコースと呼吸呼吸のグルコース刺激を示しています。オリゴマイシン後呼吸漏れ呼吸 (基底、nonphosphorylating 呼吸状態) を示します。FCCP 後呼吸 (カルボニル シアン化物 -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) 治療 (電子輸送システム、ETS の呼吸容量の共役) を示します。アンチマイシン治療後呼吸は、残留酸素消費量 (ロックス) を示します。クルクミン 832/13 細胞の (A) 治療維持治療のため呼吸を適切に変更します。(B) 代表的なトレースおよび (C) の平均クルクミン細胞のデータは 832/13 ベータ細胞の呼吸への変更を説明します。832/13 ココア エピカテキン単量体細胞の (D) 治療は、治療による呼吸の適切な変更を保持します。(F) と (E) 代表的なトレースは、ココア エピカテキン単量体が処理セルを示しますココア エピカテキン単量体治療後すべてのパラメーターで高められた呼吸のデータの平均です。(G) すべての 3 つのパラメーターは、比較のため一緒に掲載されています。n = 6 の独立した実行します。データ平均 ± SEM. として表示されます * p < 0.05 * * p < 0.01 * * * p < 0.001、* * * p < 0.0001。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57053/57053fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57053/57053fig4.jpg"> 図 4: 832/13 β 細胞の機械的解離を使用して、リリース後の呼吸測定。単量体のココア エピカテキンの有無で 832/13 β 細胞培養やクルクミンと呼吸を機械的解離を使用してセルを解放した後測定しました。未満 2.5 mM 2.5 μ M 16.7 mM グルコース、グルコースを測定した呼吸オリゴマイシン、2 μ M FCCP および 2.5 μ M アンチマイシン A の条件。2.5 と 16.7 mM グルコースと呼吸は、β 細胞のグルコース応答を示しています。オリゴマイシン後呼吸漏れ呼吸 (基底、nonphosphorylating 呼吸状態) を示します。FCCP 後呼吸 (カルボニル シアン化物 -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) 治療 (電子輸送システム、ETS の呼吸容量の共役) を示します。データの平均未処理細胞または細胞 (B) クルクミンの細胞 (A) 又は (C) ココア エピカテキン単量体はその機械的解離を示すリークしながら、すべての治療におけるグルコース刺激による呼吸を維持し、扱われるクルクミン細胞のみで ETS の意義が失われます。クルクミン (D) または (E) ココア エピカテキン単量体に未処理細胞の比較は、ココア エピカテキン単量体クルクミンと呼吸に重大な変更なしですべてのパラメーターの高められた呼吸を示します。(F) すべての 3 つのパラメーターは、比較のため一緒に掲載されています。n = 6 の独立した実行します。データ平均 ± SEM. として表示されます * p < 0.05 * * p < 0.01 * * * p < 0.0001。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57053/57053fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

このプロトコルの目的は、高解像度の呼吸を使用してそのまま 832/13 ベータ細胞に及ぼす天然化合物の存在下でのミトコンドリアの呼吸にグルコース依存性の変化を測定するためです。

天然化合物の存在下でそのまま β 細胞のミトコンドリア機能を測定するための高解像度の呼吸

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

high-resolution-respirometry-to-measure-mitochondrial-function-intact

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.8K ビュー.  Brigham Young University. このプロトコルの目的は、高解像度の呼吸を使用してそのまま 832/13 ベータ細胞に及ぼす天然化合物の存在下でのミトコンドリアの呼吸にグルコース依存性の変化を測定するためです。

