وأيد هذا العمل المنح "الوطنية الطبيعية مؤسسة العلوم الصينية" (31201086 و 31470759 و 31671219) و "شنغهاي مؤسسة العلوم الطبيعية" (12ZR1436900).

هي ولدت الفئران C57BL/6 في ظروف معينة خالية من مسببات الأمراض. جميع الأساليب التجريبية الحيوانية امتثالا للمبادئ التوجيهية التي أقرتها لجنة الأخلاقيات في الجامعة الطبية العسكرية الثانية ورعاية الحيوان.
 1-"تسلخ من بعد الولادة تطوير الغدة النخامية" <ol><li>إجراء التخدير: مكان الفئران حديثي الولادة (P0-P5) على الثلج المجروش للحث على انخفاض درجة حرارة الجسم. للفئران التي مضى عليها أكثر من 5 أيام عمر، حقن يوريتان 5% (30 ميليلتر/غرام من وزن الجسم) إينترابيريتونيلي للحث على التخدير. تقييم الاستجابات للذيل/تو يقرصه. المضي قدما إلا بعد أن يكون الماوس لا يستجيب للمنبهات الضارة.</li>
	<li>تأمين الماوس في موقف ضعيف (ملقى على ظهره والوجه إلى الأعلى) بتسجيل بلطف فوريباوس وهيندباوس إلى سطح عمل يمكن أن تكون مثبتة (أي، الستايروفوم) داخل غطاء الأبخرة كيميائية.</li>
	<li>إجراء نضح ترانسكارديال.
	<ol><li>قص القفص الصدري الماوس مع المقص الجراحي لفضح القلب (والأجهزة الأخرى والصدر)-</li>
		<li>تأمين قلب ينبض بالملقط حادة وأدخل إبرة ز 26 (0.45 ملم) في البطين الأيسر. يتم إرفاقه الإبرة حقنه 10 مل مليئة بالفوسفات هيبارينيزيد مخزنة المالحة (برنامج تلفزيوني؛ تستكمل مع نتريت الصوديوم 5 ملغ/مل و 10 يو/مليلتر الهيبارين، درجة الحموضة 7.4، الحارة إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام). قطع الاذين الأيمن مع مقص غرامة فورا والبدء في نتخلل الجسم مع برنامج تلفزيوني الحارة حتى السوائل تخرج اتريوم الصحيح الواضح. 
		ملاحظة: التقريبية 5-10 مل برنامج تلفزيوني المسبق للفئران حديثي الولادة و 10-20 مل برنامج تلفزيوني للفئران الكبار-</li>
		<li>تبقى الإبرة في المكان وتغيير آخر حقنه مليئة بارافورمالدهيد 4% (منهاج عمل بيجين؛ ودرجة الحموضة 7.4). نتخلل 10 مل و 20 مل من مثبت للأطفال حديثي الولادة والماوس P21، على التوالي. 
		تنبيه: منهاج عمل بيجين السامة. قد يسبب التهابات الجهاز التنفسي، الجلد وتلف العين. ارتداء القفازات وتعمل تحت غطاء كيميائية.</li>
	</ol></li> <li>قطع رأس الماوس ثابتة في منهاج عمل بيجين وقطع عظم الجمجمة مفتوحة مع المقص.
	<ol><li>مع الملقط الصغيرة بلطف رفع هيندبرين من قاعدة الجمجمة. في أول بادرة من السرج، قص رفع الإيقاف ولكن عقد هيندبرين، ساق الغدة النخامية والألياف العصبية الاتصال بقاعدة الدماغ مع مقص غرامة. تعد هذه الخطوة الحاسمة لضمان أن الغدة النخامية لا يرفع بعيداً مع الدماغ.</li>
		<li>ثم الحفاظ على رفع الدماغ وإزالة الدماغ كله لفضح الغدة النخامية تماما. قص سيلا كامل المنطقة بما في ذلك الغدة النخامية، الأفقي تريجيمينال الأعصاب، وتحت عظم وتدي مع المقص (حوالي 3 × 5 مم 2)-</li>
	</ol></li> <li>موضع تشريح الأنسجة طبق 35 ملم أو بئر واحدة للوحة 6-البئر الذي يحتوي على 2 مل الباردة 4% منهاج العمل (درجة الحموضة 7.4). إصلاح الأنسجة عند 4 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة ل P0-بيتويتاريس P7، ح 1 عن بيتويتاريس P14، ح 1.5 ل P21-بيتويتاريس P28، و 3 ح للكبار بيتويتاريس.</li>
	<li>تفارق مزيد من الغدة النخامية <ol><li>غسل الأنسجة الثابتة مع 10 مل برنامج تلفزيوني، 5 التغييرات، كل 15 دقيقة. الغدة النخامية الولدان جنبا إلى جنب مع الأنسجة المحيطة به، وتحت عظم وتدي يمكن معالجتها بصورة مباشرة للجفاف. ومع ذلك، ينبغي أن تنفصل الغدد النخامية من الفئران التي مضى عليها أكثر من 5 أيام أخرى تحت مجهر ستيريو.</li>
		<li>وضع الأنسجة الثابتة في طبق 35 ملم يحتوي على 1 مل برنامج تلفزيوني. P5-بيتويتاريس P14، إزالة الأغشية الضام بين الأعصاب والعظام مع غرامة ملقط ومقص، وعزل الغدة النخامية جنبا إلى جنب مع الأفقي trigeminal الأعصاب بعناية ككل ولكن ترك في السرج. غدة معزولة والأعصاب متصلة بواسطة الأغشية الضام مع &#34; ح &#34;-مثل مظهر ( الشكل 1B).</li>
		بيتويتاريس <li>ل P21، والكبار، إزالة الأعصاب وأغشية الضام حول الغدة النخامية والغدة من الأنسجة المحيطة بها. التفاف أنسجة الغدة النخامية مع عدسة تنظيف المناديل الورقية ووضعه في كاسيت تضمين. 
		ملاحظة: التفاف الغدة النخامية صغيرة مع عدسة تنظيف المناديل الورقية يساعد على منع أي خسارة محتملة للعينات، والمحافظة على سلامة الأنسجة في الإجراء التالي تضمين البارافين. فإنه قد لا يكون ضروريا التفاف الغدة النخامية إذا تتم معالجتها في زجاجة صغيرة في الإجراء تضمين cryo.</li>
	</ol></li></ol> 2. البارافين تضمينها وسيكتيونينج <ol><li>يذوي العينات في تضمين أشرطة الكاسيت مع حلول الإيثانول 50%، 65%، 75%، و 95% لمدة 15 دقيقة. في وقت لاحق يذوي مع التغييرات 3 من الإيثانول النقي، 3 دقيقة ل P0-P4 الغدد، 4 دقيقة ل P5-P14 الغدد، وكل 5 دقائق P21 والغدد كبار السن. واضحة مع زيلين نفط، 3 التغييرات، 3 دقيقة ل P0-P4 الغدد، 4 دقيقة ل P5-P14 الغدد، وكل 5 دقائق ل P21 والغدد كبار السن. التسلل مع شمع البارافين المنصهر، التغييرات 3، 7 دقيقة ل P0-الغدد P4، ودقيقة 8 مرتين تليها 6 دقيقة مرة P5 والغدد كبار السن- 
	ملاحظة: معلمات الأمثل لمعالجة الأنسجة يمكن تجريبيا تعديلها. للحصول على المقاطع ذات جودة عالية، وينبغي تجنب الجفاف غير كافية أو أكثر. نفس الشيء صحيح بالنسبة لإزالة الأنسجة استخدام زيلين نفط.</li>
	إزالة العينة من الكاسيت <li>التوجه عند تضمين <ol><li>في أنسجة تضمين وحدة تحكم النظام، ووضعها في قالب قاعدة نصف مليئة شمع البارافين المنصهر. التوجه السليم للغدة النخامية التضمين أمر ضروري لتلبية أقسام الاكليلية.</li>
		الغدد النخامية <li>ل P21، والكبار، ضع الغدة النخامية مع محورها قصيرة عمودي على السطح السفلي لقاعدة العفن (الطائرة القسم). استخدام وتدي العظام والأعصاب trigeminal كالمعالم التشريحية ل P0-P4 و P5-P14 بيتويتاريس، على التوالي. توجيه العينات بالاعصاب تريجيمينال أو الصفيحة مستعرضة من العظام الاسفينية عمودي على السطح السفلي لقاعدة العفن.</li>
		<li>برفق عقد الأنسجة في الموضع المطلوب مع الملقط غرامة المعالجون حتى يصبح الشمع شبه صلبة على لوحة تبريد. أعلى القالب مع شمع البارافين المنصهر. تسمح الكتلة البارافين لتبرد حتى تماما هو توطد الشمع. 
		ملاحظة: يمكن علاج الغدة النخامية في يوم الجنينية 18.5 (E18.5) بنفس الطريقة كالغدة النخامية الولدان. لكن بيتويتاريس (راثكي &#39; s الحقائب) أصغر من E16.5 ينبغي أن تكون جزءا لا يتجزأ مع الرأس كله والمنحى مع المحور السهمي (من الفم إلى قفا) عمودي على السطح السفلي لقاعدة العفن.</li>
	</ol></li> <li>البرد في كتلة البارافين في-20 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة وبعد ذلك قطع رقيقة إلى شرائح (4 ميكرون سمك المفضل) مع مبضع. للحصول على المقاطع الاكليلية مرضية، تهذيب موقف كتل البارافين خلال تمزيقها. جبل شرائح الأنسجة على الشرائح الزجاجية المغلفة بوليليسيني لمنع انفصال شرائح في الإجراءات التالية. 
	ملاحظة: بدلاً من ذلك، العينات يمكن أن تكون مجففة بنسبة 15%، 30% (W/V) حلول السكروز (في برنامج تلفزيوني) في 4 درجات مئوية حتى أنها تنزل إلى القاع، جزءا لا يتجزأ من مجمع cryo التضمين باستخدام نفس أسلوب التوجيه، وتجمد بسرعة على الجليد الجاف. ثم قص كتل الأنسجة المجمدة إلى شرائح من 8-10 ميكرون استخدام كريوستات. مورفولوجية cryo-الفروع، ومع ذلك، في كثير من الأحيان أقل شأنا من البارافين المقاطع.</li>
