著者は彼のサポートのための教授エリオット・M・マイヤーウィッツ感謝したい、として技術的な問題の解決に彼らの助けのためのカリフォルニア工科大学の生物学的イメージング施設で、ダートマス大学博士とアンドレス・コラゾで原稿上のコメントと同様に、アン・ラバンウェイライブ共焦点イメージング。ナタナエル・プルネットの仕事は、エリオット・M・マイヤーウィッツにグラントR01 GM104244を通じて米国国立衛生研究所によってサポートされています。

1.メディアと料理の準備<ol><li> 2％アガロース0.5センチメートル（深さ2cm、約6センチ幅）丸いプラスチック製の箱を充填して解剖皿を準備します。 </li><li> イメージングの料理を準備します。 <ol><li>直立共焦点顕微鏡のために、長方形のプラスチックは、イメージング媒体0.5センチメートル（3センチメートル深い4.5センチ幅、約7センチ）ボックスヒンジ埋める（セクション1.3を参照して、「イメージング媒体」; 図1F）。 </li><li>倒立共焦点顕微鏡用：（セクション1.3、「イメージング媒体」を参照; 図1G）イメージング媒体と鍔に正確に（1センチメートル深い、約3.5センチ幅）小さなペトリ皿を埋めます。 </li></ol></li><li> イメージング媒体を準備します。 <ol><li>シングルポイントイメージングのために、1％アガロースを使用します。 </li><li>時間経過実験のために、ビタミンなし（0.5Xムラシゲ及びスクーグ基礎塩混合頂点増殖培地を使用して、1％スクロース、0.8％アガロース、カリウムhydroxidでpH 5.8ビタミンを補充したE溶液[0.01％ミオ-イノシトール、0.0001％ニコチン酸、0.0001％の塩酸ピリドキシン、0.001％チアミン塩酸塩、0.0002％グリシン]とサイトカイニン[500nMのN6-ベンジル]）15。 </li></ol></li></ol> 2.植物の成長<ol><li>適切な選択とMSプレート（ビタミン無し0.5または1xムラシゲ・スクーグ基礎塩混合物を、0.8％寒天、水酸化カリウム溶液でpH 5.8）で滅菌した種子をまきます。長い一日（16時間光）または連続日に場所プレート、2週間16〜22℃の条件。 </li><li>堅牢な開発を可能にするのに十分な間隔で土壌への移植苗。短日に入れ工場、3週間16-22°Cの条件。 注：直接、早期開花とあまり活発、および解剖がはるかに困難です花序で結果を移植した後、長い一日または連続日の条件で植物を育てます。同様に、短日コンディットの下で植物を残します3週間以上のためのイオンは一日の長さに依存しない開花とあまり活発です花序になります。 </li><li>長い一日（16時間光）または連続日に転送する植物、それらの花まで16-22℃の条件。花序2-10センチのとき茎頂を解剖するのが最も簡単です。 </li></ol>茎頂の3解剖<ol><li>オプション：細かい研ぎ石と軽油のドロップを使用して、点状ではない、彼らはブレード状にするために実体顕微鏡下に鉗子を研ぎます。 </li><li>彼らは壊れるまで、ピンセットで花柄のベースを押すことで、主花序からの長角果、古い花のつぼみと二次花序を削除します。倍率ことなく、できるだけ多くの花を削除する（ 図1、AとBを比較）。 </li><li>鉗子、解剖皿のアガロースでピアス縦穴を使用して、花序の最後の0.5cmに切断し、アガロースに垂直に固執。残り花芽は、アガロース表面上でなければなりません。 </li><li>茎頂が完全に浸漬されるように、滅菌脱イオン水で撮像皿を埋めます。 （CとDを比較し 、 図1）実体顕微鏡下で解剖皿を置き、1,000μLピペットで水ジェットを作成することによって、茎頂の周りに閉じ込められた空気を除去します。 </li><li>実体顕微鏡下で、柄の切断（ 図1E）まで、柄の基部又は芽の上に押すことによって結像されるべきではなく、花の芽を除去するために鉗子を使用します。残り花柄が若い花芽の除去を妨げるよう花梗は、ステムとの接合部できれいに破ることが重要です。 </li><li>撮像のみ花芽ステージ5と若い（ 図2A）は 、ステージ6~8の花蕾を切開する前に水を除去した場合。イメージング花芽ステージ5と古いが、がく片の切除に進んでいる場合（セクション5.1を参照してください）。それ以外の場合は、プロ3.7段階にCeedで。 </li><li>鉗子を用いて、撮像皿の中に垂直穴を貫通し、培地中の解剖頂点直立スティックのみシュート頂端分裂組織ように花芽を取り囲む媒体の表面上にあります。花芽は必ずしも正確幹（ 図2A）のように配向されていないとして結像されるべき花蕾（単数または複数）に応じて、わずかに試料を傾斜させる必要があるかもしれません。 </li><li>必要に応じてサンプルを染色に進みます。染色および/またはすぐにサンプルを撮影していない場合は、水を追加し、脱水症状を防ぐために、イメージング皿を閉じます。倒立顕微鏡を使用している場合、透明なプラスチックボックスに撮像皿を置き、それを閉じます。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55156/55156fig1.jpg" /> 図1：ライブ共焦点イメージングのための茎頂の調製。 （A - E）の解剖イメージングのための頂点を撃ちます。花序（A）の前と長角果や古い花の（B）を除去した後。 （C - D）茎頂は、先端部（C）に捕捉された気泡を有する、解剖皿に水に浸漬し、気泡（D）を除去した後。 （G）（F）直立および倒立共焦点顕微鏡のステージ上で、イメージング皿で茎頂のビュー- （E）はステージ5（G F）よりも古い花芽の解剖の後、解剖皿に頂点を撃ちます。 （F）において、40X水浸漬レンズを水に浸漬レンズの先端部と、頂点の上方に配置されています。 （G）において、茎頂がレンズの先端に画像形成媒体を接続水柱で、逆さま40X水浸漬レンズ上に配置されます。 （F）が小さいパネルは、HIGを示します画像形成媒体に挿入茎頂を持つ赤い長方形エリア、彼女の拡大図です。赤と青の線は、それぞれ、媒体及び水の表面を示します。 （H - I）水浸漬レンズの先端でより多くの水を添加可能カスタムメイドのデバイスの例：の指から製造されたスパークプラグブーツ（H）からなるシリコンゴムスリーブ、及び仮設スリーブpowderlessラテックス手袋（G）。スケールバー= 0.5（A）でCMと（B）、（C）および（D）0.1センチメートル、及び（E）で100μmです。この図は、最初の参照14に掲載されました。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55156/55156fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 4.染色注：細胞壁やプラズマ膜は、それぞれ、ヨウ化プロピジウムまたはFM4-64で染色することができ、細胞の解像度を達成するために撮影時。代替的に、原形質膜にタグ付けされた蛍光タンパク質とレポーター株は6、16を使用することができます。 <ol><li>撮像皿から水を除去し、媒体の表面に染料を希釈回避するために乾燥していることを確認します。 </li><li>実体顕微鏡下で、1mg / mlのヨウ化プロピジウム溶液、または10μLピペットで切開頂点80 / mlのFM4-64溶液のいずれかの20〜30μLを加えます。試料全体が均質な染色を確保するために染料で覆われていることを確認します。 </li><li> FM4-64を使用する場合、ヨウ化プロピジウム、または20分を使用している場合は2分間染色します。 </li><li>滅菌、脱イオン水で2回洗浄します。 </li></ol> 5.がく片アブレーション注：ステージ4で、がく原基はFMをカバーし始めます。彼らが成長するにつれ、彼らは下にある組織からの蛍光をフィルタリング、およびイメージングプロセスを妨げます。萼片は、いずれかの金属ピンmounteを使用して手動で除去することができますピン万力上のD、または新興がく原基にレーザアブレーションを使用して成長することを防ぎます。