博士郭 Chiuan hung さんと博士 Bharatkumar 女子の原稿を改善した貴重なコメントをありがとうしたいと思います。

食品医薬品局 (FDA) の研究施設で機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコルに従い、これらの研究実験を行った。
1. 分離と培養マウス胚性線維芽細胞 (MEFs)
<ol><li>標準プロトコル7,8,9PP2A B56γ マウス系統と野生型の同腹仔からマウス萌芽期繊維芽細胞 (MEFs) を分離します。</li>
	<li>3 通路の ExpandMEFs は凍結し、実験8必要になるまでを格納します。</li>
</ol>2. 培養 Mefs 2 ウェル カバーグラスチェンバー用のライブ イメージング
<ol><li>500 ml ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM/f12 キー) を 10% 含む MEF 成長媒体の胎仔ウシ血清 (FBS)、1 X ペニシリン/ストレプトマイシン抗生物質、L-グルタミン (200 mM)、非本質的なアミノ酸 (NEAA) メディア 500 mL ボトル × 1。</li>
	<li>37 ° C で予め温めておいた水風呂通路 3 野生型から冷凍 MEFs、PP2A-B56γ-マウスのバイアルを解凍します。</li>
	<li>15 mL チューブに解凍 MEFs を転送し、ゆっくりと 10 mL のピペットを使用して 15 mL チューブに DMEM/F12 メディアの 20 mL の滴を追加します。</li>
	<li>T75 フラスコに DMEM/F12 成長媒体の 20 mL と共に MEFs を転送し、細胞が 70% 合流までそれらを展開します。密度は 4 倍または 10 倍の倍率で逆の顕微鏡を使用して推定されます。</li>
	<li>吸引ガラスの牧草地を使用して培ピペットのボンネットの真空システムに接続された 0.25% トリプシン/EDTA の 3 mL を加える、DMEM/F12 成長媒体の反作用を停止する 5 分追加 3 mL 37 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>室温で 5 分間 (300 x g) を低速度で細胞を遠心します。慎重に上澄みを除去し、再 37 の ° C の水浴中で加温 DMEM/F12 成長培地 1 mL の細胞ペレットを中断します。</li>
	<li>トリパン ブルー排除法またはその他の適切なセルを数える方法8を使用して細胞を列挙します。</li>
	<li>MEFs/ウェル 2 ウェル カバーグラスチェンバーの種子約 20,000。200 μ L/ウェル/F12 DMEM 培を追加し、37 ° C、5% CO2でそれらを一晩インキュベートして接続するセルを許可します。</li>
</ol>3. 同期
<ol><li>G0/G1 期で 0.1 %dmem/F12 成長培地で細胞を培養して MEFs を同期 G0/G1 期のセルの最大数を取得する、24 時間 FBS。 注: 血清飢餓は、好みの方法として使用された、さまざまな方法を逮捕10に必要な細胞の分裂の段階に応じて使用できます。</li>
</ol>4. ラベリング
<ol><li>1.5 mg/mL の DMSO でノコダゾールの原液を準備します。ノコダゾールは G2/m 期で10微小管形成を阻害することによって細胞を逮捕します。</li>
	<li>3 日後に同期、200 μ L (10 %fcs) と成長媒体の 200 ng/mL ノコダゾール CL HB リージェント (ヒストン 2B GFP BacMam 2.0) を追加します。</li>
	<li>CL HB リージェント粒子ごとのセル (PPC) のセルに次のように追加するを計算します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57389/57389eq1.jpg"> セルの数がラベルの時にセルの推定合計数は、PPC はセルごとの粒子の数と 1 × 10 の8は、試薬の mL あたり粒子の数。たとえば、30 の ppc ラベル 20,000 セルに <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57389/57389eq2.jpg"> メモ: CL HB リージェント 10 および 50 の PPC の間ほとんどの細胞の種類とうまく動作します。しかし、この研究の最高 30 PPC の仕事。</li>
	<li>MEFs を 37 ° C、5% CO2で 18 h にインキュベートします。 注: 現在の実験用スピンドル集合チェックポイントをエスケープ分裂期の細胞の染色体の可視化後に発生した 18 h ノコダゾールと細胞周期の停止。</li>
</ol>5. 染色体の遅れの可視化
<ol><li>マウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEFs) 環境チャンバーと油浸漬、63 x 対物レンズ装備回転ディスク共焦点顕微鏡システムを使用して可視化します。<ol>
<li>GFP チャネル イメージ獲得のため、励起波長 488 nm の発光波長 450 nm を使用します。</li>
		<li>モーターを備えられたスキャン段階の機能を持つ回転するディスク共焦点顕微鏡システムを使用、Z ピエゾ ステージ トップ インキュベーションと写真がこの手法の漂白後の直接蛍光回復を挿入します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 日前にイメージング、環境室の電源を on し、一晩 37 ° C で全体の部屋を暖めます。</li>
	<li>顕微鏡スタンド、カメラ、回転ディスク装置、照明装置、アルゴン レーザー、コンピューター、電動ステージの電源をオンにします。</li>
	<li>システムのウォーム アップに、3 分。イグニッションキーをオンにするには、アルゴン レーザーを起動します。「実行レーザー」を「スタンバイ」からアルゴン レーザー用トグル スイッチを切り替えます。</li>
	<li>データの取得と処理のソフトウェアを起動します。</li>
	<li>ステージ トップ インキュベーターの CO2のコント ローラーを開始し、CO2の濃度を 5% に設定します。これは、イメージングの開始前に行う必要があります。</li>
	<li>可視化のための段階にインキュベーターと場所から、カバーグラスチェンバーを削除します。油浸漬 63 x 対物レンズ (NA1.4) 細胞を可視化します。</li>
	<li>眼のレンズを通して表示、イメージを集中させおよび核膜崩壊 (NEBD) 段階でセルを識別します。</li>
	<li>適切なレーザー (488 nm アルゴン レーザー Histone2B GFP を可視化する) を開始します。</li>
	<li>取得コントロール ウィンドウを開き、GFP チャネル用の露光時間を設定します。NEBD のセルを識別します。<ol>
<li>手動でターゲット セルの上部と下部の焦点面を決定し、xyz を光学的に切断の設定を入力します。</li>