</ol> 3. ح &#38; ه تلطيخ ووسم الفلورة <ol><li>الحارة الشرائح على حرارة كتلة في 55 درجة مئوية ودو مع زيلين نفط، التغييرات 2، 4 دقيقة. يذوي العينات مع الإيثانول 95% مرتين و 75% إيثانول مرتين، 3 دقيقة. يغسل الشرائح مع الماء المقطر لمدة 5 دقائق على شاكر.</li>
	<li>"على ح" &#38; ه تلطيخ، وصمة عار المقاطع في الشب توضع حل لمدة 6 دقائق، وشطف في runnماء الصنبور جي ل 2 دقيقة، تفرق مع المياه الأمونيا 0.2% s 45، وإعادة شطف في الماء لمدة 2 دقيقة. ثم يذوي المقاطع مع الإيثانول 95% 1 دقيقة ووصمة عار مع ويوزين للحد الأدنى 2 من التتابع يذوي، واضحة، وجبل-</li>
	علاج <li>وسم الفلورة <ol><li>الأقسام مع الميثانول التي تحتوي على 3 ٪ ح 2 س 2 و 0.01 ٪ نان 3 لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإلغاء تنشيط بيروكسيداسيس الذاتية. استرداد المستضدات من الغليان المقاطع في استرجاع المخزن المؤقت (يدتا 1 مم و 1 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.4) في طنجرة الضغط للحد الأدنى 2 إينكوباتي المقاطع مع حظر المخزن المؤقت (5% الماعز المصل في برنامج تلفزيوني) لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.</li>
		<li>احتضان الأقسام مع جسم هرمون النمو المضادة (غ) الأرانب (1:2، 000) أو جسم مكافحة الدبقية فيبريلاري الحمضية البروتين (توصيني) أرنب (1:2، 000) المخفف في المخزن المؤقت لحظر بين عشية وضحاها في 4 ° C.</li>
		<li>احتضان الأقسام مع جسم الثانوي (الماعز الأرنب المضادة مفتش-برنامج الصحة الإنجابية، رافعة في المخزن المؤقت لحظر) لمدة 35 دقيقة في 37 درجة مئوية.</li>
		<li>تضخيم الإشارات باستخدام بيوتينيل تيراميدي (01:50 في تريس مخزنة المالحة التي تحتوي على نسبة 0.3% ح 2 س 2) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وتصور مع 488 (رافعة في حجب المخزن المؤقت, 30 دقيقة, 37 درجة مئوية) أو ستريبتافيدين-Alexa594-</li>
		<li>كونتيرستين الأنوية مع DAPI (50 مغ/لتر في برنامج تلفزيوني) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة- 
		ملاحظة: أنه لا يلزم لتضخيم الإشارات استخدام نظام التضخيم إشارة تيراميدي (TSA). بدلاً من ذلك، يمكن استخدام جسم ثانوي مترافق الأسفار تصور الإشارة-</li>
	</ol></li> <li>الحصول على الصور باستخدام مجهر الأسفار مجهزة × DAPI وتكساس الأحمر ومجموعات التصفية فيتك، 4/0.13 إلى × 40/0.75 الأهداف وكاميرا 5.0 ميجا بكسل. استخدام في 360 و 488 594 موجات الليزر في شمال البحر الأبيض المتوسط للتصوير DAPI، أليكسا 488-ومقاطع 594 أليكسا الملون، على التوالي. تحسين طاقة الليزر (0.8 استخدمت عموما) ووقت التعرض إلى المستويات المنشودة لكل قناة. التقاط الصورة تحت سيطرة صورة اقتناء البرمجيات وتراكب الصور الأسفار فيما بعد باستخدام برنامج معالجة الصور-</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+face+of+the+anterior+pituitary.">Hidden face of the anterior pituitary.</a> Trends Endocrinol Metab. 13 (7), 304-309 (2002).</li><li>Haedo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pituitary+function+by+cytokines.">Regulation of pituitary function by cytokines.</a> Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).</li><li>Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+physiology+of+pituitary+development:+signaling+and+transcriptional+networks.">Molecular physiology of pituitary development: signaling and transcriptional networks.</a> Physiol Rev. 87 (3), 933-963 (2007).</li><li>Bancalari, R. E., Gregory, L. C., McCabe, M. J., Dattani, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+gland+development:+an+update.">Pituitary gland development: an update.</a> Endocr Dev. 23, 1-15 (2012).</li><li>Kelberman, D., Rizzoti, K., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C., Dattani, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+pituitary+gland+development+in+human+and+mouse.">Genetic regulation of pituitary gland development in human and mouse.</a> Endocr Rev. 30 (7), 790-829 (2009).</li><li>Peker, S., Kurtkaya-Yapicier, O., Kilic, T., Pamir, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsurgical+anatomy+of+the+lateral+walls+of+the+pituitary+fossa.">Microsurgical anatomy of the lateral walls of the pituitary fossa.</a> Acta Neurochir (Wien). 147 (6), 641-648 (2005).</li><li>Wolpert, S. M., Molitch, M. E., Goldman, J. A., Wood, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size,+shape,+and+appearance+of+the+normal+female+pituitary+gland.">Size, shape, and appearance of the normal female pituitary gland.</a> AJR Am J Roentgenol. 143 (2), 377-381 (1984).</li><li>Carbajo-Perez, E., Watanabe, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+proliferation+in+the+anterior+pituitary+of+the+rat+during+the+postnatal+period.">Cellular proliferation in the anterior pituitary of the rat during the postnatal period.</a> Cell Tissue Res. 261 (2), 333-338 (1990).</li><li>Nantie, L. B., Himes, A. D., Getz, D. R., Raetzman, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+postnatal+pituitary+expansion:+proliferation,+progenitors,+and+cell+specification.">Notch signaling in postnatal pituitary expansion: proliferation, progenitors, and cell specification.</a> Mol Endocrinol. 28 (5), 731-744 (2014).</li><li>Tzou, S. C., Landek-Salgado, M. A., Kimura, H., Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mouse+pituitary+immunogen+for+the+induction+of+experimental+autoimmune+hypophysitis.">Preparation of mouse pituitary immunogen for the induction of experimental autoimmune hypophysitis.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li><li>Budry, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Related+pituitary+cell+lineages+develop+into+interdigitated+3D+cell+networks.">Related pituitary cell lineages develop into interdigitated 3D cell networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12515-12520 (2011).</li><li>Wilson, D. B., Wyatt, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathology+of+the+pituitary+gland+in+neonatal+little+(lit)+mutant+mice.">Histopathology of the pituitary gland in neonatal little (lit) mutant mice.</a> Histol Histopathol. 7 (3), 451-455 (1992).</li><li>Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardial+perfusion+fixation+of+the+CNS+by+means+of+a+compressed-air-driven+device.">Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device.</a> J Neurosci Methods. 12 (2), 141-149 (1984).</li><li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZBTB20+is+required+for+anterior+pituitary+development+and+lactotrope+specification.">ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification.</a> Nat Commun. 7, 11121 (2016).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

