أجريت في المعهد من تحويلي بيو-الجزيئات (WPI-إيتبم) من جامعة ناغويا مجهرية في هذا العمل وتدعمه "شبكة العلوم النباتية المتقدمة اليابان". هذا العمل كان تدعمها المنح من اليابان وكالة العلوم والتكنولوجيا (مشروع ايراتو T.H. وم) ومن "الجمعية اليابانية" "تعزيز العلوم": معونات "البحث العلمي" في "مجالات مبتكرة" (غ. JP24113514، JP26113710، JP15H05962، و JP15H05955 م، ونص. JP16H06465 و JP16H06464 و JP16K21727 ل T.H)، معونات للعلماء الشباب (ب، غ. JP24770045 و JP26840093 م)، ومعونات "البحوث الاستكشافية" الصعبة (رقم JP16K14753 عن م).

1. إعداد من "مستنبت Ovule في المختبر" <ol><li>جعل الوسط السائل لثقافة أوفولي في المختبر (&#34; المتوسطة N5T &#34;) الذي يحتوي على 1 x Nitsch القاعدية الملح المخلوط، 5% (w/v) تريهالوسي ثنائي هيدرات، 0.05 % (w/v) 2-(ن-morpholino) حمض اثانيسولفونيك (مس)-كوه (5.8 درجة الحموضة)، و 1 x Gamborg &#39; حل فيتامين s-</li>
	<li>ضبط درجة الحموضة إلى 5.8 مع كوه.</li>
	<li>تعقيم المتوسطة بالتعقيم (121 درجة مئوية، 20 دقيقة)، أو التصفية فإنه من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر. 
	ملاحظة: يمكن تخزين متوسطة معقمة عند 4 درجة مئوية لمدة 2-3 أشهر.</li>
</ol> 2. إعداد الجهاز الصفيف ميكروبيلار PDMS <ol><li>قطع الجهاز ميكروبيلار PDMS سكين أو شفرة حلاقة أو مقص لتناسب الجزء الزجاج (14 مم φ) صحن أسفل الزجاج 35 مم- 
	ملاحظة: يرد وصف للإجراءات الكاملة لبناء جهاز PDMS في الورقات السابقة 8 ، 9، وهكذا يتم حذف التفاصيل هنا. أطباق الزجاج السفلي مع أحجام أصغر، مثل لوحات 4-جيدا أو 96-جيدا، يمكن أن تستخدم لتصوير قصيرة الأجل دون الجهاز.</li>
	<li>تعقيم الجانب العلوي من الجهاز PDMS تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية على 15 دقيقة</li>
	<li>تشغيل الجهاز PDMS استولت عليها استخدام الملقط نصيحة مربعة، وإبقائه تحت الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة لمدة 15 دقيقة لتعقيم الأسفل.</li>
	<li>نقل الجهاز PDMS معقمة في طبق ثقافة 35 ملم وإضافة المتوسطة N5T حتى الجهاز هو تماما غارقة في الأجل المتوسط (حوالي 5-7 مل)-</li>
	<li>وضع الطبق في فراغ غرفة، والحد من الضغط ديغا. تبقى كنس ل 3 (ح) بين عشية وضحاها حتى يتم استبدال الهواء في الجهاز بواسطة. 
	ملاحظة: يمكن فصل الجهاز بفقاعات الهواء تحت فراغ قوية.</li>
	<li>تأخذ الجهاز من الطبق خلال عقد مع ملاقط نصيحة مربعة ووضعها على منشفة ورقية لإزالة وسيلة إضافية على الجانب السفلي- 
	ملاحظة: لا يجب إزالة المتوسطة في الصفيف ميكروبيلار (السطح العلوي) لأن هذا سوف تستخدم لزراعة أبل.</li>
	<li>نقل الجهاز على زجاج شريحة 76 ملم × 26 مم، وضمان للحفاظ على جزء ميكروبيلار كالجانب العلوي، ويشمل الجهاز مع غطاء صحن الثقافة 35 ملم للحيلولة دون المتوسط من الجفاف أثناء استخراج ovule التالية.</li>
</ol> 3. تشريح خردلة واستخراج أوفولي <ol><li>تعقيم إبرة (0.40 مم ز) وملاقط غرامة بالمسح مع الإيثانول 70%. الإبرة هو التعامل معها بسهولة عن طريق إرفاق ذلك بعصا المحاقن أو الخشب.</li>
	<li>التحقق من نورات المصنع، وحدد سيليكويس السليم للتجربة. سيليكويس مم تقريبا 5 يتضمن zygotes، وسيليكويس 8-10 مم وتشمل الأجنة كروي الشباب-</li>
	<li>المكوس سيليكويس باستخدام الملقط، ووضعها على وجهي الشريط على زجاج شريحة 76 × 26 مم. يتضمن خردلة واحدة حول البويضات 40-60، و 3-4 سيليكويس (أي، البويضات 120-240) غير كافية لجهاز واحد.</li>
	<li>فتح خردلة (جدار المبيض) لرؤية البويضات داخل باستخدام إبرة معقمة وملاقط تحت ستيريوميكروسكوبي. قص الجدار المبيض فقط حتى أن لم تكن معطوبة البويضات.</li>
	<li>نقل خردلة تم فتحها في المتوسط N5T على الجهاز PDMS (أعد الخطوة 2.7)، وإطلاق سراح البويضات في المتوسط بإبرة أو بالملقط.</li>
	<li>وضع كوب غطاء صغيرة (18 ملم × 18 ملم) على الجهاز PDMS لدفع البويضات في المساحات في الصفيف ميكروبيلار.</li>
	<li>تقلع زجاج الغطاء عن طريق سحب أفقياً باستخدام الملقط أو الأصابع لإزالة متوسطة إضافية.</li>