あるいは、萼片が存在しないか、花の中央部は、通常、（ 図 2F）17を展開しながら、FMをカバーしていない葉状器官で置換された、例えばapetala1-1ような変異体を使用するいくつかの場合には可能です。 <ol><li> 花芽段階で萼片切除5及び古いストレート金属針保持ピン万力を使用して（図2、E1-E2） <ol><li>実体顕微鏡下で解剖頂点と解剖皿を置き、そして最大倍率を設定します。滅菌、脱イオン水で茎頂を浸し、あるいは、がく片を解剖しながら、定期的に茎頂に水を適用するために千μLピペットを使用しています。 </li><li>ピン万力で、茎頂に対する接線方向、軸外がく片の上にピンを配置します。それは離れて破断するまで静かに離れて茎頂からの萼片を押します花芽から。 </li><li>向軸萼片と同様に進みますが、茎頂に向けて萼片を押してください。 </li><li>横がく片と同様に進みますが、茎頂に対して半径方向にピンを配置し、花のつぼみから離れて、側にがく片を押してください。 </li><li>脱水症状を防ぐために、数分間滅菌、脱イオン水で茎頂を浸し。 </li></ol></li><li> 段階3-4でがく片原基のレーザアブレーション（図2、C5、D5） <ol><li>共焦点顕微鏡のステージ上で染色し、解剖頂点と撮像皿を置き。 （第6章、「撮影設定」を参照）探して、画像にそれを準備するかのように頂部に焦点を当てます。 </li><li>レーザーアブレーションシステムソフトウェアを使用して、彼らは花の分裂組織を覆う開始する前に出現萼片原基の山と先端に対応する切除ゾーンを定義（典型的には、軸外及び向軸萼片のためのステージ3で、および後期段階で3 /早いです横SEのステージ4仲間）。 </li><li>設定されたレーザパワーと適切なパラメータへの滞留時間は、基礎となる組織にあまりにも多くのダメージを与えることなく、十分な細胞を切除します。一般的に、使用したレーザーアブレーションシステムに応じて、適切なパラメータは最初の花の他の部分に影響を与えず、その後FMの上に成長させるためのがくを防ぐために除去されることに十分な細胞を確実にするために試行錯誤のプロセスを通じて識別される必要がつぼみ。あまりにも多くのレーザーパワーを使用し、花の中央に損害賠償時間の結果を住居、その成長および/または生存に影響を与えます。適切なパラメータが識別されると、彼らはその後の実験のために再利用することができます。 注：最初の切除が不十分で判明した場合、それは次の日に第二のアブレーション（ 図2、C4及びD2）に進むことが可能です。 </li></ol></li></ol> 6.イメージングのセットアップ<ol><li> 正立顕微鏡を使用してください。 <ol&gt; <li>媒体の表面が2.5〜5ミリメートル水（ 図1F）に覆われるように、滅菌脱イオン水で解剖頂点と撮像皿を埋めます。完全にサンプルを浸します。 注：正立顕微鏡で撮像する場合、いくつかの頂点が同じ撮像皿に配置することができます。イメージングプロセスは時間以上続く場合は、ヨウ化プロピジウムを希釈する傾向があり、いくつかのサンプルは、撮像前に再染色を必要とするかもしれません。 </li><li>顕微鏡ステージ（ 図1F）上の撮像皿を置き。水浸漬レンズを低下させ、レンズの先端を水中に浸漬するように段階を上げます。解剖頂点を破砕またはイメージング媒体中にレンズを浸漬しないように慎重に進みます。 </li><li>気泡がレンズの先端に捕捉されている場合、それを除去するために千μLピペットで水ジェットを作ります。 </li><li>落射蛍光照明、XYコンを使用してレンズフィールドに位置解剖頂点の下トローラ。接眼レンズを通して見るとZのコントローラを用いて試料に焦点を当てます。サンプルを粉砕しないようにするために慎重に進んでください。 </li><li>画像化される、花芽のズームを共焦点顕微鏡のソフトウェアを使用して、あなたのサンプルを画像化に進んでください。 </li></ol></li><li> 倒立顕微鏡を使用してください。 <ol><li>千μLピペットを用いて、レンズの先端に、滅菌脱イオン水の液滴を置きます。 </li><li>撮像皿逆さまを持ち、1,000μLピペットで、解剖頂点に、滅菌脱イオン水の液滴を加えます。 </li><li>顕微鏡ステージ（ 図1G）に撮像皿逆さまに置きます。サンプルを粉砕しないように慎重に進んでください。 </li><li>落射蛍光照明下で、XYコントローラを使用してレンズの先端にわたって解剖頂点を位置付けます。試料は、レンズ先端の水滴に達するまでZコントローラと、慎重にステージを下げます。水柱はbetw形成すべきですレンズの先端と媒体EEN。 </li><li>水柱が形成されない場合は、慎重千μLピペットでサンプルに水滴を追加します。水柱（ 図1Hおよび1I）の確立および維持を容易にする、その先端に、より多くの水を追加するためにレンズに間に合わせのスリーブを加えます。 </li><li>落射蛍光照明下で、接眼レンズを通して見て、Zコントローラを用いて試料に焦点を当てます。サンプルを粉砕しないように慎重に進んでください。 </li><li>画像化される、花芽のズームを共焦点顕微鏡のソフトウェアを使用して、サンプルを画像化に進んでください。 </li></ol></li><li>経時実験を行う場合、撮像皿から水を注ぐと時点間での脱水を防止するために、それを閉じ。長い一日（16時間光）または連続日のサンプル、16〜22℃の条件で撮像皿を置き。各時点の前に再染色サンプル。 注：develoにいる間の細胞pingの花器官は、毎秒1日に1回または2回花の分裂組織の分裂で、より高速なセルを分割することができ、および細胞系統は、時点ごとに24時間を追跡するのは簡単です。必要であればしかし、それは6時間ごとにサンプルを画像化することが可能です。 </li></ol>撮像パラメータ7.留意事項注：イメージングパラメータを設定する方法は、使用、共焦点システムに大きく依存します。下記のいずれかの共焦点顕微鏡を用いて使用することができ、これらのパラメータのいくつかのための提案です。撮像パラメータの詳細な考慮事項については、 議論のセクションを参照および14を参照します。 <ol><li> XY解像度の場合：良い携帯解決のために1,024×1024を使用しています。代替的に、解像度を犠牲にし、撮像時間を短縮するために512×512を使用します。 </li><li> Z分解能の場合：0.5〜1.5μmのステップサイズを設定します。ステップサイズを下げるとZ分解能も撮影時間を増加させます。 </li><li&gt;ピンホールの場合：1-1.5風通しの良いユニットにピンホールを設定します。ピンホールを大きくすると、信号の強度を増大させるだけでなく、非焦点面からの騒音。 </li></ol>共焦点データの可視化8。 <ol><li> ムービーにはまだ花の開発の時点の画像をONにします。 <ol><li>ソフトウェア（ 例えば 、フィジー）に（JPEGまたはTIF形式）の静止画像を開きます。 </li><li>スタックへの画像&gt;スタック&gt;画像に移動します。オープン画像はスタックにグループ化されます。 </li><li>スタック内の画像の順序は年代順に対応していない場合は、それらを並べ替えるためにスタックソータープラグイン（プラグイン&gt;スタック&gt;スタックソーター）を使用します。 </li><li>ムービーにスタックを有効にするには、&gt;名前を付けて保存&gt; AVIファイルに移動します。 </li></ol></li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+cell+shape+and+gene+expression+in+the+shoot+apical+meristem+using+MorphoGraphX.">Quantifying cell shape and gene expression in the shoot apical meristem using MorphoGraphX.</a> Methods Mol. Biol. 1080, 121-134 (2014).</li></ol>

