この研究は、国立衛生研究所によって支えられた (d. k. に GM079351 RO1)。ドロテア Godt に彼女の元のプロトコルに基づいて蛹卵巣の解剖に彼女の有用なアドバイスありがちましょう。我々 はまた、彼女の援助と原稿のコメントをエイミー Reilein を感謝します。

1. 仔
<ol><li>10 の男性と 15 女性ショウジョウバエ成虫酵母を添加した通常豊かなフライ食品の瓶で目的遺伝子の約を組み合わせます。バイアルを過密を避けるため、もはや 2-4 h14以上の卵を産む雌成虫の交尾を許可します。</li>
	<li>はえの食糧と異なるバイアルに対して開くバイアルをタップして、大人をバイアルから新しい瓶に転送します。3-4 日間室温で幼虫に成長する卵を許可します。</li>
</ol>2. 女性の幼虫を選択します。
<ol><li>しっとり細かいブラシを使用すると、柔らかい毛、放浪の 3 齢幼虫をバイアルからもリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) × 1 であふれんばかりに満たされたガラスに転送するバイアルの壁に沿ってブラシで回転運動を作る。1x PBS で満たされた一つの井戸にそれらを転送することによって幼虫を食べ物のかすを洗浄します。</li>
	<li>鉗子を使用して男性と女性の幼虫を区切ります。その前方15から下脂肪体に体の約 3 分の 2 の側面に埋め込まれた大きくて丸いと半透明の精巣のペア、オス幼虫を識別します。メス幼虫は平均より大きく、男性よりも少ない半透明より困難に検出は、はるかに小さい生殖腺を持っています。</li>
	<li>オス幼虫に対する女性の幼虫を収集するを選択します。井戸から少なくとも 10 女性を収集します。1x PBS でいっぱいも別に女性の幼虫を配置します。</li>
	<li>新鮮なはえの食糧の新しいガラスびんに優しく女性の幼虫を転送する使用鉗子は、酵母を添加しました。</li>
	<li>Pupariation16を容易にするために暗い場所に女性の幼虫をバイアルを配置します。一日中、pupariation の幼虫を監視します。各幼虫は固定化し、イラガ前蛹に発展、バイアルに対してイラガ前蛹をサークル、最初、イラガ前蛹になるとおおよその時間を記録します。前気門の前突および蛹殻形成17のタイミングで前蛹を識別します。(蛹殻形成過程、APF の後の時間で測定) 希望の時間ポイントを開発する前蛹を許可します。 注: 約 10 h 間隔内で蛹殻形成過程を受ける動物、イラガ前蛹考えられます。内部の脱皮が行われた後、蛹期は蛹殻形成後約 12 時間を開始します。</li>
</ol>3. 抗体の汚損のため蛹の準備
<ol><li>
蛹の脂肪体をクリアするため、後の手順で使用する細いガラス ピペットを形成します。
	<ol>
<li>ブンゼン バーナーでガラス パスツール ピペット先端を溶かします。ガラスが溶け、薄く先端を形成するのにピペットの残りの部分から水平方向に先端をプルするのに鉗子を使用します。</li>
		<li>冷却した後、きちんとした円形の開口部を形成するピペット先端部の小さな部分を破る。電球をピペットのもう一方の端に取り付けます。</li>
		<li>1x PBS でピペットをロードします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>バイアルの壁に接着しているの蛹を収穫するには、蛹とバイアル間接触の地帯に沿って水の小滴を適用します。タンパク質に 1-2 分を待って接着剤を優しくしっとり細かいブラシで壁に蛹を持ち上げる前に解散。1x PBS でいっぱいよくガラスに蛹を転送します。単一の井戸井戸の混雑を避けるため蛹あたりを捧げます。</li>
	<li>1 組の鉗子で蛹の後端をつかんで、蛹の頭が見える位置まで慎重に別のペアに蛹のケースの前方の部分を引き裂きます。</li>
	<li>鉗子で蛹の頭の前方の先端をグリップ、ケース蛹から蛹を軽く引いてください。 注: 脂肪体の部分はこのプロセス中にこぼれることがあります。</li>
	<li>分離し、腹部の袋だけが残るまで後部半分から蛹の前半分を破棄します。</li>
	<li>
腹部の袋から脂肪細胞を抽出します。
	<ol>
