この作品での顕微鏡で、研究所のトランスフォーマティブ生命分子 (WPI ITbM) 名古屋大学を行われ、日本高等植物科学ネットワークでサポートされています。この作品は、振興会の日本科学技術振興機構 (ERATO プロジェクト ノルウェールーテルし調印) 会からの助成金によって支えられた: 革新的な領域 (Nos 科学研究費補助金。JP24113514、JP26113710、JP15H05962、および調印、および Nos JP15H05955。JP16H06465、JP16H06464、T.H の JP16K21727)、科研費若手 (B、Nos。JP24770045 と調印の JP26840093)、科研費挑戦的萌芽研究号調印の JP16K14753)。

1 体外 胚珠培養培地の調製 <ol><li>を 体外 の胚珠培養用液体培地 (&#34; N5T 中 &#34;) 1 x Nitsch 基底塩混合物、5% (w/v) トレハロース二水和物、0.05 を含む。% (w/v) の 2-(N morpholino) ethanesulfonic 酸 (MES)-島 (pH 5.8) 1 x Gamborg &#39; s ビタミン ソリューションです</li>。
	<li>島の 5.8 に pH を調整します</li>。
	<li>は、オートクレーブに入れることによって媒体を滅菌 (121 ° C、20 分) または、0.22 μ m フィルターをフィルタ リングします 。
	注: 滅菌媒体格納できる 4 ° C で 2 - 3ヶ月</li>。
</ol> 2。PDMS 駆動式マイクロピラー アレイ素子の作製 <ol><li>カット ナイフ、かみそりの刃または 35 mm ガラス底皿のガラスの部分 (14 mm φ) に収まるようにハサミで PDMS 駆動式マイクロピラー デバイス 。
	注: PDMS 装置建設の完全な手順は前論文 8 , 9 で説明、ここでこうして、詳細は省略します。デバイスがなくても短期的なイメージングのため 4 ウェルまたは 96 ウェルのプレートなどの小さいボリュームでガラス底培養皿を使用できます</li>。
	<li>定置滅菌 15 分の紫外線の下で PDMS 装置の上側</li>
	<li>正方形のチップ ピンセットを使用してによって PDMS 装置を切り、底を殺菌する 15 分の軽い UV の下でそれを維持します</li>。
	<li>35 mm ディッシュに滅菌の PDMS デバイスを転送し、デバイスは培地 (約 5-7 mL) で完全に浸漬されるまで N5T 培地を追加します</li>。
	<li>料理を真空チャンバーに入れて、ガスを抜き圧力を減らします。一夜にしてデバイスの空気が媒体によって置き換えられるまで 3 時間掃除機を維持します 。
	注: デバイスは、強力な真空の下で空気の泡で切り離すことが</li>。
	<li>皿から正方形のチップ ピンセットでそれを保持することによって、デバイスを取るし、サイドと下部に余分なメディアを取り出してペーパー タオルの上に置く 。
	注: これが胚珠の耕作のために使用されるため、駆動式マイクロピラー アレイ (上面) に媒体を削除しないでください</li>。
	<li>アッパー サイドとして駆動式マイクロピラーの部分を保つために確保、76 mm × 26 mm スライド ガラス上にデバイスを転送し、次の胚珠抽出中に完全に乾くことから媒体を防ぐために 35 mm の文化料理ふた付きのデバイスをカバーします</li>。
</ol> 3。Silique 郭清と胚珠抽出 <ol><li>70% エタノールで拭くことによって針 (0.40 mm G) と高級ピンセットを消毒します。針は、注射器や木の棒に接続し、簡単に処理します</li>。
	<li>は、植物の花序をチェックし、実験のための適切な siliques を選択します。約 5 mm siliques 含む受精卵と 8-10 mm siliques 若い球状胚があります</li>。
	<li>は、ピンセットを使用して、siliques を消費税し、76 × 26 mm スライド グラス上に両面テープの上に置きます。について 1 つの silique が含まれています 40 60 胚珠と 3-4 siliques (すなわち 120-240 胚珠) が 1 つのデバイスにとって十分です</li>。
	<li>は、滅菌注射針と顕微鏡下で、ピンセットを使用して胚珠を表示する silique (子房壁) を開きます。胚珠は破損していないように子房壁のみをカットします</li>。
	<li>(2.7 の手順で準備) PDMS のデバイスに N5T 中に開かれた silique を転送し、針やピンセットで媒体に胚珠をリリースします</li>。
	<li>駆動式マイクロピラー アレイ内のスペースに胚珠をプッシュする PDMS デバイス上に小さなカバー ガラス (18 mm × 18 mm) を配置します</li>。
	<li>余分なメディアを削除するピンセットや指を使用して横に引いてカバーガラスを脱ぐ</li>。
	<li>PDMS デバイスを裏返し、35 mm ガラス底皿に置き、少しガラスに固執する正方形のチップ ピンセットを使用してを押してデバイスを押し</li>。