著者は、開示することは何もありません。

ここでは、共焦点顕微鏡と水浸漬レンズをシロイヌナズナ花芽を開発し、ライブの画像化のためのプロトコルを提供します。これが直立または倒立顕微鏡のいずれかで行うことができますが、元を使用するように簡単かつ迅速です。異なる共焦点システムは、速度、感度、および波長を分離する能力の点で有意に異なることも注目に値します。同じサンプルで、最高の共焦点顕微鏡は現在、画像、いくつかの異なるチャネル（ 図2G 例えば GFP、YFP、DsRedのヨウ化プロピジウム）を可能にします。いくつかの共焦点顕微鏡は、同時に複数のフルオロフォアからの蛍光を収集し、その後それらを分離することができ、スペクトル検出器が装備されています。定期的な検出器を使用する場合は、しかし、レーザーやフィルタのセットが異なる蛍光体からの蛍光を励起し、分離するために使用する必要があります。いくつかのフルオロフォア（ 例えば 、CFP ANを完全に明確な発光スペクトルを有しますYFP）D、及び同時に画像化することができます。他のフルオロフォアは、部分的に重複する発光スペクトル（ 例えば、GFPおよびYFP）を有し、そして通常撮像時間を増加させる、別々に画像化される必要があります。近くに蛍光団を画像化することもしばしば他のチャンネルへの漏洩から1発蛍光団からの蛍光を防ぐために、各チャンネルのために収集され、どのくらいスペクトルの制限が必要です。これは、レーザパワーと利得の増加によって補償することができる収集された信号の強度の損失を引き起こします。しかし、長期の撮影時間と増加レーザパワーは漂白剤及び/又は試料に損傷を与えることができます。増加したレーザパワー及び/またはゲインもバックグラウンドノイズを増加させることができます。各サンプルの信号強度、解像度、撮像時間の最適化は、試行錯誤のプロセスを介して行われ、永久的なトレードオフを伴います。 このプロトコルは、解剖茎頂の側面で開発花芽のライブ共焦点イメージングを実行する方法について説明します。それ茎頂は、植物の残りの部分に接続されていないとサイトカイニンを含む培地中で成長しているという事実は、SAMと花の発達に影響を与える可能性があると主張することができます。しかし、この媒体は解剖茎頂分裂組織が正常なplastochronで新しい花芽を生成し、これらの花芽は、通常15を開発することを保証するために、試行錯誤のプロセスを通じて経験的に設計されました。同様に、がく解剖は、遺伝子発現パターンや花の残りの発展に影響を与えるように表示されません。 SAMのライブ共焦点イメージングを実行するためにどのように他のプロトコルの詳細は、まだ植物（ 例えば 、参照11）の残りの部分に取り付けられています。そのようなプロトコルはするように適合され、及び特にサイトカイニン関連のプロセスを研究するとき、花の開発のイメージングのために有用な選択肢を提供することができます。しかし彼らはいくつかの欠点が存在する：幹伸長やねじれをし、花芽の向きを変えます。 A植物の残りの部分に結合して茎頂を画像化することは正立顕微鏡でうまく動作しながら、ND、それは倒立顕微鏡でこれを行うにはるかに複雑です。 液浸レンズは、「乾燥」レンズ（空気によってサンプルから分離されている、すなわちレンズ）よりも良好な開口数（NA）を有し、したがって、共焦点顕微鏡を使用する場合に重要である試料のより微細な分解能を提供します。イメージングプロセスの間脱水から茎頂を防止しつつ、水浸漬レンズを使用すること、したがって、ドライレンズよりもはるかに良いNAを提供します。グリセリンと油レンズは水のレンズよりもさらに高いNAを持っているが、それらはサンプルもタイムラプス実験の間に成長し続けて茎頂、の大きさに非常に実用的でないカバースリップの使用を必要としています。サンプルの大きさを考えると、長い作動距離を有するレンズを使用することも重要である（花の段階に応じて、スタックが上150μmの厚さであることができます）。我々は、典型的には、1のNA及び1.7〜2.5ミリメートルの作動距離と20又は40Xレンズを使用します。 共焦点顕微鏡ソフトウェアは、三次元再構成（ 図2、B1、B2およびB4）とスライスビュー（ 図2、B3）を含む共焦点データを視覚化するためのいくつかの方法を、提供します。最も一般的に使用される三次元ビューは、共焦点のZスタックの最大強度投影（ 図2、B1及びB4）であるが、いくつかのソフトウェア（ 例えば ZENとIMARIS）ものより深い部分からの信号をフィルタリング透明度の景色を眺めることができ表皮層で発現起こるプロセス、又は遺伝子を見たときに有用であり得るサンプル（ 図2、B2）。信号強度は、いずれかの画素INTEを使用して、単一の色（ 図2、B1）で符号化することができますnsity、またはカラーコードを使用して（ 図2、B4）。 ライブ共焦点イメージングだけでなく、花の開発に貴重な定性的な洞察を提供しています、それはまた、潜在的に定量的なデータの豊富な発達生物学者を提供します。異なるソフトウェア（ 例えば IMARIS、フィジー、MARS-ALT、MorphographX 15、20、21）の数、または1つまたはいくつかのレポーター、または異なる細胞におけるレポーターの発現レベルを発現する細胞の量の定量化を可能にします。そのようなソフトウェアはまた、自動細胞分割を行う細胞系統を追跡し、成長を定量化するために使用することができます。この別のソフトウェアには、同様のツールを提供していますが、また、多くの点で異なります。 MARS-ALTとMorphoGraphXはIMARISのAとは異なり、植物15、20、21のために特別に設計されましたNDフィジー。 IMARISおよびMARS-ALTは、サンプル全体のセグメント化および分析を可能にしながらMorphoGraphXのみ、表皮層のセグメント化および分析を可能にします。ただし、MARS-ALTは、3つの異なる角度15からの同じサンプルの前イメージングを必要とし、IMARISは単一のスタックを必要とします。定量的な情報へのアクセスは、花の開発の我々の理解を促進することが重要です。

