Este trabalho foi apoiado pelas concessões do Nacional Natural Science Foundation da China (31201086, 31470759 e 31671219) e a Fundação de ciência Natural de Shanghai (12ZR1436900).

camundongos C57BL/6 são criados em condições específicas isentos de organismos patogénicos. Todos os métodos experimentais animais estejam em conformidade com as diretrizes aprovadas pelo Comitê de ética na Universidade de medicina militar de segundo e cuidado Animal.
 1. dissecação de pós-natal desenvolvendo hipófise <ol><li>realizar anestesia: Coloque gelo picado para induzir hipotermia neonatais ratos (P0 - P5). Para os ratos mais de 5 dias de idade, injete intraperitonealmente uretano 5% (30 µ l/g de peso corporal) para induzir anestesia. Avalie respostas para toe cauda pitadas. Prossiga somente depois que o mouse não está respondendo aos estímulos nocivos.</li>
	<li>Segura o mouse na posição supina (deitado na parte de trás com face para cima) gravando suavemente as dianteiras e composto para uma superfície de trabalho que é capaz de ser fixado (ou seja, isopor) dentro de uma coifa química.</li>
	<li>Executar a perfusão transcardial.
	<ol><li>Cortar a caixa torácica de rato com uma tesoura cirúrgica para expor o coração (e outros órgãos torácicos).</li>
		<li>Segura o coração a bater com fórceps rombudo e insira uma agulha 26G (0,45 mm) no ventrículo esquerdo. A agulha está ligada a uma seringa de 10 mL, preenchida com solução salina heparinizada tamponada de fosfato (PBS; suplementado com nitrito de sódio 5 mg/mL e 10 U/mL heparina, pH 7,4, aquecer a 37 ° C antes do uso). Imediatamente cortar o átrio direito com uma tesoura bem e começam a perfundir o corpo com o PBS quente até o fluido sair do átrio direito é claro. 
		Nota: Aproximado de 5-10 mL de PBS é necessária para os ratos Neonatais e 10-20 mL de solução Isotónica de ratos adultos.</li>
		<li>Manter a agulha no lugar e mudar para outra seringa preenchida com paraformaldeído 4% (PFA; pH 7,4). Perfundir 10 mL e 20 mL de fixador para neonatal e P21 mouse, respectivamente. 
		Atenção: O PFA é tóxico. Pode causar irritações respiratórias, pele e lesões oculares. Use luvas e trabalhar sob uma capa química.</li>
	</ol></li> <li>Decapitar o mouse PFA-fixo e abriram o osso do crânio com uma tesoura.
	<ol><li>, Levante suavemente o rombencéfalo da base do crânio com uma pequena pinça. Ao primeiro sinal da Sela túrcica, paragem de levantamento, mas mantenha o rombencéfalo, cortar a haste hipofisária e fibras nervosas conectando à base do cérebro com uma tesoura bem. Esta etapa é fundamental para garantir que a hipófise não é levantada longe com o cérebro.</li>
		<li>, Então, continuar levantando o cérebro e remover o cérebro inteiro para expor a glândula pituitária totalmente. Cortar a região toda sella, incluindo a glândula pituitária, laterais nervos trigêmeo e as por baixo do osso esfenoide com tesoura (aproximadamente 3 x 5 mm 2).</li>
	</ol></li> <li>Colocar o tecido dissecado em um prato de 35mm ou um bem de uma placa de 6 contendo 2 mL frio 4% PFA (pH 7,4). Fixar o tecido a 4 ° C por 40 min para P0 - P7 pituitaries, 1h para P14 pituitaries, 1,5 h para P21 - P28 pituitaries e 3h para adultos pituitaries.</li>
	<li>Outras dissociação da hipófise <ol><li>lava o tecido fixo com 10 mL de PBS, 5 mudanças, 15 min cada. A glândula pituitária neonatal juntamente com seus tecidos circundantes e o abaixo do osso esfenoide podem ser processados diretamente à desidratação. No entanto, as glândulas pituitárias de ratos mais de 5 dias deve ser dissociadas mais sob um microscópio estéreo.</li>