		<li>20 分間の観察します。細胞が細胞分裂を通じて進まない場合 20 分後の画像集録を停止し、NEBD は、次のセルに移動します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>セルあたり約 1 h 画像遅れて染色体嚢から脱出した PP2A B56γ 細胞における有糸分裂時必要です。映画のデータを取得するには、3 分毎写真を撮る。 注: 野生型細胞を逮捕、NEBD ノコダゾールと扱われたとき過去進歩していません。</li>
	<li>さらに分析の zvi ファイル形式で画像を保存します。</li>
</ol>6. 画像処理と解析
注: は、三次元画像処理と Axiovision バージョン 4.8.2 や Imaris バージョン 8.2 など任意の利用可能なソフトウェアを使用して解析を実行します。今回、ImageJ のソフトウェアを使用しました。
<ol><li>イメージ シーケンスを開きます。画像が既にスタック形式の場合は、次の手順に進みます。そうでない場合は使用してスタックにすべての関連する画像を組み合わせる 'イメージ > スタック > スタックに画像' メニュー バー。</li>
	<li>明るさ/コントラスト、レベルに必要な調整を実行します。</li>
	<li>映画にタイムスタンプを追加: する<ol>
<li>' イメージ > スタック > ラベル...' メニュー バー。</li>
		<li>適切な形式では、開始時刻の値、各画像間の時間間隔を選択します。</li>
		<li>「プレビュー」にチェック、の場所と形式設定を調整します。タイム ・ スタンプを適用する [OK] を押します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>映画に縮尺記号を追加: する<ol>
<li>画像のスケーリングを設定 '分析 > スケールを設定' メニュー バー。</li>
		<li>「距離 (ピクセル単位)」フィールド距離が既知の場合、ピクセル数を入力してください、'知られている距離' フィールドに距離を入力。スタックにスケールを適用する ' OK' を押して μ m で正しいの距離、例えば長さの単位を設定します。</li>
		<li>'分析 > ツール > スケール バー]' スケール バーを追加します。'Μ m 幅' で、バーのサイズを設定し、残りの適切なオプションを書式設定を調整します。スタック全体に縮尺記号を追加する 'すべてのスライスのラベル' チェック ボックスを選択します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>イメージ ウィンドウの端を画面左下の三角の再生ボタンをクリックして、ムービーをプレビューします。フレーム レートを使用して調整 ' イメージ > スタック > アニメーション > アニメーション オプションのメニュー バーにします。</li>
	<li>ムービー ファイルを選択してエクスポート ' ファイル > 名前を付けて保存 > AVI. '、フレーム レートと圧縮を選択。</li>
	<li>保存先を選択するには、[OK] をクリックしての場所とファイル名。動画ファイルを保存する [保存] を押します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+in+CIN:+Mitotic+Infidelity+and+Its+Consequences+for+Tumor+Promotion+and+Suppression.">Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression.</a> Dev Cell. 39, 638-652 (2016).</li><li>Etemad, B., Kops, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attachment+issues:+kinetochore+transformations+and+spindle+checkpoint+silencing.">Attachment issues: kinetochore transformations and spindle checkpoint silencing.</a> Curr Opin Cell Biol. 39, 101-108 (2016).</li><li>Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. 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S., Narita, T., Schou, J., Nilsson, J., Choudhary, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spindle+Assembly+Checkpoint+Is+Not+Essential+for+Viability+of+Human+Cells+with+Genetically+Lowered+APC/C+Activity.">The Spindle Assembly Checkpoint Is Not Essential for Viability of Human Cells with Genetically Lowered APC/C Activity.</a> Cell Rep. 1 (8), 1829-1840 (2016).</li><li>Iuso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+Expression+of+Human+Protamine+1+(hPrm1)+Remodels+Fibroblast+Nuclei+into+Spermatid-like+Structures.">Exogenous Expression of Human Protamine 1 (hPrm1) Remodels Fibroblast Nuclei into Spermatid-like Structures.</a> Cell Rep. 1 (9), 1765-1771 (2015).</li><li>Ratcliffe, E., Glen, K. E., Naing, M. W., Williams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+and+perspectives+on+stem+cell-based+therapies+undergoing+clinical+trials+for+regenerative+medicine:+case+studies.">Current status and perspectives on stem cell-based therapies undergoing clinical trials for regenerative medicine: case studies.</a> Br Med Bull. 108, 73-94 (2013).</li></ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