<li>別の手の 1x PBS でいっぱい細いガラス ピペットを押しながら片方の手でピンセットで井戸の底に対して腹部の袋を把握します。</li>
		<li>蛹卵巣を取り巻く脂肪体細胞を洗い流すため腹部に袋とゆっくりピペット 1 × PBS の開幕に向けて細いピペット先端部を目指してください。 注: 卵巣は、腹部の袋の中に残るべきである小さい、半透明、紋、長方形の構造体のペアです。</li>
		<li>体の脂肪細胞の脂肪体の少なくとも 3 分の 2 がなくなるまで、または卵巣が腹部の袋の口の近くに表示されるまでを洗い流します。非常にゆっくりと、この手順を実行することが重要だ偶然腹部の卵巣を洗うようにします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>脂肪体細胞洗浄中にうち卵巣が残っているかどうかをチェックする井戸を調べます。卵巣が井戸の中に表示されていない場合は、腹部に残っている必要があります。卵巣が出てきた、よく新しい蛹を配置し、この手順を繰り返します。</li>
	<li>固定バッファー (1 x PBS, 4% パラホルムアルデヒド) でいっぱいクリア coverglass 室に腹部を転送し、上に蓋を置き。染色と実装プロセスに耐えられる卵巣に十分な数を確保するため必要以上より卵巣を解剖。 注意: 固定バッファーには、有毒であるパラホルムアルデヒドが含まれています。適切な保護手袋、保護メガネなどを着用してください。</li>
</ol>4. 免疫組織化学
<ol><li>染色のプロセスを通して卵巣が抗体溶解液に完全に没頭していることを確保するためカバー ガラス井戸の底に任意浮動卵巣優しくプッシュする鉗子を使用します。</li>
	<li>場所は、Nutator の平らな表面に両面テープのストリップをテープの粘着面で、カバーグラスチェンバーを置きます。</li>
	<li>室温で 15 分間ステップ 3.7 から固定バッファーで卵巣を孵化させなさい。</li>
	<li>卵巣をすすぎ三回 1 %1 × PBS でトリトン X-100 5、10、および 45 分 (合計で 1 h)、それぞれ、徹底的な透過を許可します。</li>
	<li>0.5 %1 × PBS で 10% ヤギ血清で卵巣をブロック 30 分トリトン X-100。</li>
	<li>600 で卵巣を一晩インキュベート 4 ° C でトリトン X-100 0.5 %1 × PBS で適切な濃度に希釈して好みの一次抗体の μ L</li>
	<li>0.5 %1 × PBS で 5 分間 3 回卵巣をすすぎトリトン X-100。</li>
	<li>室温でトリトン X-100 0.5 %1 × PBS で適切な濃度に希釈して好みの二次抗体の 600 μ L で 2 h は、卵巣を孵化させなさい。</li>
	<li>1 × PBS 0.5% トリトン X-100 と 1x PBS で 5 分に 1 回で 5 分間 2 回卵巣をすすいでください。</li>
</ol>5. 解剖と蛹卵巣をマウント
<ol><li>顕微鏡のスライドに 1 × PBS の小滴を配置します。腹部の袋に、ガラスも、カバーグラスチェンバーから転送する使用鉗子は 1x PBS でいっぱい。単一の井戸井戸の混雑を避けるため蛹あたりを捧げます。</li>
	<li>鉗子で腹部の袋と、残りの脂肪体を引き裂きます。 注: 小さな、半透明、紋、長方形の構造体のペアは、卵巣は井戸の中見えるはずです。すべての脂肪体は徹底的に引き裂かれたことを確認することが重要だ、卵巣が脂肪体囲まれてしばしば密接離れて。</li>
	<li>1x PBS 顕微鏡のスライド把持鉗子の先端間の卵巣のセンターでのドロップに井戸から卵巣を転送します。非常に失うまたは転送中にそれらを破壊するそうなので卵巣を圧迫することがなくしっかりしたグリップを使用することが重要です。解決策が時間をかけて乾くときのスライドに 1 × PBS を数滴を追加します。</li>
	<li>一度、すべての卵巣は解剖され顕微鏡スライド、22 mm × 22 mm coverslip と卵巣の上にそっと coverslip の場所に取り付け中のピペット 40 μ に転送します。スライド画像の前に一晩を乾燥しなさい</li>
</ol>