	<li>ガラス底にそっと注ぐ N5T 媒体まで PDMS 装置は中、ずぶ濡れ中瓶をデカントで皿し、パラフィン フィルムが付いている皿をシールします 。
	注: PDMS デバイスは、リサイクルすることができますが、あまりにも古いデバイスは、ガラス底から容易に切り離します。手順 2.5 では完全に脱がないまたは媒体は余りにすぐに注がれる場合デバイスがさらに、浮かぶかもしれない</li>。
</ol> <img alt="Figure 2"class="xfigimg"src="/files/ftp_upload/55975/55975fig2.jpg"/> 図 2: 試料の概略プロシージャ 。
このフロー図は、手順 3.5 から 4.1 に対応します。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55975/55975fig2large.jpg"target="_blank"> この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
 4 低速度撮影画像 倒立顕微鏡、3.9 ステップで準備されたガラス底皿を配置し集中する適切な胚珠をオン] <ol><li>. 。
	注: ステージ、位置、および方向で、胚珠が異なりますので適切な胚珠発見されるべき自分のマーカーの蛍光をチェックしています</li>。
	<li>は、メーカーによるとライブ イメージングを開始 &#39; 顕微鏡システムの指示 。
	注: 顕微鏡装置およびパラメーター多様であり従ってユーザーが実験目的に合った適切な設定を選択する必要があります。例として、この原稿で使用される設定は、表 1 に示す</li>。
</ol> <table border="1"fo:keep-together.within-page="1"fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td>機器/設定</td> <td>図 3 (A) および補足のビデオ 1 4</td> <td>図 3 (B) および補足のビデオ 2</td> <td>補足動画 3</td></tr> <tr><td>顕微鏡</td> <td>倒立レーザー走査顕微鏡 (A1R MP)</td> <td>回転ディスク共焦点倒立顕微鏡 (CSU W1)</td> <td>ボックス型逆安定したインキュベーション室 (CV1000) と共焦点顕微鏡システム</td></tr> <tr><td>レーザー</td> <td>フェムト秒パルス レーザー</td> <td>488 nm および 561 nm の LD レーザ</td> <td>488 nm および 561 nm の LD レーザ</td></tr> <tr><td>O組込めますレンズ</td> <td>水浸対物レンズ × 40 (NA = 1.15) 浸漬媒体</td> <td>シリコーン油浸対物レンズ X 60 (NA = 1.30)、ピエゾ フォーカス ドライブにマウントされている</td> <td>40 X 対物レンズ (NA = 0.95)</td></tr> <tr><td>検出または</td> <td>外部非 descanned GaAsP PMT 検出器</td> <td>EMCCD カメラ</td> <td>EMCCD カメラ</td></tr> <tr><td>ダイクロイック ミラー</td> <td>DM495 と DM560</td> <td>DM488/561</td> <td>DM400-410/488/561</td></tr> <tr><td>フィルター</td> < td> バンドパス フィルター;534/30 nm と 578/105 nm</td> <td>バンドパス フィルター; 520/35 nm、および 593/46 nm</td> <td>バンドパス フィルター; 520/50 nm と 617/73 nm</td></tr> <tr><td>z 軸に沿ったスライス</td> <td>1 μ m 間隔で 31 z スタック</td> <td>17 z スタック 3 μ m の間ヴァルス</td> <td>5 μ m 間隔で 7 z スタック</td></tr> <tr><td>時間</td> <td>20 分</td> <td>5 分</td> <td>10 分</td></tr></tbody></table> テーブル 1:顕微鏡システム、この原稿で使用される設定します 。
顕微鏡とパラメーターは多様であり従って各ユーザーは、実験のための適切なシステムを選択してください。
<ol start="3"> <li>取得イメージ シーケンスを確認し、.avi またはプレゼンテーションに .mov などの一般的なムービー形式に変換します 。
	注: 顕微鏡のソフトウェアは、ムービー形式として、映像を出力できませんは、ImageJ、NIH イメージ、ファイルの種類を変更するに触発されたオープン ソース プログラムで開いて .tif として画像を保存することが可能。ImageJ を提供しています: https://imagej.nih.gov/ij/。ImageJ は、Z s を作るためにも使用できます。説明したように最大強度投影など、ムービーを挟む: https://imagej.net/Z-functions です</li>。
</ol>