正確な染色体分離を確保する細胞周期制御チェックポイントは、異数性とセル変換1,2,3を防ぐため。本研究でわかったその不活性化 PP2A B56γ 弱体化した紡錘アセンブリ チェックポイントで起因しました。ライブセル イメージング ノコダゾール9奏効した PP2A B56γ MEFs における有糸分裂時誤偏析染色体を観察することができました。
このプロトコルは、生きているセルイメージ投射のためのラベル染色体 BacMam 2.0 技術で生成された Histone2B GFP ラベルを利用しています。ラベルに重要な手順の 1 つは十分な表示を達成するために (PPC) のセルごとの粒子の右の量を計算します。10-50 PPC が最適な滴定を通して分かった。この試薬は、細胞に有毒であるかもしれないそれ故にラベルとラベル付きセルに毒性の間のバランスを達成するために使用される PPC を滴定する必要があります。また、これは一過性トランスフェクションを 5 日前までのみを検出することができます、したがって、それことができない長い観察期間を要する研究のために適切。
従来の複雑なプロトコルを必要とする蛋白質または DNA のタグ付けできますが、ここでのみ任意のセルで一晩インキュベートを必要とする試薬を使用します。さらに、ライブを共焦点レーザー顕微鏡とは異なり、高速、光毒性を減少させる回転のディスク共焦点顕微鏡を用いた細胞イメージングを行ったし、漂白効果、体内細胞の11。このプロトコルでは、分裂期細胞をラベルし魚、免疫組織化学などの他の手法と比べて染色体分離を視覚化し、フローサイトメトリーに簡単で便利な方法ことができます。このプロトコルはまた、細胞分裂できるようになり、このような表現型をキャプチャすることが可能、従来の各種、魚またはフロー フローサイトメトリーを使用して取得する追加情報を提供することを通して染色体画像の遅れのキャプチャとして、空間と時間の両方に染色体を遅れています。このプロトコルでは、便利な高速かつ簡単にさまざまな細胞、初代培養細胞、幹細胞、ニューロン、不死化 T 細胞12,13,14染色体のラベリングをことができます。
細胞療法製品の様々 なタイプは、様々 な病気の条件15を治療するために希望を持って開発されています。これらの細胞治療の開発で直面している課題の 1 つは遺伝的不安定性と腫瘍形成の可能性のための安全性の懸念を含まれます。このプロトコルでは、さまざまな種類のセルのラベルの染色体に便利で簡単な方法について説明します。将来的にそれを採用して、研究し、遺伝的不安定性と細胞療法製品の品質を測定するアッセイを開発可能性があります。