	<li>اقلب الجهاز PDMS ووضعه في طبق زجاج-أسفل 35 ملم واضغط قليلاً الجهاز عن طريق دفع استخدام الملقط مربع تلميح إلى التمسك بها للزجاج-</li>
	<li>المتوسطة من أجل N5T برفق في الزجاج-الأسفل طبق بالصب زجاجة متوسطة حتى الجهاز PDMS هو تماما غارقة في الأجل المتوسط، وختم الطبق مع الفيلم البارافين. 
	ملاحظة: يمكن أن يكون الجهاز PDMS المعاد تدويره، ولكن يتم فصل الأجهزة التي قديمة جداً بسهولة من أسفل الزجاج. بالإضافة إلى ذلك، قد تطفو الجهاز إذا لم يطرد تماما في الخطوة 2، 5 أو المتوسطة يسكب بسرعة كبيرة جداً-</li>
</ol> <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig2.jpg"/> رقم 2: الإجراء التخطيطي لإعداد نموذج. 
ويناظر هذا التدفق التخطيطي الخطوات 3.5 إلى 4.1. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55975/55975fig2large.jpg" target="_blank"> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
 4-"الوقت الفاصل بين التصوير" <ol><li>مكان الطبق أسفل الزجاج الذي تم إعداده في الخطوة 3، 9 على مجهر مقلوب، وحدد البويضات المناسبة للتركيز على- 
	ملاحظة: نظراً لاختلاف البويضات في مرحلة والموقف والاتجاه، ينبغي إيجاد البويضات مناسب عن طريق فحص هذه الأسفار ماركر.</li>
	<li>بدء تصوير العيش وفقا للشركة المصنعة &#39; s تعليمات نظام المجهر. 
	ملاحظة: المعدات مجهر والمعلمات متنوعة، وهكذا ينبغي أن المستخدمين اختيار الإعدادات المناسبة التي تلائم الغرض التجربة. على سبيل مثال، يتم سرد الإعدادات المستخدمة في هذه المخطوطة في الجدول 1-</li>
</ol> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td>معدات/إعداد</td> <td>الشكل 3 (أ) وتكميلية كليب 1 و 4</td> <td> الشكل 3 (ب) والتكميلي فيديو 2</td> <td>تكميلية الفيديو 3</td></tr> <tr><td>مجهر</td> <td>مسح ليزر مقلوب المجهر (A1R MP)</td> <td>القرص الغزل المجهر المقلوب [كنفوكل] (الاتحاد الاجتماعي المسيحي-W1)</td> <td> نوع مربع مقلوب نظام المجهر [كنفوكل] مع غرفة حضانة ثابتة (CV1000)</td></tr> <tr><td>ليزر</td> <td>Ti:sapphire femtosecond نبض الليزر</td> <td>الليزر LD 488-شمال البحر الأبيض المتوسط، وشمال البحر الأبيض المتوسط-561</td> <td>الليزر LD 488-شمال البحر الأبيض المتوسط، وشمال البحر الأبيض المتوسط-561</td></tr> <tr><td>س عدسة المرحلية</td> <td>40 × عدسة الهدف غمر المياه (NA = 1.15) مع الغمر المتوسطة</td> <td>60 × سيليكون النفط غمر عدسة الهدف (نا = 1.30)، شنت على محرك تركيز بيزو</td> <td>عدسة الهدف X 40 (NA = 0.95)</td></tr> <tr><td>كشف أو</td> <td>الخارجية PMT جاسب غير ديسكانيد للكشف عن</td> <td>الكاميرا امككد</td> <td>كاميرا امككد</td></tr> <tr><td>مرآة ديتشرويك</td> <td>DM495 و DM560</td> <td>DM488/561</td> <td>DM400-410/488/561</td></tr> <tr><td>تصفية</td> < td > الفرقة-تمرير مرشحات؛ 534/30 نانومتر و 578/105 نانومتر</td> <td>مرشحات تمرير الفرقة؛ 520/35 نانومتر، و 593/46 نانومتر</td> <td>مرشحات تمرير الفرقة؛ 520/50 نانومتر و 617/73 نانومتر</td></tr> <tr><td>الشريحة على طول محور ع</td> <td>z 31-مداخن مع فواصل 1 ميكرومتر</td> <td>مكدسات z 17 مع 3 ميكرومتر في جملة فاليه</td> <td>مكدسات ض 7 مع فترات 5-ميكرومتر</td></tr> <tr><td>الفاصل الزمني</td> <td>دقيقة 20</td> <td>دقيقة 5</td> <td>دقيقة 10</td></tr></tbody></table> الجدول 1: نظم مجهر والإعدادات المستخدمة في هذه المخطوطة. 
المجاهر والمعلمات المتنوعة، وهكذا ينبغي أن يختار كل مستخدم نظام مناسب للتجربة-
<ol start="3"> <li>التحقق من تسلسل الصورة المكتسبة، وتحويله إلى تنسيق الفيلم عامة، مثل.avi أو موف للعرض التقديمي. 
	ملاحظة: إذا كان لا يمكن إخراج البرنامج مجهر الصور كتنسيق فيلم، من الممكن لحفظ الصور ك.tif ثم فتح لهم في إيماجيج، أحد برامج مصدر مفتوح مستوحاة من صورة المعاهد الوطنية للصحة، تغيير نوع الملف. إيماجيج يرد على: https://imagej.nih.gov/ij/. يمكن أيضا استخدام إيماجيج لجعل Z-sالثنية الفيلم، مثل إسقاط أقصى حدة، كما هو موضح في: https://imagej.net/Z-functions-</li>
</ol>