<ol>
	<li>Natesh, S., Rau, M. A., Johri, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Embryology of Angiosperms. , 377-443 (1984).</li><li>Kranz, E., Lorz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fertilisation+of+maize+by+single+egg+and+sperm+cell+protoplast+fusion+mediated+by+high+calcium+and+high+pH.">In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH.</a> Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).</li><li>Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+in+vitro+fertilization+system+in+rice+(Oryza+sativa+L.).">Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.).</a> Planta. 226 (3), 581-589 (2007).</li><li>Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+double+fertilization+in+Nicotiana+tabacum+(L.):+the+role+of+cell+volume+in+cell+fusion.">In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion.</a> Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).</li><li>Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+double+fertilization+and+the+cell+cycle+in+male+and+female+gametes+of+tobacco.">Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco.</a> Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).</li><li>Costa, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+cell-derived+peptides+regulate+early+embryo+patterning+in+flowering+plants.">Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants.</a> Science. 344 (6180), 168-172 (2014).</li><li>Sauer, M., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+of+Arabidopsis+embryos+within+their+ovules.">In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules.</a> Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).</li><li>Gooh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+and+optical+manipulation+of+Arabidopsis+early+embryogenesis.">Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis.</a> Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).</li><li>Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microcage+arrays+to+fix+plant+ovules+for+long-term+live+imaging+and+observation.">Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation.</a> Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).</li><li>Kimata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+dynamics+control+the+first+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis+zygote.">Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).</li><li>Nambo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Synthetic+Chemistry+and+Live-Cell+Imaging+Identified+a+Rapid+Cell+Division+Inhibitor+in+Tobacco+and+Arabidopsis+thaliana.">Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).</li><li>Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+with+longer+wavelength+excitation+in+intact+Arabidopsis+tissues.">Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues.</a> Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).</li></ol>