<ol>
	<li>Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Stem+Cell+Niches:+A+Decade+of+Discovery+Suggests+a+United+View+of+Stem+Cell+Regulation.">Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation.</a> Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).</li><li>Kirilly, D., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+ovary:+an+active+stem+cell+community.">The Drosophila ovary: an active stem cell community.</a> Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).</li><li>Dansereau, D. 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(1), e52 (2006).</li></ol>

著者の利害の衝突を宣言するあります。

このプロトコルの最も重要かつ困難なステップには、固定する前に蛹卵巣の準備が含まれます。抗体と、卵巣、小さくて蛹腹部内脂肪体細胞によって埋められること十分に汚れることを確認、鉗子、腹部の袋に大きな開口部を引き裂くだけでなくが、また妨げる脂肪体細胞を抽出することが重要です、抗体からの卵巣。この手順が正常に実行が必要です腹部の袋から脂肪体細胞を洗いながらパスツール ピペットで移しなさい電球の微妙な圧力のアプリケーション (例えば1-2 脂肪体細胞はこの手順中の 1 秒あたりの腹部におきます)。穏やかな力を使用する失敗可能性が卵巣では流出の腹部からとグラスにも。自分で卵巣は、半透明、小さくて鉗子で把握することは困難であるために、汚損プロシージャ全体で腹部の袋内にある必要があります。したがって、卵巣は、固定する前に準備段階腹部から出てくる場合、取得、汚れ、およびプロトコル間の分離の形式でそれらをマウントすることは非常に困難でしょう。
脂質小滴の主に、脂肪細胞がトリグリセリド貯蔵細胞小器官キイロショウジョウバエ19,20を含む昆虫で一般的に見られます。このプロトコルが卵巣で両方のきちんと残った脂肪からできるだけ多くの脂質を抽出する最初の 3 つの PBS の洗口液で比較的高いトリトン X-100 濃度を利用していくつかの脂肪体細胞は、固定で蛹の腹部に残るので卵巣を取り巻く組織。最初の 3 つの洗口液の細胞の整合性を維持しながら脂質を最大限に抽出によく作品染色では図 31% で 1 x PBS を使用中にトリトン X-100 明るいファシクリン III 細胞膜蛋白抗体によって示されるように膜。
脂肪体を展開すると、2 番目の最も重要なステップ固定と抗体の汚損を通して腹部の袋内に卵巣が残っているかどうかを確認することです。染色中に蛹腹部の明確視認性微量遠心チューブではなく、明確なチェンバード coverglass 内にそれらを配置することをお勧めします。袋に腹部の組織が完全に抗体溶液で包まれているので、チャンバーの底に腹部の袋を優しくプッシュするのに鉗子を使用します。
最後に、細心の注意実装プロセス中に腹部の袋から顕微鏡スライドに卵巣を転送する必要があります。卵巣は、小さな鉗子でつまんでなく把握することは困難、スライドにそれらを転送する最良の方法は卵巣の中心をしっかりとつかんでです。彼らは、スライド上に配置構造的にそのまま残ります。卵巣を失うことを避けるために顕微鏡のスライドの上に直接腹部から卵巣を解剖することができますがこれはスライドに取り付け中の過剰な量につながる可能性があります、実装プロセスが複雑になる可能性があります。
このプロトコルの制限は、全体の切離プロセスがかかることがあります、各ステップを正常に完了するために必要な器用さをよく染色卵巣と潜在的に低収量の時間の量を含みます。蛹卵巣は、広範な脂肪体抽出を必要とするため固定のため 1 つの蛹を準備するかかることがありますどこでも 10 から 20 分。さらに、ように卵巣の十分な数に耐える全体汚損プロシージャ、実験に必要なよりもより多くの蛹を解剖するが最善です。これは、多量の時間可能性があります固定ステップの前にも蛹の準備に単に使われることを意味します。
蛹卵巣の解剖は、主に幼虫14とアダルト21卵巣の解剖のプロトコルから異なります。蛹ケース内卵巣の箱詰め特有の課題がこのプロトコルで使用するツールによって満たされています。これらのメソッドがあります Fsc と護衛、タイミングを決定するリネージュ トレース実験に適用セルは時間をかけて蛹卵巣で指定されます。昆虫の細胞培養媒体を含むこのプロトコルの修正版は、ライブ イメージング解析前のヴィヴォ蛹卵巣を解剖する可能性も使用できます。