		<li>Colocar o tecido fixo em um prato de 35 mm, contendo 1 mL de PBS. Para P5 - P14 pituitaries, retire as membranas conectivos entre os nervos e os ossos com pinça fina e tesoura e isolar cuidadosamente a glândula pituitária, juntamente com nervos laterais do trigêmeo como um todo, mas deixando a Sela túrcica. A glândula isolada e os nervos estão ligados por membranas conjuntivo com uma &#34; H &#34;-como a aparência ( figura 1B).</li>
		Pituitaries de <li>para P21 e adulto, remova os nervos e membranas conectivos ao redor a hipófise e livre a glândula os tecidos circundantes. O tecido da hipófise, enrole com papel de tecido de limpeza de lentes e colocá-lo dentro de um estojo de encastre. 
		Nota: A hipófise minúscula de embrulho com papel de tecido de limpeza de lentes ajuda a evitar qualquer possível perda de espécimes e preservar a integridade do tecido o seguinte procedimento de incorporação de parafina. Pode não ser necessário embrulhar a hipófise se é processado em uma pequena garrafa no procedimento cryo-incorporação.</li>
	</ol></li></ol> 2. Incorporação e Set Sectioning de parafina <ol><li>desidratar os espécimes em incorporação cassettes com soluções de etanol 50%, 65%, 75% e 95% por 15 min cada. Posteriormente desidrate com 3 alterações de etanol puro, 3 min para P0 - P4 glândulas, 4 min para P5 - P14 glândulas e 5 min cada para P21 e glândulas mais velhas. Claro com xileno, 3 mudanças, 3 min para P0 - P4 glândulas, 4 min para P5 - P14 glândulas e 5 min cada para P21 e glândulas mais velhas. Infiltrar-se com cera de parafina derretida, 3 alterações, 7 min cada para P0 - P4 glândulas, e 8 min duas vezes seguido por 6 min uma vez para P5 e glândulas mais velhas. 
	Nota: Os parâmetros ideais para processamento do tecido podem ser empiricamente ajustados. Para obter as seções de alta qualidade, desidratação insuficiente ou superior deve ser evitada. O mesmo é verdadeiro para limpar o tecido usando xileno.</li>
	<li>Orientação ao incorporar <ol><li>sobre um tecido de incorporar o sistema do console, retirar a amostra da gaveta e colocá-lo em um molde base half-filled com cera de parafina derretida. Orientação adequada da glândula pituitária de encastre é essencial para satisfazer secções coronais.</li>
		<li>Para P21 e adulto as glândulas pituitárias, posicione a glândula pituitária, com seu eixo curto perpendicular à superfície inferior de um molde base (o plano de corte). Use esfenoide ossos e nervos trigêmeo como pontos de referência anatômicos para P0 - P4 e P5 - P14 pituitaries, respectivamente. Orientar os espécimes com seus nervos trigêmeo ou lâmina transversal dos ossos esfenoide perpendiculares à superfície inferior de um molde base.</li>
		<li>Pressione cuidadosamente o tecido na posição desejada com a pinça bem aquecida até que a cera se torne semi-sólido em uma placa de resfriamento. Encha o molde com cera de parafina derretida. Permitir que o bloco de parafina esfriar até que a cera é totalmente solidificada. 
		Nota: A hipófise no dia embrionário 18,5 (E18.5) pode ser tratada da mesma forma como a hipófise neonatal. Mas os pituitaries (Rathke &#39; malotes s) mais jovem que E16.5 deve ser encaixado com a cabeça inteira e orientada com o eixo sagital (da boca ao occipício) perpendicular à superfície inferior de um molde base.</li>
	</ol></li> <li>Chill o bloco de parafina a-20 ° C por 10-20 min e depois cortá-la em finas fatias (4 µm de espessura é preferencial) com um micrótomo. Para obter secções coronais satisfatórias, ajuste a posição dos blocos de parafina durante o corte. Montar as fatias de tecido em lâminas de vidro revestido polylysine para evitar o desprendimento de fatias nos procedimentos a seguir. 
