この作品は、国家自然科学基金、中国の (31201086、31470759、31671219) と上海自然科学財団 (12ZR1436900) からの補助金によって支えられました。

c57bl/6 マウス特定病原体フリーの条件で飼育しています。すべての動物実験、動物実験、第二軍医大学の倫理委員会で承認されたガイドラインに準拠しています。
 1。 郭清の生後開発下垂 <ol><li>実行麻酔: 低体温症を誘導するために砕いた氷を新生児マウス (P0 - P5) を配置。マウスの年齢の 5 日間以上、麻酔を誘導するために 5% ウレタン (体重の 30 μ L/g) を腹腔内注入します。テール/足指つまみレスポンスを評価します。マウスが有害な刺激への応答後にのみ続行します</li>。
	<li>そっと前足をテーピングで (上向きの顔、背中に横たわって) 仰臥位でマウスをセキュリティで保護し、あることが作業面にグルタミ固定化学発煙のフードの中に (すなわち、発泡スチロール).</li>
	<li>Transcardial 潅流を行う。
	<ol><li>マウス胸部を中心 (やその他の胸部臓器) を公開する手術ハサミで切っています</li>。
		<li>は鈍い鉗子との心臓の鼓動をセキュリティで保護、26 G (0.45 mm) 針を左心室に挿入します。針が満ちているヘパリン リン酸緩衝生理食塩水 10 mL のシリンジに接続されている (PBS; 亜硝酸ナトリウム 5 mg/mL と 10 U/mL のヘパリンを添加した、pH 7.4 では、使用する前に 37 ° C に暖かい)。すぐに高級ハサミで右房をカットし、右心房を出る流体がクリアされるまで、温かみのある PBS で体を灌流を開始 。
		注: おおよそ 5-10 mL の PBS を新生児マウスに必要な大人のマウスの 10-20 mL PBS</li>。
		<li>の場所で針し 4% パラホルムアルデヒド (PFA; pH 7.4) で満たされた別の注射器に変更します。10 mL と 20 mL の定着剤を灌流新生児と P21 マウスそれぞれ 。
		注意: PFA は有毒です。それは、皮膚と呼吸器の炎症、目の損傷を引き起こすかもしれません。手袋を着用し、化学のフードの下で動作します</li>。
	</ol></li> <li>PFA 固定マウスの首をはねるし、頭蓋骨骨ハサミで切り開いて。
	<ol><li>は、小さな鉗子で頭蓋底から後脳を慎重に持ち上げます。トルコ鞍の最初の兆候で停止解除しますが、保持する菱脳、下垂体茎と高級ハサミで脳の基部に接続する神経線維に切る。下垂体は脳と離れて解除されていないことを確認重要なこの手順です</li>。
		<li>は、脳を持ち上げておいてし、下垂体腺を完全に公開する脳全体を削除します。横の三叉神経下垂体など全体セッラ地域をカットとハサミ (約 3 × 5 mm 2) で蝶形骨下</li>。
	</ol></li> <li>35 mm ディッシュや冷たい 4 %2 mL を含む 6 ウェル プレートの 1 つの井戸に切り裂かれたティッシュを入れて PFA (pH 7.4)。P0 - 脳下垂体 P7、P14 脳下垂体、P21 - P28 脳下垂体および大人の脳下垂体の 3 h の 1.5 h の 1 h の 40 分のための 4 ° C で組織を修正します</li>。
	<li>下垂体のさらに解離 <ol><li>洗浄 10 ml の PBS、固定ティッシュ 5 変更、各 15 分。その周囲の組織とともに新生児の下垂と蝶形骨の下には、脱水症状に直接処理できます。5 日間よりも古いマウスから下垂体腺を分離する必要がありますただし、実体顕微鏡下で更なる</li>。
		<li>は、1 mL の PBS を含む 35 mm ディッシュに固定組織を置きます。P5 の-P14 脳下垂体の微細鉗子、はさみ、骨と神経の結合膜を削除し、慎重に鞍を残して、全体として一緒に横方向の三叉神経下垂を分離します。結合膜による分離腺と神経が接続されている、&#34; H &#34;-外観 ( 図 1 b) を希望します</li>。
		<li>の P21 および大人脳下垂体神経および下垂体周囲の結合膜を削除し、周囲の組織から腺を無料します。レンズ クリーニング ティッシュ ペーパーと下垂体組織をラップし、埋め込みカセットに入れて 。
		注: 折り返しの小さな下垂体でレンズのティッシュ ペーパーを洗浄標本の潜在的な損失を防ぐため、パラフィン包埋手順で組織の整合性を維持するのに役立ちます。それは低温埋め込み手順で小瓶で処理される場合、下垂体をラップする必要がない可能性があります</li>。
	</ol></li></ol> 2。埋め込みと押しますパラフィン <ol><li>脱水 15 分 50%、65%、75%、95% のエタノール溶液でカセットを埋め込むことで標本。P21 と古い腺は、純粋なエタノール、P0 - の 3 分の 3 つの変更によって腺 P4、P5 の-P14 腺と各 5 分の 4 分を脱水後。キシレンと明確 3、P0 から各 3 分腺 P4、P5 の-P14 腺と各 5 分の 4 分の変更 P21 および古い腺。P0 - P4 腺の溶融パラフィン ワックス、3 変更、7 分に潜入し、8 分 2 回続いて 6 分一度 P5 の古い腺 。
