Mikroskopie in dieser Arbeit wurde durchgeführt an das Institut der transformativen Biomoleküle (WPI-ITbM) der Universität Nagoya und von Japan Advanced Plant Science Network unterstützt. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von der Japan Science and Technology Agency (ERATO Projekt, t.h. und M.U.) und der Japan Society zur Förderung der Wissenschaften: eine Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung an innovativen Bereichen (Nos. JP24113514, JP26113710, JP15H05962 und JP15H05955 für M.U. und Nos. JP16H06465, JP16H06464 und JP16K21727 für T.H), eine Beihilfe für den wissenschaftlichen Nachwuchs (B, Nos. JP24770045 und JP26840093 für M.U.), und eine Beihilfe für anspruchsvolle Pionierforschung (No. JP16K14753 für M.U.).

1. Vorbereitung des Kulturmediums In vitro- Ovulum <ol><li>machen das flüssige Medium für die in-vitro- Kultur von Ovulum (&#34; N5T Medium &#34;) mit 1 X Nitsch basale Salzgemisch, 5 % (w/V) Trehalose Dihydrat, 0,05 % (w/V) 2-(N-Morpholino) Ethanesulfonic Säure (MES)-KOH (pH-Wert 5,8), und 1 X Gamborg &#39; s Vitamin Lösung.</li>
	<li>Einstellen den pH-Wert 5,8 mit KOH.</li>
	<li>Sterilisieren dem Medium durch Autoklavieren (121 ° C, 20 min) oder durch einen 0,22-µm-Filter filtern. 
	Hinweis: Das sterilisierte Medium kann bei 4 ° C für ca. 2-3 Monate gespeichert werden.</li>
</ol> 2. Vorbereitung des Geräts PDMS Micropillar Array <ol><li>schneiden die PDMS Micropillar Gerät durch ein Messer, Schere, passen in das Glasteil (14 mm φ) ein 35 mm Glasboden Teller oder Rasierklinge. 
	Hinweis: Das gesamte Verfahren der PDMS-Gerätekonstruktion ist in früheren Papiere 8 , 9 beschrieben und somit die Details sind hier weggelassen. Glasboden Gerichte mit kleineren Stückzahlen, z. B. 4-Brunnen oder 96-Well-Platten, können für kurzfristige Bildgebung ohne das Gerät verwendet werden.</li>
	<li>Sterilisation der Oberseite des Geräts PDMS unter UV-Licht für 15 min.</li>
	<li>PDMS Gerät durch quadratische Spitze Pinzette, und halten Sie es unter UV-Licht für 15 min auf die Unterseite zu sterilisieren.</li>
	<li>Übertragen die sterilisierte PDMS-Gerät in einer Kulturschale 35 mm und das N5T Medium hinzufügen, bis das Gerät vollständig in das Medium (ca. 5-7 mL) getränkt ist.</li>
	<li>Setzen Sie die Schale in eine Vakuumkammer und reduzieren Sie den Druck zu entgasen. Halten Sie für 3 h über Nacht, bis die Luft in das Gerät durch Medium ersetzt wird Staubsaugen. 
	Hinweis: Das Gerät kann durch Luftblasen unter einen starken Unterdruck abgenommen werden.</li>
	<li>Bringen Sie das Gerät aus der Schale, indem Sie es mit einer Pinzette quadratische Spitze halten und legte es auf ein Papiertuch, das zusätzliche Medium auf der Seite und unten entfernen. 