ショウジョウバエの卵巣を用いた幹細胞研究は、幹細胞ニッチ1,2,3,4の最初のドキュメンテーションから広く展開しています。リネージュ トレース遺伝的ツール、解剖がよく幹細胞を研究に使用されているショウジョウバエ卵巣の開発と幹細胞維持、増殖、および幹細胞ニッチの運命を制御するシグナルします。これらのシグナル伝達経路の知識は、異常な幹細胞活動5,6,7から由来する癌の潜在的な原因への洞察力をもたらす可能性があります。また、最近、卵胞幹細胞 (Fsc)、として知られているショウジョウバエ卵巣の体性幹細胞、彼らの組織の8の多くの側面で哺乳類の腸管幹細胞のように強く示されています。このため、ショウジョウバエ卵巣が幹細胞の挙動を研究するための非常に有用なモデル システムです。
幼虫及び成虫の卵巣はそれぞれ初期の幹細胞の開発とニッチで最終的な幹細胞組織への手がかりを提供、蛹卵巣は生殖細胞と体細胞で再編成、彼らのアイデンティティを確立中間構造9,10. 分化と空間構成に関する質問のままいくつかの研究は、蛹卵巣10、11,12,13組織開発の側面を検討しているが蛹の発育中の卵巣細胞型。特に、Fsc の仕様は、この期間中に発生します。このプロトコルの概要を解剖の目的の時点で蛹卵巣染色法-蛹卵巣における大人の段階に幼虫から詳細を分析時間コース実験で使用できるテクニック。
小型、半透明、蛹卵巣蛹腹部内の到達不能にする、このプロトコルは抗体アクセスを妨げる腹部脂肪体組織を除去するカスタムメイドの薄い先端パスツール ピペットなどのツールを利用して、卵巣。蛹の"Nutator"の卵巣を揺動の穏やかなプラットフォームを提供しています高い視認性を汚す抗体中に使用される明確なチェンバード coverglassMaimon、ギルボア14による幼虫卵巣の解剖のプロトコルに基づいて、トリトン X-100 の比較的高い濃度で採用されている染色の手順の最初の手順に細胞膜透過と抗体アクセスを最大化する、卵巣細胞。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps, biology</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>155383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-10A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM 700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Zen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 Depression Glass Spot Plates</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet bulb</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 22 mm glass coverslips No 1</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutator</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine brush #0, #3-#5</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipetman Starter Kit</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>F167300</td>
			<td>Contains p20, p200, p1000 pipettors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9624</td>
			<td>Dilute to 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>5000121</td>
			<td>Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000)</td>
			<td>Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore)</td>
			<td></td>
			<td>Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum)</td>
			<td>Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td>Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly vials</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>V9406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Balls, For Wide Vials</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>51-102W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast, Bakers Dried Active</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>101400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly food</td>
			<td>Produced in laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Mixture of water, brewer&#39;s yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2)</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and staining of drosophila pupal ovaries

大人のショウジョウバエ卵巣とは異なり蛹卵巣は比較的アクセスし、彼らの小型のため確認することは困難、サイズ、半透明、蛹のケース内で被覆。蛹卵巣の解剖の課題はまた蛹内の物理的な場所にある: 卵巣蛹腹部内脂肪体細胞に囲まれているし、これらの脂肪細胞は適切な抗体の汚損のため許可を削除必要があります。これらの課題を克服するためには、このプロトコルは、蛹の腹部からの脂肪体細胞を抽出するためのカスタマイズされたパスツール pipets を利用しています。また、蛹の可視性を改善するために染色のプロセス中に、カバーグラスチェンバーを遠心管の代わりに使用します。ただし、これらとこのプロトコルで使用するツールの他の利点にもかかわらず、これらの技術の実行が成功は、まだ蛹卵巣のサイズが小さいため練習のいくつかの日を伴うことがあります。このプロトコルに記載されているテクニックは、蛹の開発のさまざまな段階で卵巣を解析時間コース実験に適用でした。

この手順が正常に実行明確な抗体の汚損構造とショウジョウバエ蛹卵巣の細胞組織を明らかにする必要があります。このプロトコルで説明されている免疫組織化学は、幼生及び成体卵巣における一般染色の種類の細胞を識別するために使用できます。派生した蛹の茎の細胞群細胞18 (白ファシクリン III で説明します)、図 3に示します。蛹卵巣の細胞の組織を強調表示、に加えて (リン酸化ヒストン H3 染色図 3緑色で表示) などの細胞増殖に固有を汚す抗体を幹細胞と他の細胞分裂パターンの研究に使用できます。有糸分裂アクティブ セルの種類。共焦点顕微鏡の下で検査するとき蛍光抗体信号が弱ければ、にくい卵巣が蛹腹部の体脂肪が不足している抽出のための抗体を十分に公開されていなかったこと。別の可能性は、染色中に折りたたまれている蛹袋開くことかもしれません。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56779/56779fig1.jpg"> 図 1: 男性女性の幼虫とのサイド ・ バイ ・ サイド比較します。(A)半透明で、長方形の精巣のペアによって識別される PBS 溶液中のオス幼虫の前方端からダウン約 3 分の 2 をあります。大規模な半透明の精巣の有無によって識別される PBS 溶液(B)女性の幼虫。スケール バー = 2 mm.<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56779/56779fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56779/56779fig2.jpg"> 図 2: 免疫後蛹卵巣の解剖します。(A)蛹する横紋筋性、半透明の卵巣 (赤丸) 免疫組織化学染色時に腹部の袋から削除されたのペアのイメージ。蛹卵巣が切除した APF 約 48 時間。手順 3.6 では抽出されなかった残りの脂肪体細胞 (黒矢印) は、PBS 溶液中に分散しています。(B) PBS 溶液中の単一蛹卵巣の画像は、約 48 時間 APF を解剖しました。スケール バー = 100 μ m.<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56779/56779fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56779/56779fig3.jpg"> 図 3: ステンド グラスの野生型蛹卵巣解剖 48 時間 APF 。共焦点の顕微鏡を使用して画像を取得しました。Wnt 経路記者、Fz3 RFP8 (赤) は、前葉体細胞で表されます。抗体は、蛹の茎のファシクリン III (白) の輪郭の細胞に送られます。核は、DAPI (青) と counterstained いた。リン酸化ヒストン H3 の染色 (緑) と、有糸分裂を経るセルが強調表示されます。斜めの白い線は、元の画像のエッジを示します。スケール バー = 20 μ m.<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56779/56779fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