次のプロトコルでは染色体の分離とヒストン 2B GFP、BacMam 2.0 のラベリングおよび生きているセルイメージ投射使用してマウス萌芽期繊維芽細胞の細胞周期の間に細胞分裂の進行を可視化する便利な方法をについて説明します。
細胞周期制御チェックポイントは、染色体分配を監視し、セル1,2,3の遺伝的整合性の維持に重要な役割を果たします。誤隔離された染色体の蓄積異数性、ほとんどの固体腫瘍4の認刻極印である可能性があります。したがって、染色体不安定性を勉強する方法として染色体の遅れの検出を使用できます。
蛍光標識タンパク質ライブ染色体分配を視覚化するために使用される、mCherry タグの生成が遅れている染色体または H2B GFP タグ付きタンパク質遺伝子配達および分子生物学5相当な知識が必要です。ここで簡潔にするため、CL HB リージェントを呼びます CellLight Histone2B GFP BacMam 2.0 試薬の使用について述べる。この試薬は、すぐに使用することができます、従ってベクトル品質と完全性の心配がありません。さらに、この試薬では、潜在的に有害な治療または脂質や色素負荷化学物質の使用は必要ありません。従来の蛍光ラベルとは異なり CL HB リージェント汚れとは無関係 (すなわち。、膜電位)。CL HB 摂政を単にセルに追加し、タンパク質発現の夜通し孵化することができます。CL HB リージェントは、哺乳動物細胞ではレプリケートされません、バイオ セーフティ レベル (BSL) 研究所 1 の設定で使用できます。また、最もダイナミックな細胞分析を遂行する 5 日前まで、十分な時間のため一晩インキュベートした後このトランスフェクションを検出できます。
また、染色体の異常は、フローサイトメトリー、免疫組織化学または蛍光性の現場の交配 (魚) の6のなど様々 な技術によって調査できます。フローサイトメトリーは、異数性、測定することができる DNA 含量と細胞周期の細胞の位相に基づく研究に使用できます。フローサイトメトリーは、異数性を測定する使用できますが、染色体の誤った分離に関する情報は記載していません。魚および免疫組織化学の手法は、DNA や染色体に結合する蛍光プローブを使用します。これらの技術は細胞の人口の状態のスナップショットを提供する、彼らは生細胞イメージングにより行方不明の期間続く特定の細胞分裂の時空間的可視化を通じて取得する情報を許可しません。
このプロトコルは、遅れて染色体やノコダゾール扱われるマウス萌芽期繊維芽細胞 (MEFs) で PP2A-B56γ-マウスから分離した誤偏析染色体研究に使用されました。上記のアプリケーションのほかは、このプロトコルは、ラベルおよび細胞周期制御を研究するために使用できる様々 な細胞タイプにおける染色体分離または腫瘍細胞の染色体不安定性を視覚化するシンプルなツールを提供します。さらに、それも使用できますさまざまな薬物治療によって引き起こされる染色体不安定性の研究、遺伝子が染色体の誤った分離の結果ノックアウトの効果を研究します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:644px;" width="645">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:128px;">11320082</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:191px;">MEM Non-Essential amino acids solution (100X)</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered saline</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:135px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td>MX 1458-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryogenic vial storage boxes</td>
			<td style="width:135px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:128px;">10-500-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Cryogenic vials</td>
			<td style="width:135px;">Corning/costar</td>
			<td align="right">431416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">T75 flasks</td>
			<td style="width:135px;">Cellstar</td>
			<td align="right" style="width:128px;">658175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">2 well chambered cover glass</td>
			<td style="width:135px;">Nunc</td>
			<td style="width:128px;">155380PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Cellometer Vision Cell Profiler</td>
			<td style="width:135px;">Nexcelom Bioscience LLC</td>
			<td style="width:128px;">Cellometer Vision Trio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:128px;">C10594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Zeiss Cell Observer Spinning Disk Confocal Microscope system</td>
			<td style="width:135px;">Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td style="width:128px;">Zeiss Cell Observer SD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Water Bath</td>
			<td style="width:135px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:128px;">280 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Incubator</td>
			<td style="width:135px;">Sanyo commercial solutions</td>
			<td style="width:128px;">MCO-18AIC (UV)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Class II Biological safety cabinet</td>
			<td style="width:135px;">The Baker Company</td>
			<td style="width:128px;">SterilGard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Axiovision software</td>
			<td style="width:135px;">Zeiss</td>
			<td style="width:128px;">Ver.4.8.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:135px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:128px;">Ver. 1.51r</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell imaging of chromosome segregation during mitosis