<ol>
	<li>Natesh, S., Rau, M. A., Johri, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Embryology of Angiosperms. , 377-443 (1984).</li><li>Kranz, E., Lorz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fertilisation+of+maize+by+single+egg+and+sperm+cell+protoplast+fusion+mediated+by+high+calcium+and+high+pH.">In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH.</a> Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).</li><li>Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+in+vitro+fertilization+system+in+rice+(Oryza+sativa+L.).">Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.).</a> Planta. 226 (3), 581-589 (2007).</li><li>Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+double+fertilization+in+Nicotiana+tabacum+(L.):+the+role+of+cell+volume+in+cell+fusion.">In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion.</a> Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).</li><li>Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+double+fertilization+and+the+cell+cycle+in+male+and+female+gametes+of+tobacco.">Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco.</a> Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).</li><li>Costa, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+cell-derived+peptides+regulate+early+embryo+patterning+in+flowering+plants.">Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants.</a> Science. 344 (6180), 168-172 (2014).</li><li>Sauer, M., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+of+Arabidopsis+embryos+within+their+ovules.">In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules.</a> Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).</li><li>Gooh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+and+optical+manipulation+of+Arabidopsis+early+embryogenesis.">Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis.</a> Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).</li><li>Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microcage+arrays+to+fix+plant+ovules+for+long-term+live+imaging+and+observation.">Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation.</a> Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).</li><li>Kimata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+dynamics+control+the+first+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis+zygote.">Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).</li><li>Nambo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Synthetic+Chemistry+and+Live-Cell+Imaging+Identified+a+Rapid+Cell+Division+Inhibitor+in+Tobacco+and+Arabidopsis+thaliana.">Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).</li><li>Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+with+longer+wavelength+excitation+in+intact+Arabidopsis+tissues.">Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues.</a> Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