	注: ティッシュの処理のパラメーターを最適経験的調整できます。高品質のセクションを得るためには、十分以上の脱水は避けてください。同じはキシレンを使用して組織をクリアするためです</li>。
	コンソール システムを埋め込み組織に 埋め込み時の向き <ol><li><li>カセットから取り外し、溶融パラフィン ワックスで半分いっぱい基本金型に入れます。埋め込みの下垂体の適切な向きはコロナ セクションを満たすため不可欠です</li>。
		<li>の P21 および成人下垂体腺は、その短い軸基本型 (断面) の底面に垂直に下垂を配置します。蝶形骨と三叉神経解剖学的ランドマークとして P0 - P4 と P5 の-P14 脳下垂体をそれぞれ使用します。三叉神経または基本型の底面に垂直な蝶形骨の横の板片を方向づける</li>。
		ワックスが冷却板に半固体になるまで、<li>では目的の位置に温めた微細鉗子で優しくティッシュを保持します。溶融パラフィン ワックス金型をトップします。ワックスが完全に固化するまでを冷却するためパラフィン ブロックを許可します 。
		注: 18.5 日下垂体 (E18.5) は新生児下垂体と同じ方法で扱うことができます。脳下垂体 (ラトケ &#39; s ポーチ) 未満の E16.5 を頭全体が埋め込まれ、基本型の底面に垂直な (後頭部の口) から矢状軸に指向する必要があります</li>。
	</ol></li> <li>10 〜 20 分のための-20 ° C でパラフィン ブロックを寒さし、切ってミクロトームに薄膜 (4 μ m の厚みが望ましい) のスライス。満足のいくコロナ セクションを取得するには、断面中にパラフィン ブロックの位置を微調整します。次の手順でスライスの抜け防止のためポリリジン コート ガラス スライド上に組織スライスをマウントします 。
	注: また、標本 15% で脱水されることができます 30% (W/V) ショ糖液 (PBS) で同じ向き法を用いた低温埋め込み化合物に埋め込まれ、すぐにドライアイスで凍結、底に沈むまで 4 ° c。クライオスタットを用いた 8-10 μ m のスライスに凍結するティッシュのブロックをカットします。ただし、低温部には、形態はパラフィン セクションに劣る頻繁</li>。
</ol> 3。H &#38; E 染色と蛍光ラベリング <ol><li>暖かい熱スライド 55 ° c ブロック、キシレン、2 つの変更、4 分は、各 dewax。95% エタノール二度と 75% エタノール 2 回、各 3 分サンプルを脱水します。シェーカー上で 5 分間蒸留水でスライドを洗うです</li>。
	<li>の H &#38; 染色、ミョウバン ヘマトキシリン溶液 6 分間のセクションを染色、スケルトンスナイパーの洗浄45 s と再度 2 分間流水ですすぎの 0.2% アンモニア水を 2 分間 ing 水道水を区別します。1 分と 2 分のエオシン染色順次脱水、消去、およびマウントの 95% エタノールでセクションを脱水します</li>。
	蛍光標識 <ol><li><li>は、メタノールを含む 3% H 2 O 2 と 0.01% ナン 3 内因性ペルオキシダーゼを不活化する室温で 20 分間のセクションを扱います。沸騰 2 分加温の圧力鍋で検索バッファー (1 mM EDTA と 1 mM トリス-HCl、pH 7.4) のセクション 37 で 30 分のブロック バッファー (PBS で 5% ヤギ血清) のセクションによって抗原を取得 ° C</li>
		<li>4 で一晩ブロック バッファーで希釈したウサギ抗成長ホルモン (GH) 抗体 (1:2, 000) またはウサギ抗グリア線維性酸性蛋白 (GFAP) 抗体 (1:2, 000) セクションをインキュベート ° C</li>
		<li>37 で 35 分間インキュベート二次抗体 (ヤギ抗うさぎ IgG HRP、ブロック バッファーに 1: 300) とセクション ° C</li>
		<li>、室温で 15 分間ビオチニル パスチラミドシグナル (1:50 0.3% H 2 O 2 を含むトリス緩衝生理食塩水) を使用して信号を増幅してストレプトアビジン Alexa594 または 488 (37 ° C、30 分バッファーのブロックに 1: 300) を視覚化します</li>。
		<li>Counterstain 室温で 5 分間の核を DAPI (PBS で 50 mg/L) と 。
		注: パスチラミドシグナル信号増幅 (TSA) システムを使用して信号を増幅する必要ない場合があります。信号を可視化する蛍光標識二次抗体を使用ことができますまたは、します</li>。
	</ol></li> <li>蛍光顕微鏡を用いて取得画像搭載 DAPI、テキサス赤と FITC フィルター セット × 4/0.13 × 40/0.75 目標と 5.0 メガピクセルのカメラ。それぞれ、イメージング DAPI、アレクサ 488-Alexa 594 ステンドのセクションに、360、488、および 594 nm のレーザー光の波長を使用しています。レーザー パワーを最適化 (一般に 0.8 を使用) と各チャンネルの所望のレベルに露光時間。画像集録ソフトウェアの制御の下でイメージをキャプチャし、その後画像処理ソフトウェアを用いた蛍光画像をオーバーレイします</li>。
</ol>