	Hinweis: das Medium im Micropillar-Array (Oberseite) sollte nicht entfernt werden, da dies für das Ovulum Anbau verwendet werden.</li>
	<li>Übertragen Sie das Gerät auf eine 76 mm x 26 mm Folie Glas, Gewährleistung den Micropillar Teil als die Oberseite zu halten und decken Sie das Gerät mit 35 mm Kultur Schale Deckel um das Medium vor dem Austrocknen während der folgenden Ovulum Extraktion zu verhindern.</li>
</ol> 3. Schote Dissektion und Ovulum Extraktion <ol><li>sterilisieren eine Nadel (0,40 mm G) und feinen Pinzette durch Abwischen mit 70 % Ethanol. Die Nadel ist leicht durch Anhängen an eine Spritze oder Holz-Stick behandelt.</li>
	<li>Der Blütenstand der Pflanze zu überprüfen, und wählen Sie die richtige Siliques für das Experiment. Die ca. 5 mm Siliques enthalten Zygoten, und 8-10 mm Siliques junge Kugelsternhaufen Embryonen.</li>
	<li>Verbrauchsteuern des Siliques mit Hilfe einer Pinzette und legen Sie sie auf doppelseitigem Klebeband auf das Glas der Folie 76 x 26 mm. Eine Schote enthält etwa 40-60 Samenanlagen und 3-4 Siliques (d. h. 120-240 Eizellen) sind ausreichend für ein Gerät.</li>
	<li>Öffnen Sie die Schote (Eierstock Wand) um zu sehen, die Eizellen im Inneren mit den sterilisierten Nadel und Pinzette unter einem Stereomikroskop. Nur die Eierstock Wand geschnitten, so dass die Eizellen nicht beschädigt werden.</li>
	<li>Übertragen die geöffneten Schote in das N5T Medium auf dem PDMS-Gerät (in Schritt 2.7 vorbereitet), und lassen Sie Ovula in das Medium mit der Nadel oder Pinzette.</li>
	<li>Setzen ein kleines Cover-Glas (18 x 18 mm) auf das PDMS-Gerät, drücken Sie die Eizellen in die Räume im Micropillar-Array.</li>
	<li>Das Deckglas abzunehmen, ziehen sie horizontal mit Fingern oder Pinzette, um zusätzliche Mittel zu entfernen.</li>
	<li>Der PDMS-Gerät umdrehen, legen Sie sie in eine 35 mm Glasboden Schale und leicht drücken Sie das Gerät durch Drücken der quadratische Spitze Pinzette, um es auf das Glas kleben.</li>
	<li>Pour N5T Medium sanft in den Glasboden Schale durch die mittlere Flasche umfüllen, bis das PDMS-Gerät komplett in das Medium eingeweicht wird, und versiegeln Sie die Schale mit Paraffin Film. 
	Hinweis: Das PDMS-Gerät kann recycelt werden, aber Geräte, die zu alt sind werden einfach losgelöst von den Glasboden. Darüber hinaus kann das Gerät schweben wenn es nicht völlig im Schritt 2.5 entgast ist oder das Medium ist zu schnell gegossen.</li>
</ol> <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig2.jpg" /> Abbildung 2: Schematische Vorgehensweise zur Probenaufbereitung. 
Diese schematische Strömung entspricht Schritte 3,5 bis 4,1. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55975/55975fig2large.jpg" target="_blank"> Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
 4. Time-Lapse Imaging <ol><li>die Glasboden Gericht, das vorbereitet wurde in Schritt 3,9 auf einem inversen Mikroskop, und wählen Sie geeignete Eizellen zu konzentrieren auf. 
	Hinweis: Da die Eizellen im Stadium, Position und Richtung variieren, geeignete Eizellen gefunden werden sollte durch die Überprüfung ihrer Marker Fluoreszenz.</li>
	<li>Starten Sie den live-Imaging nach Angaben des Herstellers &#39; s Anweisungen des Mikroskops Systems. 