ويدخل هذه المخطوطة بسيطة في المختبر ovule زراعة بروتوكول فعال للاستخدام في تصوير خلية يعيش وضع zygotes والأجنة.
قد تحتاج إلى تصميم الجهاز PDMS الأمثل وفقا لمرحلة الجنين. كان الجهاز المتقدمة أول مجموعة ميكروكاجي لضبط الاتجاه وتحديد الموقف من البويضات9، وثم تم بناء جهاز ميكروبيلار فخ البويضات أكثر كفاءة8. وعلاوة على ذلك، ميكروبيلارس أرق وأخف من ميكروكاجي، وبالتالي لا تمنع التوسع ovule أثناء المراقبة الطويلة الأجل. يمكن أن تعقد هذا الجهاز ميكروبيلار أبل لأيام عدة، بدءاً من مرحلة زيجوتيك حتى المرحلة الجنينية قلب8. في نهاية المطاف، بيد ذروة ovule تماما موسع يتجاوز ارتفاع ميكروبيلار، وهكذا فإنه يدفع الجهاز بعيداً. ولذلك، ينبغي تعديل الارتفاع والتباعد ميكروبيلارس إذا الأجنة مرحلة لاحقة يتم التركيز.
لأنه يتم وضع في أبل في الجزء السفلي من الطبق، يجب أن تستخدم مجهر مقلوب. مجهر [كنفوكل] كافية لرصد نمط انقسام الخلايا كما هو موضح في الشكل 3 (ب) و تكميلية أشرطة الفيديو 2 و 38،11، ومجهر [كنفوكل] القرص الغزل المهم أن تؤدي على المدى الطويل التصوير دون تلف الخلايا. وفي المقابل، الفحص المجهري إثارة اثنين-فوتون، ومناسبة لتصوير عميق للمعيشة12من الكائنات الحية، من الضروري تصور ديناميات الزيجوت (الشكل 3 ألف و تكميلية الفيديو 1)10داخل الخلايا. ولذلك، من الأهمية بمكان استخدام نظام المجهر مناسب للتجارب.
كما هو موضح في مقدمة و نتائج الممثل، كانت هناك لا الأساليب القائمة التي يمكن رصد ديناميات المعيشة الزيجوت والأجنة النامية في أبل. ولذلك، باستخدام هذا الأسلوب زراعة أبل، وتم توضيح تفاصيل الاستقطاب الزيجوت والزخرفة الجنين للمرة الأولى.
هذا الأسلوب المطبق للتجارب الدوائية كما هو موضح في تكميلية الفيديو 3. وعلاوة على ذلك، استخدم هذا نظام التصوير لتقييم آثار المركبات المركبة حديثا على انقسام الخلايا الجنينية11. كان أيضا بنجاح جنبا إلى جنب مع انقطاع الليزر، وهكذا كشفت أن عندما هو أذى الخلية قمي، مشتقات الخلية القاعدية تغيير مصيرهم الخلية لإنتاج جديدة خلية قمي8. ولذلك، مواصلة تطبيق هذا الأسلوب على مختلف المواد والتقنيات ستوفر أدوات قوية لفهم الآليات الجزيئية ل embryogenesis.
لإجراء التصوير بالمدى الطويل مع هذا الأسلوب، هو الخطوة الحاسمة لإعداد علامة نيون محددة ومشرق تسميات الأنسجة المستهدفة و/أو الهياكل. لأن الزيجوت والجنين لاحظ من خلال أوفولي كما هو مبين في الشكل 1، الخلفية إشارات في السويداء والأنسجة ovule الأخرى يمكن أن تحجب الإشارات الحقيقية في الجنين (الشكل 4). وبالإضافة إلى ذلك، للكشف عن إشارة ضعيفة، قوة الليزر المجهر يحتاج إلى زيادة، ولكن هذا يمكن أن يضر ovule أثناء المراقبة الطويلة الأجل. ويبين تكميلية الفيديو 4 أن ليزر عالية الطاقة زادت السيارات-الأسفار في أوفولي، وأخيراً تقلص الكيس الجنين، التي سحقت اقحه. ولذلك، ينبغي إنشاء خط علامة المحددة ومشرق قبل البدء التجربة. وفيما يتعلق بالسطوع العالي، تدتوماتو والبرسيم أفضل من طلب تقديم العروض والتجارة والنقل، على التوالي.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig4.jpg"> 
الشكل 4: أقنعة الإشارات الخلفية الفلورية في Ovule إشارة الجنينية. صورة ovule معربا عن علامات نواة الجنينية (هيستون 2B-تدتوماتو؛ أرجواني) ونواة البشرة (هيستون 2B-البرسيم؛ الأخضر). Ovule كله والجنين قصت تظهر في الجزء العلوي والسفلي الأفرقة، على التوالي. الأسهم تشير إلى موضع الجنين. هو أعرب هيستون 2B-البرسيم ليس فقط في الجنين، ولكن أيضا في أبل كامل، وبالتالي من الصعب العثور على إشارة الجنينية عن طريق ovule. تغيير حجم أشرطة: 50 ميكرون (A) و 10 ميكرومتر (ب). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55975/55975fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