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本稿では、単純な体外胚珠栽培プロトコルは、受精卵や胚の開発の住セルイメージ投射で使用するため効率的を紹介します。
PDMS 装置の設計は、胚の段階に応じて最適化を必要があります。開発の最初のデバイスは microcage 配列方向を調整し、胚珠9の位置を修正してより効率的に胚珠をトラップし、駆動式マイクロピラー デバイスを構築しました8。さらに、マイクロピラーも細くて、microcage よりも柔らかい、従って長期観察中に胚珠拡張を妨げません。この駆動式マイクロピラー デバイスは、胚の心臓原基ステージ8までココヤシの段階からの数日間、胚珠を保持できます。最終的には、ただし、完全に展開された胚珠の高さを超える駆動式マイクロピラー高さ、従ってそれは先のデバイスをプッシュします。したがって、高さや、マイクロピラーの間隔は、後で胚がフォーカス場合に調整必要があります。
胚珠は皿の下部に配置される、ため倒立顕微鏡を使用する必要があります。共焦点顕微鏡、図 3Bと補足動画 2、38,11, のように細胞分裂パターンを監視するための十分な回転ディスク共焦点顕微鏡は長期を実行することが重要です。イメージング細胞の損傷なし。対照的に、生活の深い撮影に適した、二光子励起顕微鏡生物12、受精卵 (図 3 aおよび補足のビデオ 1)10の細胞内動態を可視化する必要があります。したがって、実験に適した顕微鏡システムを使用することが重要です。
前述の紹介と代表の結果に、受精卵・胚胚珠の開発の生活原動力を監視することができます既存の方法はありませんでした。したがって、この胚珠培養法を使用して、初めて受精卵偏波および胚パターン形成の詳細を明らかにされています。
このメソッドは、補足動画 3のように薬理学的実験のため適用されます。また、このイメージング システムは胚の細胞分裂11に新たに合成された化合物の効果を評価していました。レーザー破壊とも正常に結合され、したがって頂端細胞を傷つけとき、基底細胞誘導体が新しい頂端細胞8を生成する彼らの細胞の運命を変更することを明らかにしました。したがって、さらにこのメソッドの様々 な素材や技術への応用が胚発生の分子機構を理解するための強力なツールが提供されます。
この方法で、長期的なイメージングを実行するには、重要なステップは、ターゲット組織および/または構造のラベルを明るい蛍光マーカーを準備です。図 1に示すように、胚珠を受精卵・胚を観察、胚乳における信号の背景、他の胚珠組織は、胚 (図 4) に真の信号を隠すことができます。また、弱い信号を検出する顕微鏡のレーザー パワーが増加する必要がありますが、これは長期観察中に胚珠を害することができます。補足動画 4は、高いレーザー パワー、胚珠の自己蛍光を増加、最終的に受精が押しつぶされた胚嚢を縮小を示しています。したがって、実験を開始する前に特定および明るいマーカー ラインが確立されます。高い明るさに関して tdTomato とクローバー、RFP や GFP よりそれぞれ。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig4.jpg"> 
図 4: 胚珠のバック グラウンド蛍光信号胚性信号をマスクします。 (ヒストン 2B tdTomato; マゼンタ) 胚の核と表皮の核 (ヒストン 2B クローバー; グリーン) のマーカーを表現する胚珠のイメージ。全体の胚珠と摘出胚上で表示され、それぞれのパネルを下げます。矢印は、胎児の位置をポイントします。胚、のみならず全体の胚珠にヒストン 2B クローバーは表現され、したがって胚珠、胚性信号を見つけることは困難です。スケール バー: (A) 50 μ m と 10 μ m (B)。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55975/55975fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

単細胞受精卵から有機体の基本的なボディ計画を開発します。ほとんどの顕花植物のココヤシ部門は、樹状突起と撮影やルート、1それぞれに発展する基底のセルを生成します。したがって、胚発生に伴う植物体を形成する方法を理解することが重要だが、彼らは花に深く成長するのでリビング受精および胚のダイナミクスを直接観測する効果的なツールをされていません。トウモロコシ、米などのいくつかの単子葉種体外受精法は確立された2,3をされています。この方法では分離精子と卵細胞を電気的または化学的に、融合し、生成されたセル、肥沃な工場に開発。ただし、双子葉植物植物の雄性と雌性の配偶子の4、5の細胞周期の非同期状態のためおそらく適切な胚を作り出すことができる体外受精法ではありません。さらに、胚周囲組織 (胚乳) は、胚の開発6で重要な役割を果たしています。
モデルの双子葉植物の種、シロイヌナズナ、体外の栽培方法は、胚と胚乳の7を含む全体の胚珠に焦点を当てによって開発されました。このシステムは正常に様々 な化学試薬の胚発生に及ぼすを分析に使用されたが、低い生存率をもっているため時間経過イメージ投射のため適していません。そこで、新規培養胚珠の栽培システムは、受精卵の段階として早期に開始高比8で肥沃な植物を生成するために開発されました。様々 な試験後 Nitsch 培地が分かったし、トレハロースが胚珠8の生存率を大幅に向上します。さらに、胚珠の展開としては成長して、従って頻繁に顕微鏡の観察フィールドから移動、ために、9の中の胚珠を修正する PDMS 装置が開発されました。PDMS デバイスは、心期胚には受精卵から開発をトレースするのに十分である 3-4 日間の長期的なイメージングが有効になります。このメソッドを使用して、それは偏波受精卵・胚のパターンだけでなく通常の条件下でも低分子阻害剤の存在下でまたは様々 な突然変異体の背景8,10 のダイナミクスを可視化することが可能になります。 ,11。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig1.jpg"> 
図 1: 視覚化受精し胚を胚珠を使用特定の蛍光マーカーの模式図。 シロイヌナズナの受精卵は、花の奥深くに生成される胚珠の胚に開発しています。体外培養システム、受精卵・胚胚珠、観察、従って他の胚珠組織で表されない特定の蛍光マーカーを使用することが重要です。 <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55975/55975fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<table width="606">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">Nitsch basal salt mixture</td>
			<td style="width:104px;">Duchefa</td>
			<td style="width:119px;">N0223</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">trehalose dihydrate</td>
			<td style="width:104px;">Wako Pure Chemical</td>
			<td style="width:119px;">206-18455</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">MES</td>
			<td style="width:104px;">Dojindo</td>
			<td style="width:119px;">345-01625</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">Gamborg&#8217;s vitamin solution</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G1019</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">35-mm glass-bottom dish</td>
			<td style="width:104px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">D111300</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">35 mm culture dish</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430588</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">PDMS</td>
			<td style="width:104px;">Dow Corning Co.</td>
			<td style="width:119px;">Sylgard184</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">76 &#215; 26 mm slide glass</td>
			<td style="width:104px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">S1225</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">18 &#215; 18 mm slide glass</td>
			<td style="width:104px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">C018181</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">needle (gauge 0.40mm)</td>
			<td style="width:104px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">NN-2719S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">Immersion medium Immersol W 2010</td>
			<td style="width:104px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">444969-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">A1R MP</td>
			<td style="width:104px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="width:216px;height:84px;">CSU-W1</td>
			<td style="width:104px;">Yokogawa Electric</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">CV1000</td>
			<td style="width:104px;">Yokogawa Electric</td>
			<td style="width:119px;">CV1000-SP84</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro ovule cultivation for live-cell imaging of zygote polarization and embryo patterning in arabidopsis thaliana