染色体分離されねばならない確実かつ均一に娘細胞に細胞分裂の間に。染色体分離の再現性は、紡錘アセンブリ チェックポイント (SAC) を含む複数のメカニズムによって制御されます。SAC は、有糸分裂を通して細胞の進行の防止のため、すべての染色体がスピンドル微小管に接続している場合を除き、複雑なフィード バック システムの一部です。染色体のラギングおよび異常な染色体分離機能不全の細胞周期制御チェックポイントの指標し、細胞分裂のゲノムの安定性を測定する使用ことができます。SAC の規制緩和は、染色体の分離中にエラーの蓄積により悪性細胞に正常な細胞の変形で起因できます。SAC の実装と複雑な動原体の形成は、キナーゼとホスファターゼ プロテインホスファターゼ 2 a などの相互作用で厳しく規制 (PP2A)。このプロトコルでは、遅れていた PP2A B56γ 調節サブユニットのノックアウト マウスから分離されたマウス萌芽期繊維芽細胞における染色体の生きているセルイメージ投射について説明します。このメソッドは、その他細胞周期制御イメージング技術フローサイトメトリーなど免疫細胞化学染色体の動的な時空間の可視化ではなく、細胞分裂の状態のスナップショットを提供するだけの欠点を克服します。有糸分裂の間。

野生型と PP2A-B56γ-マウスから MEFs 2 よくチャンバー カバー ガラスのシードし、の接続を許可しました。2 日目、MEFs は 0.1% を使用して同期された FBS の 24 h。200 ng/mL メディアで MEFs 第 3 日ノコダゾールと 30 PPC CL HB regentwere は 37 で 18 時間培養° C、5 %co2。4 日目、回転するディスク共焦点顕微鏡システム (図 1) を使用してセルをイメージしました。生きている細胞イメージングが有糸分裂 (図 2) を NEBD からきて、個々 の細胞の運命を視覚化に使用されました。ノコダゾールは、G2M 段階で微小管形成阻害による野生型細胞を逮捕する知られています。そのポスト、ノコダゾール治療の野生型細胞が中期アッパー パネル (図 2) で逮捕されたことがわかった。PP2A B56γ の欠如が PP2A-B56γ-MEFs ノコダゾール9による細胞周期の停止を克服するを許可する細胞周期制御を弱体化を見ました。さらに、染色体の異常偏析はノコダゾール (図 2の下のパネルに黄色の矢印で表示) で扱われる分裂 PP2A B56γ MEFs の 62% (13 のうち 21) で検出されました。PP2A B56γ MEFs の 5 つは NEBD で逮捕され、観察可能な欠陥のない細胞分裂を経て 3。対照的に、イメージしましたすべての 21 野生型細胞は有糸分裂を通して進まなかったし、中期 (上部パネル図 2) によって逮捕されることがわかった。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57389/57389fig1.jpg"> 図 1.生きているセルイメージ投射のための基本的なフローチャート。野生型と PP2A-B56γ-マウスから MEFs は一晩 2 ウェル カバーグラスチェンバーで播種。日 2 のセルは、FBS の 24 時間、3 日目のセル成長の媒体および 30 PPC ヒストン 2B GFP で 200 ng/mL ノコダゾールと扱われた 0.1% を使用して同期された BacMam 2.0 試薬 18 h 日 4 回転ディスク共焦点顕微鏡を用いた細胞をイメージしました。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57389/57389fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57389/57389fig2.jpg"> 図 2。PP2A B56γ MEFs で染色体異常が検出される。時間経過顕微鏡ライブ画像処理ノコダゾール野生型と PP2A B56γ MEFs 有糸分裂 (0 51 分) の様々 な時点で。野生型細胞は、PP2A B56γ MEFs 有糸分裂 (下段) を通過することができたに対し中期 (上部パネル) で逮捕されると見つけられました。染色体の遅れや誤偏析は下部のパネルに黄色の矢印で示されて PP2A B56γ MEFs で見ることができます。スケール バー = 5 μ m.<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57389/57389fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