خطة الهيئة الأساسية للكائن الحي يتطور من اقحه أحادي الخلية. في معظم النباتات المزهرة، يولد شعبة زيجوتيك قمي وخلية القاعدية، التي تتطور إلى تبادل لإطلاق النار والجذر، على التوالي1. ولذلك، من المهم أن نفهم كيف يتم تشكيل هيئة النبات أثناء امبريوجينيسيس، ولكن لم يكن هناك أداة فعالة لمراقبة ديناميات zygotes الحية والأجنة مباشرة نظراً لتطورها في أعماق الزهرة. في العديد من أنواع مونوكوت، مثل الذرة والأرز، وأسلوب إخصاب في الأنابيب قد المنشأة2،3. في هذا الأسلوب، عزل الحيوانات المنوية والخلايا البيض تنصهر فيها كهربائياً أو كيميائيا، والخلية التي تم إنشاؤها يمكن أن تتطور إلى مصنع خصبة. ومع ذلك، في مصانع ديكت، يوجد أي في المختبر التسميد أسلوب التي يمكن إنتاج أجنة سليمة، يفترض أنه بسبب حالة عدم مزامنة دورة الخلية الأمشاج الذكور والإناث4،5. وبالإضافة إلى ذلك، يلعب الأنسجة المحيطة بالجنين (السويداء) أدواراً هامة في تنمية الجنين6.
في أنواع ديكت نموذجي، ألف-التمويل، وضعت طريقة زراعة في المختبر بالتركيز على أبل كله، الذي يتضمن كلا من الجنين والسويداء7. استخدمت هذا النظام بنجاح تحليل آثار مختلف الكواشف الكيميائية على امبريوجينيسيس، ولكن أنها ليست مناسبة للوقت الفاصل بين التصوير لأنه يحتوي على معدل منخفض البقاء على قيد الحياة. ولذلك، تم وضع نظام زراعة ovule رواية في المختبر بغية البدء في أقرب وقت مرحلة الزيجوت، وإنتاج النباتات الخصبة في ارتفاع نسبة8. بعد محاكمات مختلفة، أنه تم العثور على تلك الوسيلة نيتش وتريهالوسي تحسن كبير في معدل البقاء على قيد الحياة من البويضات8. وبالإضافة إلى ذلك، لأنه توسع ovule كما أنها تنمو وهكذا كثيرا ما يتحرك بعيداً عن ميدان المراقبة المجهر، وضعت جهاز PDMS لإصلاح في أبل في المتوسط9. تمكين الجهاز PDMS تصوير طويلة الأجل لمدة 3-4 أيام، وكافية لتتبع التنمية من الزيجوت إلى جنينا قلب-مرحلة. باستخدام هذه الطريقة، يصبح من الممكن تصور ديناميات الاستقطاب الزيجوت والجنين الزخرفة، ليس فقط في ظل الظروف العادية، ولكن أيضا حضور مثبطات الكيميائية أو في مختلف الخلفيات متحولة8،10 ،11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig1.jpg"> 
الشكل 1: رسم تخطيطي "علامات نيون المحددة" المستخدمة لتصور زيجوتيس والأجنة من خلال أوفولي. اقحه نبات تتطور إلى جنين في أبل، التي يتم إنشاؤها داخل الزهرة. في هذا المختبر في زراعة النظام، لوحظت الزيجوت والجنين من خلال أبل، وبالتالي من المهم أن تستخدم علامات نيون المحددة التي لم يتم التعبير عن الأنسجة ovule الأخرى. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55975/55975fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