<ol>
	<li>Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+face+of+the+anterior+pituitary.">Hidden face of the anterior pituitary.</a> Trends Endocrinol Metab. 13 (7), 304-309 (2002).</li><li>Haedo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pituitary+function+by+cytokines.">Regulation of pituitary function by cytokines.</a> Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).</li><li>Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+physiology+of+pituitary+development:+signaling+and+transcriptional+networks.">Molecular physiology of pituitary development: signaling and transcriptional networks.</a> Physiol Rev. 87 (3), 933-963 (2007).</li><li>Bancalari, R. E., Gregory, L. C., McCabe, M. J., Dattani, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+gland+development:+an+update.">Pituitary gland development: an update.</a> Endocr Dev. 23, 1-15 (2012).</li><li>Kelberman, D., Rizzoti, K., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C., Dattani, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+pituitary+gland+development+in+human+and+mouse.">Genetic regulation of pituitary gland development in human and mouse.</a> Endocr Rev. 30 (7), 790-829 (2009).</li><li>Peker, S., Kurtkaya-Yapicier, O., Kilic, T., Pamir, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsurgical+anatomy+of+the+lateral+walls+of+the+pituitary+fossa.">Microsurgical anatomy of the lateral walls of the pituitary fossa.</a> Acta Neurochir (Wien). 147 (6), 641-648 (2005).</li><li>Wolpert, S. M., Molitch, M. E., Goldman, J. A., Wood, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size,+shape,+and+appearance+of+the+normal+female+pituitary+gland.">Size, shape, and appearance of the normal female pituitary gland.</a> AJR Am J Roentgenol. 143 (2), 377-381 (1984).</li><li>Carbajo-Perez, E., Watanabe, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+proliferation+in+the+anterior+pituitary+of+the+rat+during+the+postnatal+period.">Cellular proliferation in the anterior pituitary of the rat during the postnatal period.</a> Cell Tissue Res. 261 (2), 333-338 (1990).</li><li>Nantie, L. B., Himes, A. D., Getz, D. R., Raetzman, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+postnatal+pituitary+expansion:+proliferation,+progenitors,+and+cell+specification.">Notch signaling in postnatal pituitary expansion: proliferation, progenitors, and cell specification.</a> Mol Endocrinol. 28 (5), 731-744 (2014).</li><li>Tzou, S. C., Landek-Salgado, M. A., Kimura, H., Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mouse+pituitary+immunogen+for+the+induction+of+experimental+autoimmune+hypophysitis.">Preparation of mouse pituitary immunogen for the induction of experimental autoimmune hypophysitis.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li><li>Budry, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Related+pituitary+cell+lineages+develop+into+interdigitated+3D+cell+networks.">Related pituitary cell lineages develop into interdigitated 3D cell networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12515-12520 (2011).</li><li>Wilson, D. B., Wyatt, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathology+of+the+pituitary+gland+in+neonatal+little+(lit)+mutant+mice.">Histopathology of the pituitary gland in neonatal little (lit) mutant mice.</a> Histol Histopathol. 7 (3), 451-455 (1992).</li><li>Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardial+perfusion+fixation+of+the+CNS+by+means+of+a+compressed-air-driven+device.">Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device.</a> J Neurosci Methods. 12 (2), 141-149 (1984).</li><li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZBTB20+is+required+for+anterior+pituitary+development+and+lactotrope+specification.">ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification.</a> Nat Commun. 7, 11121 (2016).</li></ol>