このプロトコルでは、ラベルおよび Histone2B GFP BacMam 2.0 ラベルおよび回転のディスク共焦点顕微鏡システム使用して分裂期の細胞で生きている染色体の視覚化に簡単で便利な方法について説明します。

細胞分裂時の染色体分配の生きているセルイメージ投射

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

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9.2K ビュー.  US Food and Drug Administration. このプロトコルでは、ラベルおよび Histone2B GFP BacMam 2.0 ラベルおよび回転のディスク共焦点顕微鏡システム使用して分裂期の細胞で生きている染色体の視覚化に簡単で便利な方法について説明します。

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Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;蛹アイ

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

発生生物学

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

共焦点イメージングは​​、シロイヌナズナの花の開発のライブ

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted reproduction also allows for the production of embryos from high performers without interrupting their sports career and contributes to an increase in the number of foals from mares of high genetic value. The present manuscript describes the procedures used for collecting immature and mature oocytes from horse ovaries using ovum pick-up (OPU). These oocytes were then used to investigate the incidence of aneuploidy by adapting a protocol previously developed in mice. Specifically, the chromosomes and the centromeres of metaphase II (MII) oocytes were fluorescently labeled and counted on sequential focal plans after confocal laser microscope scanning. This analysis revealed a higher incidence in the aneuploidy rate when immature oocytes were collected from the follicles and matured in vitro compared to in vivo. Immunostaining for tubulin and the acetylated form of histone four at specific lysine residues also revealed differences in the morphology of the meiotic spindle and in the global pattern of histone acetylation. Finally, the expression of mRNAs coding for histone deacetylases (HDACs) and acetyl-transferases (HATs) was investigated by reverse transcription and quantitative-PCR (q-PCR). No differences in the relative expression of transcripts were observed between in vitro and in vivo matured oocytes. In agreement with a general silencing of the transcriptional activity during oocyte maturation, the analysis of the total transcript amount can only reveal mRNA stability or degradation. Therefore, these findings indicate that other translational and post-translational regulations might be affected.
Overall, the present study describes an experimental approach to morphologically and biochemically characterize the horse oocyte, a cell type that is extremely challenging to study due to low sample availability. However, it can expand our knowledge on the reproductive biology and infertility in monovulatory species.

This manuscript describes an experimental approach to morphologically and biochemically characterize horse oocytes. Specifically, the present work illustrates how to collect immature and mature horse oocytes by ultrasound-guided ovum pick-up (OPU) and how to investigate chromosome segregation, spindle morphology, global histone acetylation, and mRNA expression.