	Nota: Alternativamente, as amostras podem ser desidratadas em 15%, 30% (P/V) de soluções de sacarose (em PBS) a 4 ° C até que eles descem para o fundo, incorporado em crio-incorporação composto usando o mesmo método de orientação e rapidamente congelado em gelo seco. Os blocos de tecido congelado corte em fatias de 8-10 µm usando um criostato. A morfologia da cryo-seções, no entanto, é muitas vezes inferior a secções de parafina.</li>
</ol> 3. H &#38; E coloração e imunofluorescência rotulagem <ol><li>quente os slides em um calor bloqueiam a 55 ° C e dewax com xilol, 2 trocas, 4 min. Desidrate as amostras com o dobro de etanol a 95% e 75% de etanol duas vezes, 3 min cada. Lave os slides com água destilada por 5 min num agitador.</li>
	<li>Para H &#38; E mancha, mancha as seções na solução de alúmen hematoxilina por 6 min, enxaguar em runnágua da torneira ing por 2 min, diferenciar-se com água de amônia de 0,2% para 45 s e re-enxaguar em água corrente por 2 min. Então desidrata-se as seções com etanol a 95% por 1 min e mancha com eosina por 2 min. sequencialmente desidratam, limpar e montagem.</li>
	<li>Imunofluorescência rotulagem <ol><li>trata as seções com metanol contendo 3% H 2 O 2 e 0,01% NaN 3 por 20 min em temperatura ambiente para inactivar peroxidases endógenas. Recuperar a antígenos por ebulição seções no buffer de recuperação (EDTA 1 mM e 1 mM Tris-HCl, pH 7,4) em uma panela de pressão por 2 min. Incubar as secções com tampão de bloqueio (5% de soro de cabra em PBS) por 30 min a 37 ° C.</li>
		<li>Incubar seções com anticorpo anti-hormônio (GH) (1:2, 000) ou anticorpo proteína ácida fibrilar anti-glial (GFAP) (1:2, 000), diluídas em tampão de bloqueio durante a noite a 4 ° C.</li>
		<li>Seções com anticorpo secundário (cabra anti-coelho IgG-HRP, 1: 300 em tampão de bloqueio), incubar durante 35 minutos a 37 ° C.</li>
		<li>Amplificar os sinais usando Biotinyl Tyramide (01:50 em solução salina tamponada de Tris contendo 0,3% H 2 O 2) durante 15 minutos à temperatura ambiente e Visualizar com Streptavidin-Alexa594 ou 488 (1: 300 no bloqueio de buffer, 30 min, a 37 ° C).</li>
		<li>Counterstain os núcleos com DAPI (50 mg/L em PBS) durante 5 min à temperatura ambiente. 
		Nota: Pode não ser necessário amplificar o sinal usando o sistema de amplificação de sinal de Tyramide (TSA). Alternativamente, um anticorpo secundário conjugado fluorescência pode ser usado para visualizar o sinal.</li>
	</ol></li> <li>Adquirir imagens usando um microscópio de fluorescência equipado com DAPI, Texas Red e conjuntos de filtros FITC, × 4/0,13 × 40/0.75 objectivos e câmera de 5.0 megapixel. Use o 360, 488 e 594 nm laser comprimentos de onda para imagiologia DAPI, Alexa 488 - e seções manchadas de 594 Alexa, respectivamente. Otimizar a potência do laser (0.8 foi usado geralmente) e tempo de exposição para os níveis desejados para cada canal. Capturar a imagem sob o controle do software de aquisição de imagem e sobrepor as imagens de fluorescência posteriormente usando o software de processamento de imagem.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+face+of+the+anterior+pituitary.">Hidden face of the anterior pituitary.</a> Trends Endocrinol Metab. 13 (7), 304-309 (2002).</li><li>Haedo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pituitary+function+by+cytokines.">Regulation of pituitary function by cytokines.</a> Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).</li><li>Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. 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Os autores não têm nada para divulgar.