لوضع بيتويتاريس مورين، كان من الصعب من الناحية الفنية للحصول على أقسام الاكليلية السليمة نظراً لخصائصها صغيرة وهشة والخصائص التشريحية الفريدة6،8. ومن ثم اختيار بعض المجموعات البحثية أبواب منتصف السهمي لتحليل مورفولوجية الجنينية والوليدية الغدة النخامية11،12. على الرغم من أن القسم منتصف السهمي للغدة النخامية أيضا قادرة على عرض أمامي، والمتوسطة، والخلفي الفصوص في شريحة واحدة، قسم الاكليلية المفضل عالية كما يمكن أن تظهر طريقة عرض الحد أقصى لهذه الفصوص الثلاثة. على وجه الخصوص، لدراسات القياس الكمي، مثل تحديد حجم ومجال الغدة النخامية وإحصاء عدد أبوبتوتيك وتكاثر الخلايا، وأقسام الاكليلية متفوقة على أبواب منتصف السهمي فيما يتعلق الممثل. نقدم هنا، وسيلة مفيدة لتشريح الغدد النخامية وإعداد أقسام الاكليلية الغدة النخامية من الفئران البلدان النامية.
لتجنب إتلاف الغدد النخامية خلال العملية، وقد استخدمت العديد من التقنيات في هذا البروتوكول. أولاً، يحدد نضح ترانسكارديال الفورمالدهايد قبل تشريح الفئران. ويساعد هذا مثبت ليس فقط الحفاظ على بنية الجهاز ولكن أيضا لإزالة خلايا الدم الحمراء التي كثيرا ما تسفر عن السيارات fluorescence13. ثانيا، هو تشريح منطقة سيلا كامل لتجنب لمس الغدة النخامية مع أي أدوات الصلبة الجراحية. الأنسجة المحيطة تساعد على إبقاء الغدة النخامية في موضعه الأصلي وأيضا بمثابة معالم لتضمين التوجه. مع هذه الأساليب المستخدمة، يمكن تشريح أصغر بعد الولادة بيتويتاريس من الحيوانات الشابة في حين التقليل من احتمالات الضرر غير مرغوب فيها.
إجراء التشريح في هذا البروتوكول ينطبق أيضا على عزل النخامية مورين التي لم يحدد مسبقاً قبل التروية. وفي هذه الحالة، ينبغي اتخاذ مزيد من الحذر لتجنب أي ضرر غير مرغوب فيها، وينبغي أيضا أن يكون تشريح الغدة بأقصى سرعة ممكنة.
منذ بيتويتاريس مورين النامية صغيرة جداً في الحجم، كان من الصعوبة بمكان توجيه لهم بشكل صحيح عند تضمين. هذا البروتوكول يستخدم trigeminal الأعصاب أو العظام الاسفينية كالمعالم، مما يجعل الخطوات التوجه أسهل بكثير. بيتويتاريس موجها بشكل صحيح أمران أساسيان لتحقيق إرضاء المقاطع الاكليلية.
وباختصار، نحن نقدم تشريح الغدة النخامية محسنة وتضمين البروتوكول، ومناسبة للفئران في مراحل مختلفة من التنمية. يمكن تطبيق هذه الإجراءات للحصول على إرضاء المقاطع الاكليلية مورين الغدد النخامية لاستخدامها لتحليل الأنسجة الروتينية، إيمونوهيستوتشيميستري، والتهجين في الموقع ، والبحوث الإنمائية14.