<table width="606">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">Nitsch basal salt mixture</td>
			<td style="width:104px;">Duchefa</td>
			<td style="width:119px;">N0223</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">trehalose dihydrate</td>
			<td style="width:104px;">Wako Pure Chemical</td>
			<td style="width:119px;">206-18455</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">MES</td>
			<td style="width:104px;">Dojindo</td>
			<td style="width:119px;">345-01625</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">Gamborg&#8217;s vitamin solution</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G1019</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">35-mm glass-bottom dish</td>
			<td style="width:104px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">D111300</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">35 mm culture dish</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430588</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">PDMS</td>
			<td style="width:104px;">Dow Corning Co.</td>
			<td style="width:119px;">Sylgard184</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">76 &#215; 26 mm slide glass</td>
			<td style="width:104px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">S1225</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">18 &#215; 18 mm slide glass</td>
			<td style="width:104px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">C018181</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">needle (gauge 0.40mm)</td>
			<td style="width:104px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">NN-2719S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">Immersion medium Immersol W 2010</td>
			<td style="width:104px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">444969-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">A1R MP</td>
			<td style="width:104px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="width:216px;height:84px;">CSU-W1</td>
			<td style="width:104px;">Yokogawa Electric</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">CV1000</td>
			<td style="width:104px;">Yokogawa Electric</td>
			<td style="width:119px;">CV1000-SP84</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro ovule cultivation for live-cell imaging of zygote polarization and embryo patterning in arabidopsis thaliana