	Hinweis: Die Mikroskop-Ausrüstung und Parameter sind vielfältig, und so sollten die Benutzer wählen die richtigen Einstellungen, die dem Experiment Zweck passen. Als Beispiel, die Einstellungen in dieser Handschrift sind in Tabelle 1 aufgeführten.</li>
</ol> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td>Ausstattung/Einstellung</td> <td>Abbildung 3 (A) und ergänzende Videos 1 und 4</td> <td> Abbildung 3 (B) und ergänzende Video 2</td> <td>zusätzliche Video-3</td></tr> <tr><td>Mikroskop</td> <td>Laserscanning - Mikroskop (A1R MP) invertiert</td> <td>rotierende Festplatten konfokale inversen Mikroskop (CSU-W1)</td> <td> kastenförmigen invertiert confocal Mikroskop-System mit einer stabilen Inkubation Kammer (CV1000)</td></tr> <tr><td>Laser</td> <td>Femtosekundenlaser Puls Exklusivrepräsentation</td> <td>488 nm und 561 nm LD Laser</td> <td>488 nm und 561 nm LD Laser</td></tr> <tr><td>O Bjective Objektiv</td> <td>40 X Objektiv eintauchen in Wasser (NA = 1,15) mit Immersion Medium</td> <td>60 X Silikon-Öl-Immersion-Objektiv (NA = 1,30), montiert auf einem Piezo Fokustrieb</td> <td>40 X Objektiv (NA = 0,95)</td></tr> <tr><td>erkennen oder</td> <td>externen nicht descanned GaAsP PMT Detektor</td> <td>EMCCD Kamera</td> <td>EMCCD Kamera</td></tr> <tr><td>dichroitischen spiegeln</td> <td>DM495 und DM560</td> <td>DM488/561</td> <td>DM400-410/488/561</td></tr> <tr><td>Filter</td> < td > Bandpass-Filter; 534/30 nm und 578/105 nm</td> <td>Bandpass-Filter; 520/35 nm und 593/46 nm</td> <td>Bandpass-Filter; 520/50 nm und 617/73 nm</td></tr> <tr><td>Scheibe Achse</td> <td>31 Z-Stapel mit Abständen von 1 µm</td> <td>inter 17 Z-Stapel mit 3 µm Vals</td> <td>7 Z-Stapel mit Intervallen von 5 µm</td></tr> <tr><td>Zeitintervall</td> <td>20 min</td> <td>5 min</td> <td>10 min</td></tr></tbody></table> Tabelle 1: die Mikroskopsysteme und Einstellungen in diesem Manuskript verwendet. 
Die Mikroskope und Parameter sind vielfältig, und so sollte jeder Benutzer wählen das passende System für das Experiment.
<ol start="3"> <li>die erworbenen Bildsequenz zu überprüfen, und wandelt es in die allgemeine Film-Format wie AVI oder MOV für Präsentation. 
	Hinweis: Wenn die Mikroskop-Software die Bilder als Filmformat ausgeben kann, ist es möglich, die Bilder als TIF speichern und öffnen Sie sie dann in ImageJ, ein open Source Programm inspiriert von NIH Image, um den Dateityp zu ändern. ImageJ versehen ist: https://imagej.nih.gov/ij/. ImageJ kann auch verwendet werden, um ein Z-s zu machenFilm, wie die maximale Intensität Projektion, verstauen, wie beschrieben: https://imagej.net/Z-functions.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Natesh, S., Rau, M. A., Johri, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Embryology of Angiosperms. , 377-443 (1984).</li><li>Kranz, E., Lorz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fertilisation+of+maize+by+single+egg+and+sperm+cell+protoplast+fusion+mediated+by+high+calcium+and+high+pH.">In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH.</a> Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).</li><li>Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+in+vitro+fertilization+system+in+rice+(Oryza+sativa+L.).">Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.).</a> Planta. 226 (3), 581-589 (2007).</li><li>Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+double+fertilization+in+Nicotiana+tabacum+(L.):+the+role+of+cell+volume+in+cell+fusion.">In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion.</a> Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).</li><li>Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+double+fertilization+and+the+cell+cycle+in+male+and+female+gametes+of+tobacco.">Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco.</a> Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).</li><li>Costa, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+cell-derived+peptides+regulate+early+embryo+patterning+in+flowering+plants.">Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants.</a> Science. 344 (6180), 168-172 (2014).</li><li>Sauer, M., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+of+Arabidopsis+embryos+within+their+ovules.">In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules.</a> Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).</li><li>Gooh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+and+optical+manipulation+of+Arabidopsis+early+embryogenesis.">Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis.</a> Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).</li><li>Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microcage+arrays+to+fix+plant+ovules+for+long-term+live+imaging+and+observation.">Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation.</a> Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).</li><li>Kimata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+dynamics+control+the+first+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis+zygote.">Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).</li><li>Nambo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Synthetic+Chemistry+and+Live-Cell+Imaging+Identified+a+Rapid+Cell+Division+Inhibitor+in+Tobacco+and+Arabidopsis+thaliana.">Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).</li><li>Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+with+longer+wavelength+excitation+in+intact+Arabidopsis+tissues.">Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues.</a> Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Manuskript stellt eine einfachen in Vitro Ovulum Anbau-Protokoll, die effizient für den Einsatz in live Cell Imaging Zygoten und Embryonen zu entwickeln ist.