الغدة النخامية أو النخامية جهاز الغدد الصماء هام إفراز الهرمونات الضرورية للتوازن1،2. تشريحيا، الغدة النخامية بنية '' اثنين في واحد '' تتكون من نيوروهيبوفيسيس وأدينوهيبوفيسيس. هذه الأجزاء لها أصول جنينية مختلفة والدالة بطريقة مختلفة جداً. مشتق من الأديم الظاهر العصبي neurohypophysis وتفرز الاكسيتوسين والهرمون المضاد. Adenohypophysis تنبع من الحقيبة راثكي وهي المسؤولة عن الإفراج عن الهرمونات بما فيها هرمون النمو، البرولاكتين، – الغدة الدرقية الهرمون، جريب – الهرمون، والهرمون، وهرمون ﻫﺭﻣﻭﻧ، و الصباغية – الهرمون3،،من45.
الغدة النخامية تقع على سطح عظم وتدي (السرج) الجمجمة الماوس الظهرية وإرفاق الكلمة الدماغ بساق هشة. ويحاط جانبياً بالاعصاب تريجيمينال والأسفل6،chiasm البصرية7. الغدة بشكل بيضاوي ممدود مع محورها طويل عمودي إلى رئيس. على سطحه الظهرية، في نيوروهيبوفيسيس وفي أدينوهيبوفيسيس يمكن بسهولة أن ترسيمها، مع السابقة تحتل منطقة وسطى الظهرية وتوسيع هذه الأخيرة أفقياً وبطنيا. خلال التنمية اللاحقة للولادة، وزيادة حجم الغدة النخامية سريعاً في الشهر الأول بعد الولادة8،9. ومع ذلك، لا تزال الغدة النخامية الماوس صغيرة جداً في الحجم مع متوسط وزن 1.9 ملغ وقطر منذ فترة طويلة-محور ~ 3 مم في البالغين10، قطر منذ فترة طويلة-المحور 2-2.5 ملم في يوم الولادة 21 (P21)، و 1-1، 5 ملم فقط في P0.
مقطع الاكليلية هو المفضل لعرض كل من أدينوهيبوفيسيس ونيوروهيبوفيسيس في شريحة واحدة من الغدة النخامية الماوس. بيد بعض المهارات التقنية المطلوبة للحصول على إرضاء المقاطع الاكليلية الغدد النخامية من الفئران نظراً للحجم الصغير استثنائية والتشريح متميزة البلدان النامية. في هذه المقالة الفيديو، نظهر كيفية تشريح الغدد النخامية الماوس وإعداد أقسام الاكليلية الغدة النخامية في مراحل مختلفة من التنمية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tools/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors-straight</td>
			<td>JinZhong</td>
			<td>J21010</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors-strainght</td>
			<td>JinZhong</td>
			<td>WA1010</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt forceps</td>
			<td>JinZhong</td>
			<td>JD1020</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>RS-5015</td>
			<td>for isolation of the pituitary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G (0.45mm) needle</td>
			<td>HongDa</td>
			<td></td>
			<td>for transcardial perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>300841</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (10 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens cleaning paper</td>
			<td>ShuangQuan</td>
			<td></td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anatomical microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>SZX-ILLB2-200</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassette</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22-272423</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue embedding console system</td>
			<td>KEDEE</td>
			<td>KD-BM11</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HM315R</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost-Plus slides</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12-543</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>BH2-RFCA</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>BBI</td>
			<td>EB0448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4.12H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71650</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2222</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaNO2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>237213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Injection</td>
			<td>SPH</td>
			<td>H31022051</td>
			<td>for perfusion saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10023418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>8330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9627</td>
			<td>for H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4009</td>
			<td>for H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti growth hormone (GH)</td>
			<td>National Hormone</td>
			<td></td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibody</td>
			<td>Pituitary Program</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse GFAP antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9269</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, HRP</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA system</td>
			<td>NEN Life Science Products</td>
			<td>NEL700</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S32356</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FITC Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11090</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and coronal slice preparation of developing mouse pituitary gland