ショウジョウバエ卵巣は、幹細胞ニッチの開発を研究するためのエクセレント モデル システムです。幼虫及び成虫の卵巣を解剖するための方法を公開されている、蛹卵巣解剖詳しく公開されていない別のテクニックが必要です。ここでは、解離性、染色、および蛹卵巣をマウントするためのプロトコルを概説します。

郭清およびショウジョウバエ蛹卵巣の汚損

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

9.2K ビュー.  Columbia University. ショウジョウバエ卵巣は、幹細胞ニッチの開発を研究するためのエクセレント モデル システムです。幼虫及び成虫の卵巣を解剖するための方法を公開されている、蛹卵巣解剖詳しく公開されていない別のテクニックが必要です。ここでは、解離性、染色、および蛹卵巣をマウントするためのプロトコルを概説します。

ビデオ: Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;蛹アイ

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

発生生物学

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

文化と共培養マウスの卵巣と卵胞

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex determination system, where several genes distributed throughout the genome collectively determine the sex identities of individual fish. Currently, the genes involved in regulating gonad development and how they work remain elusive. Normally, isolating gonadal tissue is the first step to examine the sex developmental processes. Here, we present a procedure to isolate gonadal tissue from 17 dpf (days post fertilization) and 25 dpf zebrafish larvae. The isolated gonadal tissue may be subsequently examined by morphology and gene expression profiling.

Here, we present a protocol for isolating gonadal tissue of larval zebrafish, which will facilitate investigations of zebrafish sex differentiation and maintenance.

幼生ゼブラフィッシュ性腺組織の解剖

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

マウス胎児腎臓の解剖および培養

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells named wing imaginal discs formed during embryonic development. In the larval stages the imaginal discs grow, increasing its number of cells and forming monolayered epithelial&#160;structures. Inside the pupal case, the imaginal discs bud out and fold into bilayers along a line that becomes the future margin of the wing. During this process, the longitudinal primodia veins originate vein cells on the prospective dorsal and ventral surfaces of the wing. During the pupal stage the stripes of vein cells of each surface communicate in order to generate tight tubes; at the same time, the cross-veins begin their formation.
With the help of appropriate molecular markers, it is possible to identify the major elements composing the wing during its development. For this reason, the ability to accurately detect transcripts or proteins in this structure is critical for studying their abundance and localization related to the development process of the wing.
The procedure described here focuses on manipulating pupal wings, providing detailed instructions on how to dissect the wing during the pupal stage. The dissection of pupal tissue is more difficult to perform than their counterparts in third instar larvae. This is why this approach was developed, to obtain rapid and efficient high quality samples. Details of how to immunostain and mount these wing samples, to allow the visualization of proteins or cell components, are provided in the protocol. With little expertise it is possible to collect 8-10 high quality pupal wings in a short amount of time.

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

The ability to accurately detect transcripts or proteins in Drosophila tissues is critical for studying their abundance and localization related to the development process. Here is the description of a straightforward procedure to dissect pupal wings. These wings can be used as samples in several techniques (immunohistochemistry, PCR assay, etc.).

Immunodetections または PCR の試金に適したショウジョウバエの蛹の翼を解剖する迅速かつ効率的な方法

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

全体のマウントの蛍光抗体法と培養マウス卵巣の卵胞の定量化

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

免疫組織化学、西部の分析、および RNA の隔離のためのショウジョウバエ蛹網膜の解剖

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

解凍、養殖、ショウジョウバエ細胞をトウキョウ

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.