Para o desenvolvimento de murino pituitaries, tem sido difícil tecnicamente obter as seções coronais adequadas, devido a suas características de pequenas e frágil e características anatômicas únicas6,8. Alguns grupos de pesquisa assim escolhi meados-sagital seções para analisar a morfologia do embrionário e neonatal na hipófise11,12. Embora a meados-sagital da hipófise também é capaz de mostrar anterior, intermediária e posteriores lobos em uma única fatia, seção coronal é altamente preferida como pode mostrar vista máxima para estes três lobos. Em particular, para estudos de quantificação, tais como a determinação do volume e área da glândula pituitária e contando o número de apoptose e proliferação de células, secções coronais são superiores às secções médio-sagitais em termos de seu representante. Aqui, apresentamos um método útil para dissecar as glândulas pituitárias e preparar na hipófise coronais seções de desenvolvimento de ratos.
Para evitar danificar as glândulas pituitária durante o processo, várias técnicas têm sido utilizadas neste protocolo. Primeiro, os ratos são fixos por perfusão transcardial de formaldeído antes da dissecação. Este fixador não só ajuda a preservar a arquitetura do órgão, mas também para remover células vermelhas do sangue que muitas vezes resultam em auto fluorescência13. Em segundo lugar, a região inteira sella é dissecada para evitar tocar a glândula pituitária com qualquer ferramenta duro-cirúrgica. Os tecidos circundantes ajudam a manter a glândula pituitária na sua posição original e também servir como pontos de referência para a incorporação de orientação. Com estes métodos empregados, menores pós-natal pituitaries de animais mais jovens podem ser dissecados enquanto reduzindo a probabilidade de danos indesejáveis.
O procedimento de dissecação neste protocolo é igualmente aplicável para isolar murino pituitária que não tenha sido previamente fixada por perfusão. Nesse caso, mais cautela deve ser tomada para evitar danos indesejáveis e a glândula também deve ser dissecada tão rapidamente quanto possível.
Desde pituitaries murino em desenvolvimento são muito pequenos em tamanho, tem sido muito difícil para orientá-los adequadamente ao incorporar. Este protocolo usa os nervos trigêmeo ou ossos esfenoide como Marcos, tornando as etapas de orientação muito mais fácil. Pituitaries corretamente orientados são essenciais para conseguir satisfazer secções coronais.
Em resumo, nós fornecemos uma dissecação da hipófise melhorada e incorporação protocolo, que é apropriado para ratos em diferentes estágios de desenvolvimento. Aplicação destes procedimentos pode obter satisfação secções coronais de murino glândulas pituitária deve ser usado para análise de rotina histologia, imuno-histoquímica, hibridação in situ e no desenvolvimento da pesquisa14.