馬の卵母細胞における染色体分離、ヒストンアセチル化およびスピンドル形態の解析

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

長期のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アイディスク

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

マウスにおけるヒト化骨髄微小環境のバイオエンジニアリングとライブイメージングによるそれらの可視化

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

体外受精卵の Live 細胞イメージング偏光とシロイヌナズナの胚パターン形成の胚珠培養

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

マウス二次口蓋融合のライブイメージング

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic expression. Notch signaling effector Hes1 and the Notch ligand Delta-like1 (Dll1) are expressed in an oscillatory manner in neural stem/progenitor cells. Because the period of the oscillatory expression of these genes is very short (2 h), it is difficult to monitor their cyclic expression. To examine such rapid changes in the gene expression or protein dynamics, fast response reporters are required. Because of its fast maturation kinetics and high sensitivity, the bioluminescence reporter luciferase is suitable to monitor rapid gene expression changes in living cells. We used a destabilized luciferase reporter for monitoring the promoter activity and a luciferase-fused reporter for visualization of protein dynamics at single cell resolution. These bioluminescence reporters show rapid turnover and generate very weak signals; therefore, we have developed a highly sensitive bioluminescence imaging system to detect such faint signals. These methods enable us to monitor various gene expression dynamics in living cells and tissues, which are important information to help understand the actual cellular states.

Neural stem/progenitor cells exhibit various expression dynamics of Notch signaling components that lead to different outcomes of cellular events. Such dynamic expression can be revealed by real-time monitoring, not by static analysis, using a highly sensitive bioluminescence imaging system that enables visualization of rapid changes in gene expressions.

マウス神経新生時のノッチシグナル伝達ダイナミクスのリアルタイム生物発光イメージング

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in molecular and imaging technologies allowed us to gain insights into how biochemical signals influence morphogenetic events. However, it is increasingly evident that apart from biochemical signals, mechanical cues also impact several aspects of cell and tissue growth. The Arabidopsis shoot apical meristem (SAM) is a dome-shaped structure responsible for the generation of all aboveground organs. The organization of the cortical microtubule cytoskeleton that mediates apoplastic cellulose deposition in plant cells is spatially distinct. Visualization and quantitative assessment of patterns of cortical microtubules are necessary for understanding the biophysical nature of cells at the SAM, as cellulose is the stiffest component of the plant cell wall. The stereotypical form of cortical microtubule organization is also a consequence of tissue-wide physical forces existing at the SAM. Perturbation of these physical forces and subsequent monitoring of cortical microtubule organization allows for the identification of candidate proteins involved in mediating mechano-perception and transduction. Here we describe a protocol that helps investigate such processes.

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Here we describe a protocol for live cell imaging of the cortical microtubule cytoskeleton at the shoot apical meristem and monitoring its response to changes in physical forces.

ミクロチューブ細胞骨格の生細胞イメージングと シロイヌナズナの 微小機械的操作

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin rods are a hallmark of a conserved, inducible Actin Stress Response (ASR) that accompanies human pathologies, including neurodegenerative disease. Previously, we showed that the ASR contributes to morphogenesis failures and reduced viability of developing embryos. This protocol allows the continued study of mechanisms underlying actin rod assembly and the ASR in a model system that is highly amenable to imaging, genetics and biochemistry. Embryos are collected and mounted on a coverslip to prepare them for injection. Rhodamine-conjugated globular actin (G-actinRed) is diluted and loaded into a microneedle. A single injection is made into the center of each embryo. After injection, embryos are incubated at elevated temperature and intranuclear actin rods are then visualized by confocal microscopy. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments may be performed on the actin rods; and other actin-rich structures in the cytoplasm can also be imaged. We find that G-actinRed polymerizes like endogenous G-actin and does not, on its own, interfere with normal embryo development. One limitation of this protocol is that care must be taken during injection to avoid serious injury to the embryo. However, with practice, injecting G-actinRed into Drosophila embryos is a fast and reliable way to visualize actin rods and can easily be used with flies of any genotype or with the introduction of other cellular stresses, including hypoxia and oxidative stress.

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The goal of this protocol is to inject Rhodamine-conjugated globular actin into Drosophila embryos and image intranuclear actin rod assembly following heat stress.

ライブ熱ストレスショ ウジョウバエ 胚における核内アクチンロッドのイメージング

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...