ほとんどの顕花植物の受精および胚は母組織の奥深くに隠されて、従ってそれは長年どのように彼らを動的に開発の謎たとえば、どのように受精は体軸や器官形成の時に胚が様々 な細胞運命を指定する方法を確立する分極します。本稿では、受精とシロイヌナズナの胚の開発の住セルイメージ投射を実行する胚珠体外培養法について説明します。最適化された培地では、受精卵や初期胚肥沃な植物に成長することができます。ポリジメチルシロキサン (PDMS) 駆動式マイクロピラー アレイ デバイスと組み合わせて、胚珠は同じ位置に液体培地で開催されます。この固定は、ココヤシの部門から数日間胚後期に顕微鏡下で同じ胚珠を観察することが重要です。結果住セルイメージ投射を使用して核移行と細胞骨格の再編とも細胞分裂のタイミングや胚パターン形成時の細胞運命仕様など、受精卵の偏波の実時間ダイナミクスを監視できます。さらに、胚発育に及ぼす諸因子の影響を分析する阻害剤治療と細胞間コミュニケーションの役割を調べるレーザー破壊などの光の操作は、この胚珠培養システムを結合できます。

このメソッドはこの胚珠培養システムを用いた偏波受精卵・胚パターン形成生活動態をトレースできます。これは、以前母親組織に深く隠されている受精卵及び胚のリアルタイム挙動を可視化する技術がなかったので成果です。図 3 aと補足のビデオ 1若い受精卵における微小管 (MTs) 穎地域10の横のリングとして蓄積する可能性を示しています。受精は根尖方向に伸長しながら、この MT リングが維持されます。受精卵の伸長および根尖部を核移行完了後 MT リングが消え、MTs を形成する DNA を分離するスピンドル。図 3Bと補足のビデオ 2胚性細胞が放射状に対称な球状形8を形成する協調分割を表示します。このメソッドは、薬理学的実験のために適用されます。たとえば、アクチン重合阻害剤 (latrunculin B の適用後緯度 B) 極核移行の阻害に培養胚珠の受精卵を含む液体培地、およびしたがって受精受精卵偏波 (補足ビデオ 3のアクチン フィラメントの役割を示すより対称の方法で分割)10。方向のトレースを有効に胚の長期的なイメージングと幾何学と細胞周期の期間を意味する個々 の細胞の分裂タイミングを統計的に分析することができます。実際、我々 は以前頂端細胞系列の細胞分裂は基底細胞領域8より高速を示した。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig3.jpg"> 
図 3: ライブ イメージング偏波受精卵・胚パターン形成。 (A) 核 (ヒストン 2B tdTomato; マゼンタ) と微小管 (MTs、クローバー TUA6; 緑) の特定のマーカーを表現する受精の時間経過観察します。レーザー スキャンの倒立顕微鏡 (A1R MP) を使用して、画像に買収されました。(B) (ヒストン 2B sGFP; 緑) 核と細胞膜のマーカーを表現する胚のタイムラプス観察 (PM、tdTomato-LTI6b; マゼンタ)。画像は、回転ディスク共焦点倒立顕微鏡 (CSU W1) を使用して取得しました。画像は最大値投影画像として示されていた、数字は最初のフレームから時間 (h:min)。矢印と黄色のラケットは、それぞれ核と横の MT リングを示しています。シアンのかっこは、スピンドル (A) と (B) 分割核を示します。バーをスケール: 10 μ m (A) と (B) 30 μ m。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55975/55975fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