الغدة النخامية أو النخامية جهاز الغدد الصماء هام إفراز الهرمونات الضرورية للتوازن. يتكون من الغدد اثنين مع أصول الجنينية منفصلة والوظائف – في نيوروهيبوفيسيس وفي أدينوهيبوفيسيس. الغدة النخامية الماوس نامية صغيرة وحساسة بشكل بيضاوي ممدود. مقطع الاكليلية هو المفضل لعرض كل من أدينوهيبوفيسيس ونيوروهيبوفيسيس في شريحة واحدة من الغدة النخامية الماوس.
والهدف من هذا البروتوكول تحقيق الأقسام الاكليلية الغدة النخامية سليمة مع أبنية الأنسجة المحفوظة جيدا من البلدان النامية الفئران. ونحن في هذا البروتوكول، تصف بالتفصيل كيفية تشريح ومعالجة الغدد النخامية بشكل صحيح من البلدان النامية الفئران. أولاً، يحدد نضح ترانسكارديال الفورمالدهايد قبل تشريح الفئران. ثم يتم تطبيق ثلاث تقنيات تشريح مختلفة للحصول على الغدد النخامية سليمة تبعاً لعمر الفئران. للفئران الجنينية سن 17.5 يوما الجنينية (ه)-18.5 وحديثي الولادة تصل إلى 4 أيام، هي تشريح لمنطقتي سيلا كامل بما في ذلك عظم وتدي والغدة تريجيمينال الأعصاب. الجراء هي تشريح عمره يوما بعد الولادة (ع) 5-14، الغدد النخامية متصلة مع الأعصاب تريجيمينال ككل. للفئران القديمة أكثر من 3 أسابيع، يتم تشريح الغدد النخامية بعناية مجانية من الأنسجة المحيطة بها. ونحن أيضا عرض كيفية تضمين الغدد النخامية في اتجاه سليم باستخدام الأنسجة المحيطة بها كمعالم للحصول على إشباع المقاطع الاكليلية. هذه الأساليب مفيدة في تحليل الملامح النسيجي واﻹنمائية الغدد النخامية في وضع الفئران.