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A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in living cells by photo-conversion of matrix targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP) in a subset of mitochondria. The rate at which the photoconverted molecules equilibrate across the entire mitochondrial population is used as a measure of fusion activity. Thus far measurements were performed using a single cell time lapse approach, quantifying the equilibration in one cell over an hour. Here, we scale up and automate a previously published live cell method based on using mtPAGFP and a low concentration of TMRE (15 nm). This method involves photoactivating a small portion of the mitochondrial network, collecting highly resolved stacks of confocal sections every 15 min for 1 hour, and quantifying the change in signal intensity. Depending on several factors such as ease of finding PAGFP expressing cells, and the signal of the photoactivated regions, it is possible to collect around 10 cells within the 15 min intervals. This provides a significant improvement in the time efficiency of this assay while maintaining the highly resolved subcellular quantification as well as the kinetic parameters necessary to capture the detail of mitochondrial behavior in its native cytoarchitectural environment.
Mitochondrial dynamics play a role in many cellular processes including respiration, calcium regulation, and apoptosis1,2,3,13. The structure of the mitochondrial network affects the function of mitochondria, and the way they interact with the rest of the cell. Undergoing constant division and fusion, mitochondrial networks attain various shapes ranging from highly fused networks, to being more fragmented. Interestingly, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Charcot Marie Tooth 2A, and dominant optic atrophy have been correlated with altered mitochondrial morphology, namely fragmented networks4,10,13. Often times, upon fragmentation, mitochondria become depolarized, and upon accumulation this leads to impaired cell function18. Mitochondrial fission has been shown to signal a cell to progress toward apoptosis. It can also provide a mechanism by which to separate depolarized and inactive mitochondria to keep the bulk of the network robust14. Fusion of mitochondria, on the other hand, leads to sharing of matrix proteins, solutes, mtDNA and the electrochemical gradient, and also seems to prevent progression to apoptosis9. How fission and fusion of mitochondria affects cell homeostasis and ultimately the functioning of the organism needs further understanding, and therefore the continuous development and optimization of how to gather information on these phenomena is necessary.
Existing mitochondrial fusion assays have revealed various insights into mitochondrial physiology, each having its own advantages. The hybrid PEG fusion assay7, mixes two populations of differently labeled cells (mtRFP and mtYFP), and analyzes the amount of mixing and colocalization of fluorophores in fused, multinucleated, cells. Although this method has yielded valuable information, not all cell types can fuse, and the conditions under which fusion is stimulated involves the use of toxic drugs that likely affect the normal fusion process. More recently, a cell free technique has been devised, using isolated mitochondria to observe fusion events based on a luciferase assay1,5. Two human cell lines are targeted with either the amino or a carboxy terminal part of Renilla luciferase along with a leucine zipper to ensure dimerization upon mixing. Mitochondria are isolated from each cell line, and fused. The fusion reaction can occur without the cytosol under physiological conditions in the presence of energy, appropriate temperature and inner mitochondrial membrane potential. Interestingly, the cytosol was found to modulate the extent of fusion, demonstrating that cell signaling regulates the fusion process 4,5. This assay will be very useful for high throughput screening to identify components of the fusion machinery and also pharmacological compounds that may affect mitochondrial dynamics. However, more detailed whole cell mitochondrial assays will be needed to complement this in vitro assay to observe these events within a cellular environment.
A technique for monitoring whole-cell mitochondrial dynamics has been in use for some time and is based on a mitochondrially-targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP)6,11. Upon expression of the mtPAGFP, a small portion of the mitochondrial network is photoactivated (10-20%), and the spread of the signal to the rest of the mitochondrial network is recorded every 15 minutes for 1 hour using time lapse confocal imaging. Each fusion event leads to a dilution of signal intensity, enabling quantification of the fusion rate. Although fusion and fission are continuously occurring in cells, this technique only monitors fusion as fission does not lead to a dilution of the PAGFP signal6. Co-labeling with low levels of TMRE (7-15 nM in INS1 cells) allows quantification of the membrane potential of mitochondria. When mitochondria are hyperpolarized they uptake more TMRE, and when they depolarize they lose the TMRE dye. Mitochondria that depolarize no longer have a sufficient membrane potential and tend not to fuse as efficiently if at all. Therefore, active fusing mitochondria can be tracked with these low levels of TMRE9,15. Accumulation of depolarized mitochondria that lack a TMRE signal may be a sign of phototoxicity or cell death. Higher concentrations of TMRE render mitochondria very sensitive to laser light, and therefore great care must be taken to avoid overlabeling with TMRE. If the effect of depolarization of mitochondria is the topic of interest, a technique using slightly higher levels of TMRE and more intense laser light can be used to depolarize mitochondria in a controlled fashion (Mitra and Lippincott-Schwartz, 2010). To ensure that toxicity due to TMRE is not an issue, we suggest exposing loaded cells (3-15 nM TMRE) to the imaging parameters that will be used in the assay (perhaps 7 stacks of 6 optical sections in a row), and assessing cell health after 2 hours. If the mitochondria appear too fragmented and cells are dying, other mitochondrial markers, such as dsRED or Mitotracker red could be used instead of TMRE.
The mtPAGFP method has revealed details about mitochondrial network behavior that could not be visualized using other methods. For example, we now know that mitochondrial fusion can be full or transient, where matrix content can mix without changing the overall network morphology. Additionally, we know that the probability of fusion is independent of contact duration and organelle dimension, is influenced by organelle motility, membrane potential and history of previous fusion activity8,15,16,17.
In this manuscript, we describe a methodology for scaling up the previously published protocol using mtPAGFP and 15nM TMRE8 in order to examine multiple cells at a time and improve the time efficiency of data collection without sacrificing the subcellular resolution. This has been made possible by the use of an automated microscope stage, and programmable image acquisition software. Zen software from Zeiss allows the user to mark and track several designated cells expressing mtPAGFP. Each of these cells can be photoactivated in a particular region of interest, and stacks of confocal slices can be monitored for mtPAGFP signal as well as TMRE at specified intervals. Other confocal systems could be used to perform this protocol provided there is an automated stage that is programmable, an incubator with CO2, and a means by which to photoactivate the PAGFP; either a multiphoton laser, or a 405 nm diode laser.