في معظم النباتات المزهرة، الزيجوت والجنين مخفية في أعماق نسيج الأم، وهكذا منذ فترة طويلة كان لغزا لكيف تتطور بشكل حيوي؛ على سبيل المثال، كيف اقحه نمطين لإنشاء محور الجسم وكيف يحدد الجنين مصائر خلية مختلفة أثناء تكوين الجهاز. ويصف هذه المخطوطة في المختبر ovule ثقافة أسلوب القيام بتصوير خلية يعيش وضع zygotes والأجنة من نبات التمويل. المتوسط زراعة محسنة يسمح zygotes أو الأجنة في وقت مبكر أن تنمو لتصبح نباتات خصبة. عن طريق الجمع بين ذلك مع جهاز صفيف ميكروبيلار poly(dimethylsiloxane) (PDMS)، يعقد في ovule في المتوسطة السائل في نفس الموضع. هذا التثبيت أمر حاسم لمراقبة ovule نفسه تحت مجهر لعدة أيام من شعبة زيجوتيك إلى أواخر مرحلة الجنين. يمكن استخدام التصوير تعيش الخلية الناتجة لرصد ديناميات الاستقطاب الزيجوت، مثل الهجرة النووية وإعادة ترتيب سيتوسكيليتون، وأيضا توقيت انقسام الخلايا ومواصفات مصير الخلية أثناء الزخرفة الجنين في الوقت الحقيقي. وعلاوة على ذلك، يمكن دمج هذا النظام زراعة ovule مع العلاجات مثبط لتحليل آثار العوامل المختلفة على وضع الجنين والتلاعبات البصرية مثل انقطاع الليزر لدراسة دور خلية خلية الاتصال.

باستخدام هذا النظام زراعة ovule، يمكن تتبع هذا الأسلوب المعيشة ديناميات الاستقطاب الزيجوت والزخرفة الجنين. وهذا يعد إنجازا لأنه كانت هناك لا تقنية لتصور في الوقت الحقيقي سلوك الزيجوت والأجنة، التي كانت مخبأة في عمق النسيج الأم. الشكل 3 ألف و التكميلي فيديو 1 تبين أن تتراكم microtubules (MTs) في اقحه الشباب كحلقة عرضية في منطقة سوبابيكال10. ويحتفظ هذا الخاتم مليون طن بينما اقحه الغضروفي في اتجاه قمي. بعد الانتهاء من استطالة الزيجوت والهجرة النووية إلى منطقة قمي، يختفي الحلبة طن متري والنظام التجاري المتعدد الأطراف تشكل مغزل لفصل الحمض النووي. الشكل 3B و 2 الفيديو تكميلية تبين أن انقسام الخلايا الجنينية كورديناتيلي لتشكيل شكل كروي متناظرة شعاعيا8. ينطبق هذا الأسلوب للتجارب الدوائية. على سبيل المثال، بعد تطبيق مثبطات بلمرة الأكتين (لاترونكولين ب؛ اللات ب) في المتوسط السائل استزراع البويضات المحتوية على الزيجوت، كان يحول دون هجرة النووية القطبية، وهكذا اقحه مقسمة على نحو متماثل أكثر، مما يشير إلى دور خيوط الأكتين على استقطاب الزيجوت (تكميلية الفيديو 3 )10. التصوير الطويلة الأجل للتنمية الجنين يمكن اقتفاء أثر الاتجاه وتوقيت انقسامات الخلية الفردية، مما يعني أن مدة دورة الخلية والهندسة يمكن تحليلها إحصائيا. وفي الواقع، أظهرنا سابقا أن انقسام الخلية من سلالة خلية قمي أسرع من منطقة الخلايا القاعدية8.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig3.jpg"> 
الشكل 3: العيش-التصوير بالاستقطاب الزيجوت والزخرفة الجنين. (أ) مراقبة الوقت الفاصل بين الزيجوت الإعراب عن علامات محددة لنواة (هيستون 2B-تدتوماتو؛ أرجواني) وميكروتوبوليس (النظام التجاري المتعدد الأطراف، TUA6 البرسيم؛ الأخضر). الصور تم الحصول عليها باستخدام مجهر مقلوب المسح الضوئي الليزر (A1R MP). (ب) مراقبة الوقت الفاصل بين الجنين معربا عن علامات لنواة (هيستون 2B-سجفب؛ الأخضر) وغشاء البلازما (بعد الظهر، تدتوماتو-LTI6b؛ والأرجواني). الصور تم الحصول عليها باستخدام مجهر مقلوب [كنفوكل] الغزل-القرص (CSU-W1). وعرضت الصور كصور كحد أقصى-كثافة الإسقاط، والأرقام تشير إلى الوقت (h:min) من الإطار الأول. رؤوس الأسهم والأقواس الصفراء تظهر النواة والحلبة MT عرضية، على التوالي. تشير الأقواس السماوي إلى المغزل (A) ونواة الفاصل (ب). تغيير حجم أشرطة: 10 ميكرون (A) و 30 ميكرومتر (ب). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55975/55975fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