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ネズミの脳下垂体を開発するための小さくて壊れやすい機能と解剖学的特徴6,8により適切なコロナ セクションを得ることが技術的に困難だった。いくつかの研究グループは従って萌芽期・新生児下垂体11,12の形態を分析する半ば矢状のセクションを選んだ。下垂体の半ば矢状断面が前方、中間を示すことができるでも、単一のスライスで後頭葉は、これらの 3 つの葉の最大ビューを表示することができます、冠状断面が非常に好ましい。特に、下垂体とアポトーシスの数を数えると、細胞の増殖の面積と体積の測定などの定量化研究のコロナ セクションは彼らの代表面で半ば矢状セクションに優れています。下垂体腺の解剖し、マウスを開発から下垂体のコロナ セクションの準備に役立つ方法を紹介します。
処理中に下垂体腺を損傷しないように、いくつかのテクニックは、このプロトコルで使用されています。まず、マウス解剖前にホルムアルデヒドの transcardial 灌流を固定です。この固定だけでなく臓器の構造を維持するだけでなく、自動蛍光13になりがちな赤い血液細胞を削除することができます。第二に、全体セッラ地域は下垂体手術難しいツールに触れることを避けるために解剖しました。元の位置で下垂体を維持し、向きを埋め込むための目印にもなって周囲の組織を助けます。これらの方法を採用、若い動物から小さい生後脳下垂体郭清が可能ながら、望ましくない損傷の確率を減らすこと。
このプロトコルでは、術も血流によって事前に固定されていないマウスの下垂体を分離する可能です。その場合、不要な損傷を避けるために多くの注意をすべきである、腺はできるだけ早くも解剖する必要があります。
開発マウス脳下垂体はサイズが非常に小さいので、埋め込む際、正しくそれらを回転するのには非常に困難だった。このプロトコルは、オリエンテーション手順をより簡単に作り、目印として三叉神経や蝶形骨を使用します。適切な方向の脳下垂体はコロナ セクションの満足を達成するために不可欠です。
要約すると、改良された下垂体解離とさまざまな開発段階でマウスに適しているプロトコルを埋め込むを提供します。発達障害研究14の in situハイブリダイゼーション、免疫組織化学的日常的組織の分析に使用するマウス下垂体腺のコロナ セクションを満たすこれらのプロシージャのアプリケーションを取得できます。