A glândula pituitária ou hipófise é um importante órgão endócrino secreção de hormônios essenciais para a homeostase1,2. Anatomicamente, a glândula pituitária é uma estrutura ' dois-em-um ' da neuro-hipófise e a adenohipófise. Estas peças têm a função e diferentes origens embrionárias muito diferentemente. A neuro-hipófise é derivada do ectoderma neural e segrega ocitocina e hormônio antidiurético. A adenohipófise origina-se de bolsa de Rathke e é responsável para a liberação de hormônios, incluindo o hormônio do crescimento, prolactina, hormônio estimulante da tireoide, hormônio folículo estimulante, hormônio luteinizante, hormônio adrenocorticotrófico, e melanócito – estimulante hormônio3,4,5.
A glândula pituitária baseia-se na superfície dorsal do osso esfenoide (sella turcica) do crânio do mouse e é ligada ao pavimento do cérebro por um frágil caule. Está rodeada lateralmente pelos nervos trigêmeo e anteriormente pelo quiasma óptico6,7. A glândula tem uma forma oval alongada com seu longo eixo perpendicular a isso da cabeça. Em sua superfície dorsal, a neuro-hipófise e a adenohipófise podem facilmente ser demarcadas, com a primeira ocupando a região dorsal medial e o último estendendo lateralmente e ventralmente. Durante o desenvolvimento pós-natal, o tamanho da hipófise aumenta rapidamente no primeiro mês após o nascimento de8,9. Não obstante, a hipófise de rato ainda é muito pequena em tamanho, com um peso médio de 1,9 mg e long-eixo de ~ 3 mm de diâmetro em adulto10, um diâmetro de eixo longo de 2-2,5 mm no pós-Natal dia 21 (P21) e apenas de 1-1,5 mm em P0.
Uma secção coronal é preferida para exibir ambos adenohipófise e neuro-hipófise em uma única fatia da hipófise do mouse. No entanto, algumas habilidades técnicas são necessárias para obter a satisfação secções coronais de glândulas pituitárias de desenvolver ratos devido ao seu tamanho extremamente pequeno e anatomia distinta. Neste artigo de vídeo, demonstramos como dissecar as glândulas pituitárias de rato e preparar secções coronais da hipófise em diferentes estágios de desenvolvimento.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Tools/Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors-straight</td><td>JinZhong</td><td>J21010</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Fine scissors-strainght</td><td>JinZhong</td><td>WA1010</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Blunt forceps</td><td>JinZhong</td><td>JD1020</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Dumont</td><td>RS-5015</td><td>for isolation of the pituitary</td></tr><tr><td>26G (0.45mm) needle</td><td>HongDa</td><td></td><td>for transcardial perfusion</td></tr><tr><td>Syringe (1 mL)</td><td>BD</td><td>300841</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Syringe (10 mL)</td><td>BD</td><td></td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>35mm dish</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Lens cleaning paper</td><td>ShuangQuan</td><td></td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Anatomical microscope</td><td>OLYMPUS</td><td>SZX-ILLB2-200</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Embedding cassette</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-272423</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Tissue embedding console system</td><td>KEDEE</td><td>KD-BM11</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Thermo Fisher</td><td>HM315R</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Superfrost-Plus slides</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-037-246</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-543</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>OLYMPUS</td><td>BH2-RFCA</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urethane</td><td>BBI</td><td>EB0448</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>Na2HPO4.12H2O</td><td>Sigma</td><td>71650</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P2222</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>NaNO2</td><td>Sigma</td><td>237213</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodium Injection</td><td>SPH</td><td>H31022051</td><td>for perfusion saline</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>SCR</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>SCR</td><td>10023418</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Thermo Fisher</td><td>8330</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Sigma</td><td>H9627</td><td>for H&amp;amp;E staining</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma</td><td>E4009</td><td>for H&amp;amp;E staining</td></tr><tr><td>rabbit anti growth hormone (GH)</td><td>National Hormone</td><td></td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>antibody</td><td>Pituitary Program</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse GFAP antibody</td><td>Sigma</td><td>G9269</td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG, HRP</td><td>Jackson</td><td>111-035-003</td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>TSA system</td><td>NEN Life Science Products</td><td>NEL700</td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher</td><td>S32356</td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>Anti-FITC Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11090</td><td>for immunostaining</td></tr></tbody></table>