または、頂端分裂組織 - - 芽や根の植物体の大部分は、ステム・チップで、または近くに位置する細胞のグループからポスト胎生形成しています。大人の植物のすべての地上構造物は、継続的にその側面に横方向の臓器を作り出す茎頂分裂組織（SAM）、から派生：栄養段階の間、葉、花の分裂組織（FMS）、それは生殖相に遷移した後。順番にFMSが花へと発展します。シロイヌナズナSAMは、一度に横臓器いずれかを生成しながら、繰り返し、螺旋パターンで、FMSが同時に解明複数発達プログラムと、部分的に同期して4つの渦巻き内の花器官の4種類の生成します。異なった花器官のアイデンティティの仕様の基礎となる遺伝子ネットワークは、部分的に花のdevelopmeのが、多くの側面（レビューのために、参考文献1、2を参照）が解読されていますNT、花器官の位置と渦巻きの間の境界の定義など、よくわかっていないまま。 植物の開発の初期の分子遺伝学的研究は、主に遺伝子発現を解析するために、このようなin situハイブリダイゼーションおよびGUSの記者のように 、技術に依存していました。これらのメソッドは、豊富な情報を提供し、大幅に植物の成長と花の開発の我々の理解に貢献してきたが、重要な制限があります：彼らは良い携帯解像度が不足している、同じ内の複数の遺伝子の発現パターンを簡単に観察することができません。サンプルは、そして重要なのは、唯一の死者、固定組織に適用することができます。共焦点顕微鏡の最近の進歩は、これらの制限を克服し、植物の形態形成の基礎をなす過程を調査するための強力なツールと発達生物学者を提供しています。具体的には、共焦点顕微鏡は、Cであり、それらの形成、全体生組織および器官の観察を可能にします完全な開発などの典型動的なプロセスを理解することがritical。 ライブ共焦点イメージングは広く、（ 例えば参考文献7、8（ 例えば 、3参照4、5、6）が、いくつかの報告を除き、SAMによる植物の空中成長と横方向の臓器の生産を分析するために使用されてきました9、10）、それが広く花の開発の研究に適用されていません。 SAMのライブ共焦点イメージングのためのプロトコルは（11、12を参照するなど ）が利用可能であり、どのようにイメージSAMを囲む開発花芽をするための優れた基盤を提供します。しかし、イメージング花芽具体的な課題を提示します。例えば、花芽を迅速SAMよりも大きくなり、ステージ4で、萼片は、（参照13に記載のように段階）FMを覆う起動し、下にある組織（ 図2A）からの蛍光を調光。ここでは、直立または倒立顕微鏡と水浸漬レンズのいずれかを使用して、シロイヌナズナの花のつぼみの開発にライブ共焦点イメージングを実行する方法を説明する詳細なプロトコルを提供します。我々は以前、参照14で、このプロトコルを発表しました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="858">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">72701-D</td>
			<td style="width:325px;">Dumont Style 5 Inox, for apex dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Pin Vise</td>
			<td style="width:143px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">13560</td>
			<td>80 cm long, for sepal ablation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Straight Stainless Steel Needles&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">13561-50</td>
			<td>0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Round plastic boxes</td>
			<td style="width:143px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">64332</td>
			<td>transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rectangular hinged boxes</td>
			<td>Durphy Packaging Co.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">DG-0730</td>
			<td>transparent, 2-7/8&#8221; long, 2&#8221; wide, 1-1/4&#8221; deep, to use as imaging dishes with an upright microscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile</td>
			<td style="width:143px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25382-064</td>
			<td>transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P10 and P1000 pipettes&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>with corresponding filter tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>with an 80-90 x maximum magnification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser ablation system</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>for sepal ablation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Laser scanning confocal microscope system</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 or 40 x water-dipping lens</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Agarose</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murashige and Skoog basic salt mixture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M5524</td>
			<td>without vitamins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Myo-inositol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I7508</td>
			<td>vitamin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Nicotinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N0761</td>
			<td>vitamin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyridoxine hydrochloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6280</td>
			<td>vitamin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiamine hydrochloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1270</td>
			<td>vitamin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8790</td>
			<td>vitamin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N6-Benzyladenine&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B3408</td>
			<td>BAP, a cytokinin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Propidium iodide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4864</td>
			<td>1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">FM4-64</td>
			<td style="width:143px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">F34653</td>
			<td>dilute in water to 80 &#956;g/mL, to stain the plasma membranes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live confocal imaging of developing arabidopsis flowers