下垂体または下垂体が恒常性1,2のために不可欠なホルモンを分泌する重要な内分泌器官です。解剖学的, 下垂体腺、後葉と下垂から成る「2 台」構造です。これらの部品がある異なる胚起源と機能非常に異なる。後葉は神経外胚葉由来、オキシトシンと抗利尿ホルモンを分泌します。下垂ラトケ嚢に由来、成長ホルモン、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、副腎皮質刺激ホルモンを含むホルモンのリリースを担当し、メラニン細胞刺激ホルモンの3,の4,5。
下垂体腺は、マウス頭蓋骨の蝶形骨 (鞍) の背側表面にかかっている、壊れやすい茎によって脳の床にアタッチされます。三叉神経と前方視交叉6、7それは横方向に囲まれています。腺は細長い楕円形で、その軸に垂直に頭を。背側表面の後葉と下垂することができます簡単に区切られ、背側内側領域と腹の横と、後者の拡張を占める前者で。生後発達期下垂体のサイズが誕生8,9後最初の月に急速に増加します。それにもかかわらず、マウス下垂体は、まだ 1.9 mg の平均重量と 〜 3 mm の長軸径サイズで非常に小さい大人10, 生後 21 (P21) で 2 〜 2.5 mm と P0 でわずか 1 〜 1.5 mm の長軸径。
マウス下垂体の単一のスライスで下垂前葉と後葉の両方を表示する冠状断面お勧めします。ただし、いくつかの技術的なスキルは、非常に小さなサイズと異なる解剖学マウスを開発から下垂体腺のコロナ セクションを満たすを取得する必要があります。このビデオの記事でマウス下垂体腺を分析し、さまざまな開発段階で下垂体のコロナ セクションを準備する方法を示します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tools/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors-straight</td>
			<td>JinZhong</td>
			<td>J21010</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors-strainght</td>
			<td>JinZhong</td>
			<td>WA1010</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt forceps</td>
			<td>JinZhong</td>
			<td>JD1020</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>RS-5015</td>
			<td>for isolation of the pituitary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G (0.45mm) needle</td>
			<td>HongDa</td>
			<td></td>
			<td>for transcardial perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>300841</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (10 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens cleaning paper</td>
			<td>ShuangQuan</td>
			<td></td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anatomical microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>SZX-ILLB2-200</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassette</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22-272423</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue embedding console system</td>
			<td>KEDEE</td>
			<td>KD-BM11</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HM315R</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost-Plus slides</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12-543</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>BH2-RFCA</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>BBI</td>
			<td>EB0448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4.12H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71650</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2222</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaNO2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>237213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Injection</td>
			<td>SPH</td>
			<td>H31022051</td>
			<td>for perfusion saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10023418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>8330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9627</td>
			<td>for H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4009</td>
			<td>for H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti growth hormone (GH)</td>
			<td>National Hormone</td>
			<td></td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibody</td>
			<td>Pituitary Program</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse GFAP antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9269</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, HRP</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA system</td>
			<td>NEN Life Science Products</td>
			<td>NEL700</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S32356</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FITC Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11090</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and coronal slice preparation of developing mouse pituitary gland

下垂体または下垂体は重要な内分泌臓器の恒常性に不可欠なホルモンを分泌します。別の胚起源と機能と 2 つの腺で構成されています — 後葉と下垂。小型で細長い楕円形と繊細な開発マウス下垂体です。マウス下垂体の単一のスライスで下垂前葉と後葉の両方を表示する冠状断面お勧めします。
このプロトコルの目的は、マウスを開発してからの手入れが行き届いた組織アーキテクチャで適切な下垂体のコロナ セクションを達成することです。このプロトコルでは解剖およびマウスを開発から正常下垂体腺を処理する方法詳細に述べる。まず、マウス解剖前にホルムアルデヒドの transcardial 灌流を固定です。3 つの異なる解剖技術はマウスの年齢に応じてそのまま下垂体腺を取得に適用されます。胎児マウス高齢者胚日 (E) 17.5 18.5 と新生児を 4 日間に、蝶形骨、腺、および三叉神経を含む全体のセッラ地域は解剖します。子犬の高齢生後 (P) 5-14、下垂体腺、三叉神経接続は全体として解剖しました。以上 3 週齢のマウスに、下垂体腺は周囲の組織から無料解剖慎重に。コロナ セクションを満たすを取得するランドマークとして周囲の組織を使用して、適切な方向に下垂体腺を埋め込む方法も表示されます。これらのメソッドは、マウスの開発に下垂体腺の組織学的・発達的特徴を分析に役立ちます。