dissection and coronal slice preparation of developing mouse pituitary gland

A glândula pituitária ou hipófise é um importante órgão endócrino secreção de hormônios essenciais para a homeostase. É constituída por duas glândulas com funções e origens embrionárias distintas — a neuro-hipófise e a adenohipófise. A desenvolvimento do mouse hipófise é minúsculo e delicado com uma forma oval alongada. Uma secção coronal é preferida para exibir tanto a adenohipófise e neuro-hipófise em uma única fatia da hipófise do mouse.
O objetivo do presente protocolo é conseguir a adequada da hipófise secções coronais com arquiteturas de tecido bem preservado de desenvolver ratos. Neste protocolo, descrevemos em detalhe como dissecar e processo hipófises corretamente de desenvolvimento de ratos. Primeiro, os ratos são fixos por perfusão transcardial de formaldeído antes da dissecação. Em seguida, três diferentes técnicas de dissecação são aplicadas para obter intactas as glândulas pituitárias, dependendo da idade dos ratos. Para ratos fetais entre embrionários dias (E) 17,5-18.5 e neonatos acima de 4 dias, as regiões de sella inteira, incluindo o osso esfenoide, glândulas e nervos trigêmeo são dissecadas. Para filhotes idade pós-natal dias (P) 5-14, as glândulas pituitária conectados com os nervos trigêmeo são dissecados como um todo. Para ratos mais de 3 semanas de idade, as glândulas pituitária são cuidadosamente dissecadas de graça os tecidos circundantes. Também exibimos como incorporar as glândulas pituitária em uma orientação correta usando os tecidos circunvizinhos como Marcos para obter satisfação secções coronais. Esses métodos são úteis na análise de características histológicas e do desenvolvimento das glândulas pituitária no desenvolvimento de ratos.

Este protocolo apresenta um método para dissecar as glândulas pituitárias de desenvolver ratos. Para o mouse neonatal, as regiões de sella inteira que contém a glândula pituitária, os nervos trigêmeo e parte de baixo osso esfenoide foram dissecados para fora da base do crânio. A glândula pituitária pequena e delicada permaneceu intacta durante o processo (figura 1A). Para os ratos mais de 5 dias, as glândulas pituitária anexadas aos nervos trigêmeo laterais foram então isolado. A estrutura bruta da glândula pituitária isolada de rato foi bem preservado o P7 (figura 1B). Para o mouse de P21, o tamanho da glândula pituitária foi aumentado notavelmente comparada com a do rato neonatal. A glândula pituitária foi com êxito isolada com dano invisível ao remover seus tecidos circundantes (Figura 1).
Para exibir a região de máxima da Adenohipofise e neuro-hipófise em uma única fatia da hipófise, uma secção coronal é preferencial. As glândulas pituitária dissecadas foram devidamente orientadas para conseguir satisfazer secções coronais. H &#38; E coloração mostrou bem preservada a morfologia da Adenohipofise e neuro-hipófise em P0, P7 e P21 hipófises (Figura 2).
As fatias processadas também eram compatíveis com imunofluorescência rotulagem. Como exemplo, a adenohipófise e a neuro-hipófise mostrou immunolabeling específico de GH e GFAP, respectivamente (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56356/56356fig1.jpg"> 
Figura 1: dissecação de pós-natal em desenvolvimento hipófises. Vista dorsal para dissecado as glândulas pituitárias e tecidos circunvizinhos de ratos P0, P7 e P21. A, anterior; P, posterior; L, à esquerda; R, certo; SB, osso esfenoide; TN, nervo trigêmeo; AH, adenohipófise; NH, neuro-hipófise. Escala de barras, 1 mm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56356/56356fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56356/56356fig2.jpg"> 
Figura 2: histologia das glândulas pituitárias de rato. H representante &#38; E manchas nas secções coronais pituitária de ratos P0, P7 e P21. (A, Be C) são vistas de baixa ampliação de pituitaries coronais. (D, Ee F) são respectivamente o alargamento das áreas enquadrados em (A, Be C). Barras de escala = 1 mm em (A, B e C); e 20 µm (D, E e F). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56356/56356fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56356/56356fig3.jpg"> 
Figura 3: coloração imunofluorescente representativo sobre as glândulas pituitárias. (A) GH (vermelho) foi especificamente expresso na adenohipófise de ratos P7. (B) Magnified imagem da área enquadrada em r. (C) GFAP (verde) foi especificamente expresso na neuro-hipófise de ratos P21. (D) Magnified imagem da área enquadrada em C. núcleos estavam manchadas com DAPI (azul). Barra de escala = 300 µm (A e C); e 30 µm (B e D). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56356/56356fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Dissecação e preparação Coronal fatia de desenvolver Mouse hipófise

Apresentamos um protocolo para dissecar as glândulas pituitárias e preparar na hipófise coronais seções de desenvolvimento de ratos.