ويقدم هذا البروتوكول وسيلة تشريح الغدد النخامية من الفئران البلدان النامية. للماوس الولدان، ومنطقتي سيلا كاملة تحتوي على الغدة النخامية والأعصاب تريجيمينال، وتحت تم تشريح عظم وتدي خارجاً من قاعدة الجمجمة. الغدة النخامية صغيرة وحساسة لا تزال سليمة أثناء العملية (الشكل 1A). للفئران التي مضى عليها أكثر من 5 أيام، كانت الغدد النخامية يعلق على الأعصاب trigeminal الأفقي ثم عزلة. الهيكل الإجمالي للغدة النخامية معزولة عن P7 كذلك المحافظة على الماوس (الشكل 1B). للماوس P21، تمت زيادة حجم الغدة النخامية ملحوظ مقارنة بالماوس الأطفال حديثي الولادة. وكان الغدة النخامية معزولة بنجاح مع الضرر غير مرئية أثناء إزالة الأنسجة المحيطة به (الشكل 1).
لعرض منطقة الحد الأقصى أدينوهيبوفيسيس ونيوروهيبوفيسيس في شريحة واحدة من الغدة النخامية، مقطع الاكليلية المفضل. تشريح الغدد النخامية كانت موجهة بشكل صحيح لتحقيق إرضاء المقاطع الاكليلية. ح &#38; ه تلطيخ أظهرت أيضا الحفاظ على مورفولوجيا adenohypophysis ونيوروهيبوفيسيس في الغدد النخامية P0 و P7 P21 (الشكل 2).
كما كانت الشرائح المجهزة متوافقة مع وسم الفلورة. على سبيل مثال، أدينوهيبوفيسيس ونيوروهيبوفيسيس أظهرت إيمونولابيلينج محددة من هرمون النمو وتوصيني، على التوالي (الشكل 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56356/56356fig1.jpg"> 
رقم 1: تشريح الغدد النخامية النامي بعد الولادة- آراء الظهرية تشريح الغدد النخامية والأنسجة المحيطة بها من الفئران P0 و P7 P21. A، والأمامية؛ ف، اللاحق؛ L، اليسار؛ R، الحق؛ SB، عظم وتدي؛ تينيسي، العصب تريجيمينال؛ آه، أدينوهيبوفيسيس؛ NH، نيوروهيبوفيسيس. تغيير حجم أشرطة، 1 مم. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56356/56356fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56356/56356fig2.jpg"> 
رقم 2: علم الأنسجة الغدد النخامية الماوس. ح ممثل &#38; ه تلطيخ على أبواب الاكليلية الغدة النخامية من الفئران P0 و P7 P21. (أ وب وج) آراء بيتويتاريس الاكليلية تضخم منخفض. (د، ه، وو) يتم توسيع مجالات مؤطرة في (أ وب وج) على التوالي. تغيير حجم أشرطة = 1 ملم في (أ وب وج)؛ و 20 ميكرومتر (دال وهاء وواو). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56356/56356fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56356/56356fig3.jpg"> 
الشكل 3: تلطيخ إيمونوفلوريسسينت الممثل في الغدد النخامية. (أ) هرمون النمو (أحمر) وأعرب على وجه التحديد في adenohypophysis من الفئران P7. (ب) صورة ماجنيفيد من منطقة مؤطرة في ألف (ج) توصيني (الأخضر) وأعرب على وجه التحديد في نيوروهيبوفيسيس من الفئران P21. (د) صورة ماجنيفيد من منطقة مؤطرة في "نويات جيم" كانت ملطخة DAPI (أزرق). شريط المقياس = 300 ميكرون (ألف وجيم)؛ و 30 ميكرومتر (ب ود). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56356/56356fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland at JoVE.com