このプロトコルはマウスを開発から下垂体腺を分析する手法を示す.新生児マウス下垂体, 三叉神経と下を含む全体のセッラ地域の蝶形骨は頭蓋底からうち解剖されました。小型で繊細な下垂体腺はプロセス (図 1 a) の中にそのまま残った。5 日間以上のマウスの横の三叉神経に接続されている下垂体腺は当時孤立しました。マウスがよく保持されていた P7 から分離した下垂体腺 (図 1 b) の総構造。P21 マウス新生仔マウスのそれと比較すると顕著下垂体腺のサイズを増加しました。下垂体腺は周囲組織 (図 1) を削除中目に見えない破損と正常に分離されました。
下垂体の単一のスライスで下垂前葉と後葉の最大の領域を表示するには、冠状断面お勧めします。切り裂かれた下垂体腺はコロナ セクションの満足を達成するために正しく方向づけられました。H &#38; よく示した染色電子保存形態下垂体の後葉 P0、P7、および P21 下垂体腺 (図 2) で。
加工スライスも蛍光ラベリングと互換性があった。たとえば、下垂と下垂体の GH と GFAP、特定の反応を示した (図 3)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56356/56356fig1.jpg"> 
図 1: 生後開発下垂体腺の解剖します。切り裂かれた下垂体腺と P0, P7, と P21 のマウスから周囲の組織の背景色。A, 前面;P、後部;L、左;R、右;SB、蝶形骨;テネシー州、三叉神経;ああ、下垂体;NH、下垂体。スケール バー、1 mm.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56356/56356fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56356/56356fig2.jpg"> 
図 2: マウス下垂体腺の組織像。代表 H &#38; P21、P7、P0 のマウスから下垂体のコロナ セクションで染色します。(A B、およびC)、コロナ脳下垂体の低倍率ビュー。(D E、およびF) は、それぞれ (A B、およびC) の組み立てられた区域の拡大です。スケール バー = 1 mm (A、B、および C)。 (D、E、および F) 20 μ m。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56356/56356fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56356/56356fig3.jpg"> 
図 3: 下垂体腺の代表的な免疫蛍光染色します。(A) GH (赤) だった P7 マウスから下垂体特異的に発現します。(B) (C) A. GFAP (緑) で囲まれた範囲の拡大鏡イメージだった P21 マウス下垂体特異的に発現します。(D) C. 核で囲まれた範囲の拡大鏡イメージが DAPI (青) に染まっていた。スケールバー = 300 μ m (A、C);・ 30 μ m (B、D)。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56356/56356fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

郭清とコロナのスライス標本マウス下垂体腺の開発

下垂体腺の解剖し、マウスを開発から下垂体のコロナ セクションを準備するためのプロトコルを提案します。

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

dissection-coronal-slice-preparation-developing-mouse-pituitary

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

17.1K ビュー.  Second Military Medical University. 下垂体腺の解剖し、マウスを開発から下垂体のコロナ セクションを準備するためのプロトコルを提案します。

ビデオ: Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

子宮外エレクトロポレーションおよびマウスの海馬組織の器官型スライス培養

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

発生生物学

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

リンパ腺や血球中を調べるための方法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

共焦点イメージングは​​、シロイヌナズナの花の開発のライブ

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex determination system, where several genes distributed throughout the genome collectively determine the sex identities of individual fish. Currently, the genes involved in regulating gonad development and how they work remain elusive. Normally, isolating gonadal tissue is the first step to examine the sex developmental processes. Here, we present a procedure to isolate gonadal tissue from 17 dpf (days post fertilization) and 25 dpf zebrafish larvae. The isolated gonadal tissue may be subsequently examined by morphology and gene expression profiling.

Here, we present a protocol for isolating gonadal tissue of larval zebrafish, which will facilitate investigations of zebrafish sex differentiation and maintenance.

幼生ゼブラフィッシュ性腺組織の解剖

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

マウス胎児腎臓の解剖および培養

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

郭清およびショウジョウバエ蛹卵巣の汚損

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a variety of human retinal degenerative diseases and pinpoint new treatment approaches. The nuclear architecture of mouse retina is organized in two different patterns: conventional and inverted. Conventional pattern is universal where heterochromatin is localized to the periphery of the nucleus, while active euchromatin resides in the nuclear interior. In contrast, inverted nuclear pattern is unique to the adult rod photoreceptor cell nuclei where heterochromatin localizes to the nuclear center, and euchromatin resides in the nuclear periphery. DNA methylation is predominantly observed in chromocenters. DNA methylation is a dynamic covalent modification on the cytosine residues (5-methylcytosine, 5mC) of CpG dinucleotides that are enriched in the promoter regions of many genes. Three DNA methyltransferases (DNMT1, DNMT3A and DNMT3B) participate in methylation of DNA during development. Detecting 5mC with immunohistochemical techniques is very challenging, contributing to variability in results, as all DNA bases including 5mC modified bases are hidden within the double-stranded DNA helix. However, detailed delineation of 5mC distribution during development is very informative. Here, we describe a reproducible technique for robust immunohistochemical detection of 5mC and another epigenetic DNA marker 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), which colocalizes with the &#34;open&#34;, transcriptionally active chromatin in developing and postmitotic mouse retina.