植物の成長と発展の研究は長い間死んで、固定組織を使用して、適切な細胞解像度を欠く実験技術に頼っています。数多くの蛍光体の開発と組み合わせた共焦点顕微鏡の最近の進歩は、これらの問題を克服し、ライブのサンプルで、良い細胞の解像度で、同時にいくつかの遺伝子の発現を研究する可能性を開きました。ライブ共焦点イメージングは​​、開発を研究するための強力なツールで植物生物学者を提供し、広く根の成長と茎頂分裂組織の側面に横方向の臓器の形成を研究するために使用されてきました。しかし、それは広くにより、このような花の分裂組織と共に成長がく片などの花を、イメージングに固有の課題に一部、花の開発の研究に適用され、そして下の組織からの蛍光をフィルタリングされていません。ここでは、アラブの開発、ライブでライブ共焦点イメージングを実行するための詳細なプロトコルを提示します直立または倒立顕微鏡のいずれかを使用して、花芽をidopsis。

図2は、異なる蛍光レポーター遺伝子を発現する生きたシロイヌナズナ花芽の共焦点Z-スタックの異なるビューを提示し、いずれかのヨウ化プロピジウム（ 図2、A-C5及びG）又はFM4-64（ 図2、E1-F）を用いて染色しました明確な細胞の解像度を提供しています。最も共焦点システムは、ヨウ化プロピジウムまたはFM4-64（ - 2F 図2A）のいずれかと一緒に、このようなGFPまたはYFPなどの非重複発光スペクトルを有する2つのフルオロフォアの画像化を可能にします。最良焦点システムも同じようなGFPおよびYFP、およびDsRedのような試料、およびヨウ化プロピジウム（ 図2G）に部分的に重複する発光スペクトルを有する複数のフルオロフォアを分離することができます。 タイムラプス実験の3つの例を図に示されています2及びがく片アブレーション、レーザアブレーションシステム（ 図2、C1-C5およびD1-D5）を用いて、または手動ピン万力と金属ピン（ 図2、E1-E2）のいずれかを行った後、通常の現像表示花芽。 図2に示されている花芽は、E1-E2が心皮原基は花芽の出現がく原基のステージ7レーザアブレーションで蕾の中心で観察されていない理由であるスーパーマン-1変異植物からのものであることに注意してください図2に示される、C1-C5はまだステージ5（ 図2、C5）で撮像することができるFMをカバーするのを防止します。逆に、 図2に示した花芽の場合には、D1-D5は 、レーザーアブレーションは、萼片の成長を遅らせたが、萼片は、最終的にステージ5（ 図2、D5によってFMの大部分を覆うように成長しました</強いです&gt;）。あまりにも多くのレーザパワーと滞留時間は、レーザーアブレーションの際に使用されている場合は逆に、ダメージは花の中心部に広がり、その成長に影響を及ぼし、時には全体の花芽のその後の死をもたらします。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55156/55156fig2.jpg" /> 図2：ライブ花芽の共焦点Z-スタックの可視化。 AとB2は、透明性の図です。 B1とB4-Gは、最大強度の投影です。 B3は直交スライス図です。 （A - E2）花APETALA3遺伝子 （緑色）のためのビーナスレポーターを発現します。細胞壁は、ヨウ化プロピジウム（B4以外の赤、緑）で染色しました。 （A）花序。数字は花の段階を示しています。段階における萼片4及び5花金星レポーターの蛍光をフィルタリング、通常FOリングを実効値。一部の花芽が花序に比べて傾いて見えることに注意してください。 （B1 - B4）ステージ5花芽の同じ共焦点Zスタックの4つの異なるビュー：緑色（B1）または火災のカラーコードの画素強度で符号化されたビーナス信号強度と最大強度投影（B1とB4） （B4;カラーコードは、パネルの下部に示されています）。透明ビュー（B2）と直交スライスビュー（B3;スライスのXY、XZおよびYZ方向のパネルに示されています）。 （C1 - C5）ステージ5の段階3からの個々の花芽の4日間の時間経過。 （白色の形質としてマークされた）アブレーションは、1日目と3日目に行わ（D1 - D5）段階5で花芽の中心を覆うから萼片を防止するのに十分であったから、個々の花芽の4日間の時間経過ステージステージ3~5; 1日目、2及び3上で実行アブレーションは、花芽の中心を覆うから萼片を防止するのに不十分でした。 （E1 - E2）背軸と向軸がく片（E1）を手動で除去した後の個々の花のつぼみ、およびすべてのがく片の（E2）;白い矢印は、残りの萼片を示します。白のアスタリスクは、がく片の除去から生じる傷跡を示しています。 DR5-3xVenusN7レポーター18（緑色）を発現する（F）ステージ7 apetala1-1花 ;原形質膜は、FM4-64（赤）で染色しました。青い矢印は、がく片を交換し、花芽をカバーしていない葉のような構造を示しています。 （G）DORNROSCHEN-LIKE 7（緑）、SUPERMAN（赤色）のために金星レポーターする蛍光GFPレポーターを発現する第4段階花芽及びCLAVATA3 19（シアン）用のDsRedレポーターを、細胞壁は、ヨウ化プロピジウム（灰色）で染色しました。 D：1日; ST：舞台。スケールバー=25μmの。スケールは、C1-C5およびD1-D5で、B1、B2及びB4に同一です。この図は、基準14から変更しました。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55156/55156fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