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

تشريح وإعداد شريحة الاكليلية وضع الغدة النخامية الماوس

نقدم بروتوكولا لتشريح الغدد النخامية وإعداد أقسام الاكليلية الغدة النخامية من الفئران البلدان النامية.

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

dissection-coronal-slice-preparation-developing-mouse-pituitary

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

17.1K Views.  Second Military Medical University. نقدم بروتوكولا لتشريح الغدد النخامية وإعداد أقسام الاكليلية الغدة النخامية من الفئران البلدان النامية.

Video: Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

السابق الرحم Electroporation للوعضوي النمط من الثقافة شريحة ماوس الحصين الأنسجة

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

طرق لفحص الليمفاوية الغدة وHemocytes في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

يعيش متحد البؤر التصوير من تطوير نبات الأرابيدوبسيس الزهور

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex determination system, where several genes distributed throughout the genome collectively determine the sex identities of individual fish. Currently, the genes involved in regulating gonad development and how they work remain elusive. Normally, isolating gonadal tissue is the first step to examine the sex developmental processes. Here, we present a procedure to isolate gonadal tissue from 17 dpf (days post fertilization) and 25 dpf zebrafish larvae. The isolated gonadal tissue may be subsequently examined by morphology and gene expression profiling.

Here, we present a protocol for isolating gonadal tissue of larval zebrafish, which will facilitate investigations of zebrafish sex differentiation and maintenance.

تشريح اليرقات الزرد الغدد التناسلية الأنسجة

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

تشريح وثقافة ماوس الجنينية الكلى

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

تشريح وتلطيخ المبايض المورفولوجية الخوادر

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a variety of human retinal degenerative diseases and pinpoint new treatment approaches. The nuclear architecture of mouse retina is organized in two different patterns: conventional and inverted. Conventional pattern is universal where heterochromatin is localized to the periphery of the nucleus, while active euchromatin resides in the nuclear interior. In contrast, inverted nuclear pattern is unique to the adult rod photoreceptor cell nuclei where heterochromatin localizes to the nuclear center, and euchromatin resides in the nuclear periphery. DNA methylation is predominantly observed in chromocenters. DNA methylation is a dynamic covalent modification on the cytosine residues (5-methylcytosine, 5mC) of CpG dinucleotides that are enriched in the promoter regions of many genes. Three DNA methyltransferases (DNMT1, DNMT3A and DNMT3B) participate in methylation of DNA during development. Detecting 5mC with immunohistochemical techniques is very challenging, contributing to variability in results, as all DNA bases including 5mC modified bases are hidden within the double-stranded DNA helix. However, detailed delineation of 5mC distribution during development is very informative. Here, we describe a reproducible technique for robust immunohistochemical detection of 5mC and another epigenetic DNA marker 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), which colocalizes with the &#34;open&#34;, transcriptionally active chromatin in developing and postmitotic mouse retina.