The objective of this report is to describe the protocol for robust immunohistochemical detection of epigenetic markers, 5-methylcytosine (5mC) and 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) in developing and postmitotic mouse retina.

5-メチルシトシンと開発の 5-ヒドロキシメチルシトシンの免疫組織化学的検出と後マウス網膜

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ultrastructural parameters in unambiguously identified topographical structures, affected by a protein of interest that is introduced into the organism via viral transfer. This combined approach allows for a smooth transition from macrostructural to ultrastructural identification by following topographical navigation maps in a tissue atlas. High-resolution electron microscopy of the in-utero-transduced tissue reveals the fine ultrastructure of the neuropil and its plasticity parameters, such as cross-sectioned synaptic bouton areas, the number of synaptic vesicles and mitochondria within a bouton profile, the length of synaptic contacts, cross-sectioned axonal areas, the thickness of myelin sheaths, the number of myelin lamellae, and cross-sectioned areas of mitochondria profiles. The analysis of these parameters reveals essential insights into changes of ultrastructural plasticity in the areas of the nervous system that are affected by the viral transfer of the genetic construct. This combined method can not only be used for studying the direct effect of genetically engineered biomolecules and/or drugs on neuronal plasticity but also opens the possibility to study the in utero rescue of neuronal plasticity (e.g., in the context of neurodegenerative diseases).

The combination of transmission electron microscopy and in utero transduction is a powerful approach for studying morphological changes in the fine ultrastructure of the nervous system during development. This combined method allows deep insights into changes in structural details underlying neuroplasticity with respect to their topographical representation.

子宮内開発のマウスの脳および脊髄の伝達の後の微細構造神経可塑性パラメーターの評価

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and simple protocol to detect protein expression during craniofacial morphogenesis/pathogenesis using mouse craniofacial tissues as examples. The protocol consists of preparation and cryosectioning of tissues, indirect immunofluorescence, image acquisition, and quantification. In addition, a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues for immunostaining is described, using craniofacial tissues and long bones as examples. Those methods are key to determine the protein expression and morphological/anatomical changes in various tissues during craniofacial morphogenesis/pathogenesis. They are also applicable to other tissues with appropriate modifications. Knowledge of the histology and high quality of sections are critical to draw scientific conclusions from experimental outcomes. Potential limitations of this methodology include but are not limited to specificity of antibodies and difficulties of quantification, which are also discussed here.

Here, we present a detailed protocol to detect and quantify protein levels during craniofacial morphogenesis/pathogenesis by immunostaining using mouse craniofacial tissues as examples. In addition, we describe a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues from young mice for immunostaining.

マウス頭蓋組織および非除電骨の組織調製と免疫染色

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ability to study cell movements and differentiation in vivo is still very difficult. Neurocristopathies, or disorders of the neural crest lineage, are particularly challenging to study due to a lack of accessibility of key embryonic stages and the difficulties in separating out the neural crest mesenchyme from adjacent mesodermal mesenchyme. Here, we set out to establish a well-defined, routine protocol for the culture of primary cranial neural crest cells. In our approach we dissect out the mouse neural plate border during the initial neural crest induction stage. The neural plate border region is explanted and cultured. The neural crest cells form in an epithelial sheet surrounding the neural plate border, and by 24 h after explant, begin to delaminate, undergoing an epithelial-mesenchymal transition (EMT) to become fully motile neural crest cells. Due to our two-dimensional culturing approach, the distinct tissue populations (neural plate versus premigratory and migratory neural crest) can be readily distinguished. Using live imaging approaches, we can then identify changes in neural crest induction, EMT and migratory behaviors. The combination of this technique with genetic mutants will be a very powerful approach for understanding normal and pathological neural crest cell biology.

This protocol describes the dissection and culture of cranial neural crest cells from mouse models, primarily for the study of cell migration. We describe the live imaging techniques used and the analysis of speed and cell shape changes.

神経クレスト細胞の形成と移動の研究のためのマウスからの原発性頭蓋神経クレスト細胞の解剖、培養および分析

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...