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

dissection-coronal-slice-preparation-developing-mouse-pituitary

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

17.2K visualizações.  Second Military Medical University. Apresentamos um protocolo para dissecar as glândulas pituitárias e preparar na hipófise coronais seções de desenvolvimento de ratos.

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An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

Uma Abordagem Optogenetic para Avaliar Formação das conexões neuronais em um sistema de co-cultura

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Biologia do Desenvolvimento

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Um Ensaio Slice organotípicas para High-Resolution Imaging Time Lapse de migração neuronal no cérebro pós-natal

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Neurociência

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

Preparação de Synaptoneurosomes de rato Cortex usando um gradiente de densidade Percoll descontínuo Sacarose-

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Preparation of Parasagittal Slices for the Investigation of Dorsal-ventral Organization of the Rodent Medial Entorhinal Cortex

Computation in the brain relies on neurons responding appropriately to their synaptic inputs. Neurons differ in their complement and distribution of membrane ion channels that determine how they respond to synaptic inputs. However, the relationship between these cellular properties and neuronal function in behaving animals is not well understood. One approach to this problem is to investigate topographically organized neural circuits in which the position of individual neurons maps onto information they encode or computations they carry out1. Experiments using this approach suggest principles for tuning of synaptic responses underlying information encoding in sensory and cognitive circuits2,3.
The topographical organization of spatial representations along the dorsal-ventral axis of the medial entorhinal cortex (MEC) provides an opportunity to establish relationships between cellular mechanisms and computations important for spatial cognition. Neurons in layer II of the rodent MEC encode location using grid-like firing fields4-6. For neurons found at dorsal positions in the MEC the distance between the individual firing fields that form a grid is on the order of 30 cm, whereas for neurons at progressively more ventral positions this distance increases to greater than 1 m. Several studies have revealed cellular properties of neurons in layer II of the MEC that, like the spacing between grid firing fields, also differ according to their dorsal-ventral position, suggesting that these cellular properties are important for spatial computation2,7-10.
Here we describe procedures for preparation and electrophysiological recording from brain slices that maintain the dorsal-ventral extent of the MEC enabling investigation of the topographical organization of biophysical and anatomical properties of MEC neurons. The dorsal-ventral position of identified neurons relative to anatomical landmarks is difficult to establish accurately with protocols that use horizontal slices of MEC7,8,11,12, as it is difficult to establish reference points for the exact dorsal-ventral location of the slice. The procedures we describe enable accurate and consistent measurement of location of recorded cells along the dorsal-ventral axis of the MEC as well as visualization of molecular gradients2,10. The procedures have been developed for use with adult mice (&gt; 28 days) and have been successfully employed with mice up to 1.5 years old. With adjustments they could be used with younger mice or other rodent species. A standardized system of preparation and measurement will aid systematic investigation of the cellular and microcircuit properties of this area.

We describe procedures for preparation and electrophysiological recording from brain slices that maintain the dorsal-ventral axis of the medial entorhinal cortex (MEC). Because neural encoding of location follows a dorsal-ventral organization within the MEC, these procedures facilitate investigation of cellular mechanisms important for navigation and memory.