The objective of this report is to describe the protocol for robust immunohistochemical detection of epigenetic markers, 5-methylcytosine (5mC) and 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) in developing and postmitotic mouse retina.

الكشف المناعي 5-ميثيلسيتوسيني وهيدروكسيميثيلسيتوسيني 5 في تطوير والشبكية الماوس بوستميتوتيك

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ultrastructural parameters in unambiguously identified topographical structures, affected by a protein of interest that is introduced into the organism via viral transfer. This combined approach allows for a smooth transition from macrostructural to ultrastructural identification by following topographical navigation maps in a tissue atlas. High-resolution electron microscopy of the in-utero-transduced tissue reveals the fine ultrastructure of the neuropil and its plasticity parameters, such as cross-sectioned synaptic bouton areas, the number of synaptic vesicles and mitochondria within a bouton profile, the length of synaptic contacts, cross-sectioned axonal areas, the thickness of myelin sheaths, the number of myelin lamellae, and cross-sectioned areas of mitochondria profiles. The analysis of these parameters reveals essential insights into changes of ultrastructural plasticity in the areas of the nervous system that are affected by the viral transfer of the genetic construct. This combined method can not only be used for studying the direct effect of genetically engineered biomolecules and/or drugs on neuronal plasticity but also opens the possibility to study the in utero rescue of neuronal plasticity (e.g., in the context of neurodegenerative diseases).

The combination of transmission electron microscopy and in utero transduction is a powerful approach for studying morphological changes in the fine ultrastructure of the nervous system during development. This combined method allows deep insights into changes in structural details underlying neuroplasticity with respect to their topographical representation.

تقييم البارامترات أعصاب Ultrastructural بعد في توصيل الرحم النامي الماوس المخ والحبل الشوكي

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and simple protocol to detect protein expression during craniofacial morphogenesis/pathogenesis using mouse craniofacial tissues as examples. The protocol consists of preparation and cryosectioning of tissues, indirect immunofluorescence, image acquisition, and quantification. In addition, a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues for immunostaining is described, using craniofacial tissues and long bones as examples. Those methods are key to determine the protein expression and morphological/anatomical changes in various tissues during craniofacial morphogenesis/pathogenesis. They are also applicable to other tissues with appropriate modifications. Knowledge of the histology and high quality of sections are critical to draw scientific conclusions from experimental outcomes. Potential limitations of this methodology include but are not limited to specificity of antibodies and difficulties of quantification, which are also discussed here.

Here, we present a detailed protocol to detect and quantify protein levels during craniofacial morphogenesis/pathogenesis by immunostaining using mouse craniofacial tissues as examples. In addition, we describe a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues from young mice for immunostaining.

إعداد الأنسجة وتلطيخ المناعة من أنسجة الفئران القحفية والعظام غير الصائق

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ability to study cell movements and differentiation in vivo is still very difficult. Neurocristopathies, or disorders of the neural crest lineage, are particularly challenging to study due to a lack of accessibility of key embryonic stages and the difficulties in separating out the neural crest mesenchyme from adjacent mesodermal mesenchyme. Here, we set out to establish a well-defined, routine protocol for the culture of primary cranial neural crest cells. In our approach we dissect out the mouse neural plate border during the initial neural crest induction stage. The neural plate border region is explanted and cultured. The neural crest cells form in an epithelial sheet surrounding the neural plate border, and by 24 h after explant, begin to delaminate, undergoing an epithelial-mesenchymal transition (EMT) to become fully motile neural crest cells. Due to our two-dimensional culturing approach, the distinct tissue populations (neural plate versus premigratory and migratory neural crest) can be readily distinguished. Using live imaging approaches, we can then identify changes in neural crest induction, EMT and migratory behaviors. The combination of this technique with genetic mutants will be a very powerful approach for understanding normal and pathological neural crest cell biology.

This protocol describes the dissection and culture of cranial neural crest cells from mouse models, primarily for the study of cell migration. We describe the live imaging techniques used and the analysis of speed and cell shape changes.

تشريح والثقافة وتحليل خلايا الجمجمة العصبية الابتدائية من الماوس لدراسة الخلية كريست العصبية الترقيم والهجرة

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...