Mitochondrial fusion was measured by tracking the equilibration of photoconverted matrix-targeted GFP across the mitochondrial network over time. Thus far, only one cell could be subjected to an hour long kinetic analysis at a time. We present a method that simultaneously measures multiple cells, thereby speeding up the data collection process.

並列共焦点顕微鏡を使用して複数のセルの動力学的データの取得の高速化、高解像度、MTPA-GFPベースのミトコンドリア融合アッセイ

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in ...

生物学

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

プラントの脈管構造の三次元構造と機能を可視化するために、高分解能CTを用いた

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

高解像度全マウント<em&gt;その場で</em遺伝子発現と機能を研究するためにゼブラフィッシュ胚内&gt;ハイブリダイゼーション

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

リビングヒト臍帯静脈内皮細胞における高解像度タイムラプスイメージングと微小管ダイナミクスの自動解析

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

ギャップ結合細胞間コミュニケーション：毒物および毒素の有害効果を評価するための機能バイオマーカー、および天然物の健康上の利点

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

透過処理と無傷の細胞でミトコンドリア機能を評価するために高解像度呼吸計測

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

高解像度の呼吸計測測定のための差動遠心分離することにより骨格筋から無傷ミトコンドリアの単離

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many doses, allow sensitive measurement of drug interactions. However, these assays are costly and do not scale well for measuring interaction among many drugs. Several recent studies have reported drug interaction measurements using a diagonal sampling of the traditional checkerboard assay. This alternative methodology greatly decreases the cost of drug interaction experiments and allows interaction measurement for combinations with many drugs. Here, we describe a protocol to measure the three pairwise interactions and one three-way interaction among three antibiotics in duplicate, in five days, using only three 96-well microplates and standard laboratory equipment. We present representative results showing that the three-antibiotic combination of Levofloxacin + Nalidixic Acid + Penicillin G is synergistic. Our protocol scales up to measure interactions among many drugs and in other biological contexts, allowing for efficient screens for multi-drug synergies against pathogens and tumors.

In this protocol, we describe how to make Loewe additivity-based drug interaction measurements for pairwise and three-way drug combinations.

任意の数の薬のメジャーの相乗効果に対角線論法

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

ゼブラフィッシュ ランゲルハンス島における単一セルの解像度カルシウム イメージングを用いた β-細胞機能の解析

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers

High-resolution respirometry (HRR) allows monitoring oxidative phosphorylation in real-time for analysis of individual cellular energy states and assessment of respiratory complexes using diversified substrate-uncoupler-inhibitor titration (SUIT) protocols. Here, the usage of two high-resolution respirometry devices is demonstrated, and a basic collection of protocols applicable for the analysis of cultured cells, skeletal and heart muscle fibers, and soft tissues such as the brain and liver are presented. Protocols for cultured cells and tissues are provided for a chamber-based respirometer and cultured cells for a microplate-based respirometer, both encompassing standard respiration protocols. For comparative purposes, CRISPR-engineered HEK293 cells deficient in mitochondrial translation causing multiple respiratory system deficiency are used with both devices to demonstrate cellular defects in respiration. Both respirometers allow for comprehensive measurement of cellular respiration with their respective technical merits and suitability dependent on the research question and model under study.

Assessing oxidative phosphorylation using high-resolution respirometers has become an integral part of the functional analysis of mitochondria and cellular energy metabolism. Here, we present protocols for the analysis of cellular energy metabolism using chamber and microplate-based high-resolution respirometers and discuss the key benefits of each device.