ويصف هذه المخطوطة في المختبر ovule زراعة أسلوب يتيح تصوير خلية يعيش نبات زيجوتيس والأجنة. ويستخدم هذا الأسلوب لتصور ديناميات داخل الخلايا أثناء الاستقطاب الزيجوت وتحديد مصير الخلية في وضع الأجنة.

في المختبر زراعة ovule للتصوير خلايا حية من الاستقطاب الزيجوت والزخرفة الجنين في التمويل نبات

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

in-vitro-ovule-cultivation-for-live-cell-imaging-zygote-polarization

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

10.8K Views.  Nagoya University. ويصف هذه المخطوطة في المختبر ovule زراعة أسلوب يتيح تصوير خلية يعيش نبات زيجوتيس والأجنة. ويستخدم هذا الأسلوب لتصور ديناميات داخل الخلايا أثناء الاستقطاب الزيجوت وتحديد مصير الخلية في وضع الأجنة.

Video: In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

توصيف التوتة تسوية الأسلاف في جنين الفأر عن طريق<em&gt; في فيفو</em&gt; و<em&gt; في المختبر</em&gt; فحوصات

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

التصوير الهياكل التحت خلوية في الأجنة الحية اسماك الزرد

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily conserved structures that compose it are assembled remains under investigation. Their size and physiological features often constrain manipulation and imaging applications. The culture of immortalized cell lines is widely used, but it can only replicate the early steps of differentiation.
Here, we describe a protocol that enables easy genetic manipulation of myofibers originating from primary mouse myoblasts. After one week of differentiation, the myofibers display contractility, aligned sarcomeres and triads, as well as peripheral nuclei. The entire differentiation process can be followed by live imaging or immunofluorescence. This system combines the advantages of the existing ex vivo and in vitro protocols. The possibility of easy and efficient transfection as well as the ease of access to all differentiation stages broadens the potential applications. Myofibers can subsequently be used not only to address relevant developmental and cell biology questions, but also to reproduce muscle disease phenotypes for clinical applications.

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

في المختبر تمايز الناضجة Myofibers للتصوير لايف

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

يعيش متحد البؤر التصوير من تطوير نبات الأرابيدوبسيس الزهور

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

أسلوب لوصف امبريوجينيسيس في نبات

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

تصوير لايف من ماوس الثانوي باليت فيوجن

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and mammalian final host, respectively. The ability to isolate and sustain the different life cycle stages under in vitro culture conditions has greatly facilitated investigations of the cellular, biochemical and molecular mechanisms regulating parasite growth, development and host interactions. Transmission of schistosomiasis requires asexual reproduction and development of multiple larval stages within the snail host; from the infective miracidium, through primary and secondary sporocysts, to the final cercarial stage that is infective to humans. In this paper we present a step-by-step protocol for mass hatching and isolation of Schistosoma mansoni miracidia from eggs obtained from livers of infected mice, and their subsequent introduction into in vitro culture. It is anticipated that the detailed protocol will encourage new researchers to engage in and broaden this important field of schistosome research.

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

This article describes a protocol for the large-scale axenic isolation and collection of free-swimming miracidia of the human blood fluke Schistosoma mansoni and their subsequent processing for introduction into in vitro culture.

العزل الجماعي وزراعة في المختبر من مراحل إينترامولوسكان لحظٌ الدم البشري بلهارسيه المنسونيه

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

تصوير الخلايا الحية لفصل الكروموسومات أثناء الانقسام

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

نقل الاجنه طفيف التوغل والتزجيج الجنيني في مرحله الجنين الأمثل في نموذج الأرنب

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...