Preparação de fatias parassagital de Investigação de dorso-ventral Organização do Rodent córtex medial entorrinal

Computation in the brain relies on neurons responding appropriately to their synaptic inputs. Neurons differ in their complement and distribution of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Imagens ao vivo da mitose no desenvolvimento Cortex embrionárias de camundongos

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

A modificação de um Colliculo-tálamo-cortical do cérebro do rato Fatia, Incorporando a impressão 3-D da Câmara Components and Imaging Optical Multi-escala

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

Um tumor cerebral / Slice organotípicas Co-cultura Sistema de Estudos de Tumor Microenvironment e alvejado droga Terapias

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

Medicina

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including proliferation, self-renewal and multipotency. In the postnatal and adult brain, NSPCs are mainly present in two neurogenic niches: the subventricular zone (SVZ) lining the lateral ventricles and the subgranular zone of the hippocampal dentate gyrus (DG). The isolation of the neurogenic niches from postnatal brain allows obtaining a higher amount of NSPCs in culture with a consequent advantage of higher yields. The close contact between cells within each neurosphere creates a microenvironment that may resemble neurogenic niches. Here, we describe, in detail, how to generate SVZ- and DG-derived neurosphere cultures from 1&#8722;3-day-old (P1&#8722;3) mice, as well as passaging, for neurosphere expansion. This is an advantageous approach since the neurosphere assay allows a fast generation of NSPC clones (6&#8722;12 days) and contributes to a significant reduction in the number of animal usage. By plating neurospheres in differentiative conditions, we can obtain a pseudomonolayer of cells composed of NSPCs and differentiated cells of different neural lineages (neurons, astrocytes and oligodendrocytes) allowing the study of the actions of intrinsic or extrinsic factors on NSPC proliferation, differentiation, cell survival and neuritogenesis.

In this article, we describe, in detail, a protocol for the generation of neurosphere cultures from postnatal mouse neural stem cells derived from the main mouse neurogenic niches. Neurospheres are used to identify neural stem cells from brain tissue allowing the estimation of precursor cell numbers. Moreover, these 3D structures can be plated in differentiative conditions, giving rise to neurons, oligodendrocytes and astrocytes, allowing the study of cell fate.

Isolamento e Expansão das Neuroesferas a partir de Nichos Neurogênicos de Camundongos (P1-3)

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

Microdissection of Mouse Brain into Functionally and Anatomically Different Regions

The brain is the command center for the mammalian nervous system and an organ with enormous structural complexity. Protected within the skull, the brain consists of an outer covering of grey matter over the hemispheres known as the cerebral cortex. Underneath this layer reside many other specialized structures that are essential for multiple phenomenon important for existence. Acquiring samples of specific gross brain regions requires quick and precise dissection steps.&#160;It is understood that at the microscopic level, many sub-regions exist and likely cross the arbitrary regional boundaries that we impose for the purpose of this dissection.
Mouse models are routinely used to study human brain functions and diseases. Changes in gene expression patterns may be confined to specific brain areas targeting a particular phenotype depending on the diseased state. Thus, it is of great importance to study regulation of transcription with respect to its well-defined structural organization. A complete understanding of the brain requires studying distinct brain regions, defining connections, and identifying key differences in the activities of each of these brain regions. A more comprehensive understanding of each of these distinct regions may pave the way for new and improved treatments in the field of neuroscience. Herein, we discuss a step-by-step methodology for dissecting the mouse brain into sixteen distinct regions. In this procedure, we have focused on male mouse C57Bl/6J (6-8 week old) brain removal and dissection into multiple regions using neuroanatomical landmarks to identify and sample discrete functionally-relevant and behaviorally-relevant&#160;brain regions. This work will help lay a strong foundation in the field of neuroscience, leading to more focused approaches in the deeper understanding of brain function.

We present a hands-on, step-by-step, rapid protocol for mouse brain removal and dissection of discrete regions from fresh brain tissue. Obtaining brain regions for molecular analysis has become routine in many neuroscience labs. These brain regions are immediately frozen to obtain high quality transcriptomic data for system level analysis.

Microdisseção do Cérebro de Camundongos em Regiões Funcional e Anatomicamente Diferentes

The brain is the command center for the mammalian nervous system and an organ with enormous structural complexity. Protected within the skull, the brain ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.