本稿では体外胚珠栽培手法についてシロイヌナズナ受精および胚の住セルイメージ投射を可能にします。このメソッドを利用して、受精卵の偏波の中に細胞内動態と初期胚細胞運命決定を可視化します。

体外受精卵の Live 細胞イメージング偏光とシロイヌナズナの胚パターン形成の胚珠培養

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

in-vitro-ovule-cultivation-for-live-cell-imaging-zygote-polarization

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

10.8K ビュー.  Nagoya University. 本稿では体外胚珠栽培手法についてシロイヌナズナ受精および胚の住セルイメージ投射を可能にします。このメソッドを利用して、受精卵の偏波の中に細胞内動態と初期胚細胞運命決定を可視化します。

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Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

胸腺の特性を用いてマウス胚における前駆細胞をセトリング<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;アッセイ

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

発生生物学

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily conserved structures that compose it are assembled remains under investigation. Their size and physiological features often constrain manipulation and imaging applications. The culture of immortalized cell lines is widely used, but it can only replicate the early steps of differentiation.
Here, we describe a protocol that enables easy genetic manipulation of myofibers originating from primary mouse myoblasts. After one week of differentiation, the myofibers display contractility, aligned sarcomeres and triads, as well as peripheral nuclei. The entire differentiation process can be followed by live imaging or immunofluorescence. This system combines the advantages of the existing ex vivo and in vitro protocols. The possibility of easy and efficient transfection as well as the ease of access to all differentiation stages broadens the potential applications. Myofibers can subsequently be used not only to address relevant developmental and cell biology questions, but also to reproduce muscle disease phenotypes for clinical applications.

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

ライブイメージングのための成熟した筋線維のin vitro分化に

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

共焦点イメージングは​​、シロイヌナズナの花の開発のライブ

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

シロイヌナズナの胚発生の特性評価法

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

マウス二次口蓋融合のライブイメージング

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and mammalian final host, respectively. The ability to isolate and sustain the different life cycle stages under in vitro culture conditions has greatly facilitated investigations of the cellular, biochemical and molecular mechanisms regulating parasite growth, development and host interactions. Transmission of schistosomiasis requires asexual reproduction and development of multiple larval stages within the snail host; from the infective miracidium, through primary and secondary sporocysts, to the final cercarial stage that is infective to humans. In this paper we present a step-by-step protocol for mass hatching and isolation of Schistosoma mansoni miracidia from eggs obtained from livers of infected mice, and their subsequent introduction into in vitro culture. It is anticipated that the detailed protocol will encourage new researchers to engage in and broaden this important field of schistosome research.

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

This article describes a protocol for the large-scale axenic isolation and collection of free-swimming miracidia of the human blood fluke Schistosoma mansoni and their subsequent processing for introduction into in vitro culture.

質量分離と人間住血吸虫マンソン住血吸虫の Intramolluscan の段階の体外培養

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

細胞分裂時の染色体分配の生きているセルイメージ投射

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

ウサギモデルにおける最適胚期における低侵襲胚移植と胚ガラス化

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...