ライブ共焦点イメージングは​​、開発を研究するための強力なツールと生物学者を提供します。ここでは、 シロイヌナズナの花の開発のライブ共焦点イメージングのための詳細なプロトコルを提示します。

共焦点イメージングは​​、シロイヌナズナの花の開発のライブ

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

live-confocal-imaging-of-developing-arabidopsis-flowers

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.7K ビュー.  California Institute of Technology. ライブ共焦点イメージングは​​、開発を研究するための強力なツールと生物学者を提供します。ここでは、 シロイヌナズナの花の開発のライブ共焦点イメージングのための詳細なプロトコルを提示します。 

ビデオ: Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;蛹アイ

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

発生生物学

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily conserved structures that compose it are assembled remains under investigation. Their size and physiological features often constrain manipulation and imaging applications. The culture of immortalized cell lines is widely used, but it can only replicate the early steps of differentiation.
Here, we describe a protocol that enables easy genetic manipulation of myofibers originating from primary mouse myoblasts. After one week of differentiation, the myofibers display contractility, aligned sarcomeres and triads, as well as peripheral nuclei. The entire differentiation process can be followed by live imaging or immunofluorescence. This system combines the advantages of the existing ex vivo and in vitro protocols. The possibility of easy and efficient transfection as well as the ease of access to all differentiation stages broadens the potential applications. Myofibers can subsequently be used not only to address relevant developmental and cell biology questions, but also to reproduce muscle disease phenotypes for clinical applications.

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

ライブイメージングのための成熟した筋線維のin vitro分化に

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

根および胚軸発達の長期共焦点イメージングのための単純なチャンバー

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

長期のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アイディスク

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

体外受精卵の Live 細胞イメージング偏光とシロイヌナズナの胚パターン形成の胚珠培養

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

マウス二次口蓋融合のライブイメージング

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

細胞分裂時の染色体分配の生きているセルイメージ投射

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

別の植物種から茎頂の共焦点のライブ イメージング

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

ショウジョウバエ胚における筋収縮のライブイメージングと解析

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Brainbowとタイムラプス共焦点イメージングを用いた生きているゼブラフィッシュの発達脳の可視化

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

共焦点イメージングは​​、シロイヌナズナの花の開発のライブ

共焦点イメージングは、シロイヌナズナの花の開発のライブ