Das Design des Geräts PDMS ggf. Optimierung nach dem Embryonalstadium. Das erste entwickelte Gerät war ein Microcage Array die Ausrichtung anpassen und die Position der Eizellen9zu fixieren, und dann ein Micropillar Gerät wurde gebaut, um Eizellen effizienter trap8. Darüber hinaus die Micropillars sind dünner und weicher als ein Microcage, und somit nicht daran hindern, Ovulum Expansion während der Langzeit-Beobachtung. Dieses Micropillar Gerät kann ein Ovulum tagelang von der zygotic Bühne bis das embryonale Herz Stufe8halten. Letztlich jedoch die Höhe der voll entfalteten Ovulum überschreitet die Micropillar Höhe, und so schiebt er das Gerät entfernt. Daher sollte die Höhe und den Abstand von der Micropillars angepasst werden, wenn später Embryonen im Mittelpunkt stehen.
Da das Ovulum an der Unterseite der Schale befindet, muss einem inversen Mikroskop verwendet werden. Ein confocal Mikroskop ist ausreichend, um die Zellteilung Muster wie in Abbildung 3 b und Ergänzende Videos 2 und 38,11gezeigt zu überwachen und eine rotierende Festplatten confocal Mikroskop ist wichtig, langfristige durchzuführen Bildgebung ohne Beschädigung der Zelle. Im Gegensatz dazu eine Erregung der zwei-Photonen-Mikroskopie geeignet für Tiefe Bildgebung des Lebens ist Organismen12, ist notwendig, die intrazellulären Dynamik der Zygote (Abb. 3A und ergänzenden Video 1)10zu visualisieren. Daher ist es entscheidend, die geeigneten Mikroskopsystem für die Experimente verwenden.
Wie bei der Einführung und Vertreter Ergebnissebeschrieben, gab es keine vorhandenen Methoden, die die lebendige Dynamik der Zygote und entwickeln in das Ovulum Embryo überwachen können. Daher durch die Verwendung dieser Ovulum Anbaumethode, wurden die Details der Zygote Polarisierung und Embryo Musterung zum ersten Mal geklärt.
Dieses Verfahren ist anwendbar für pharmakologische Experimente wie in ergänzenden Video 3dargestellt. Darüber hinaus wurde diese imaging-System zur Bewertung der Auswirkungen der neu synthetisierten Verbindungen auf embryonale Zellteilung11. Es war auch erfolgreich in Kombination mit Laser-Störung und damit gezeigt, dass wenn die apikale Zelle geschädigt ist, die Basalzell-Derivate ihr Schicksal der Zelle ändern um eine neue apikale Zelle8zu produzieren. Daher weitere Anwendung dieser Methode auf verschiedenen Materialien und Techniken werden leistungsfähige Werkzeuge, um zu verstehen, die molekularen Mechanismen der Embryogenese bereitstellen.
Um langfristige Bildgebung mit dieser Methode durchzuführen, ist der entscheidende Schritt, einen spezifischen und hellen fluoreszierenden Marker vorzubereiten, der Etiketten der Zielgewebe und/oder Strukturen. Weil die Zygote und Embryo durch das Ovulum eingehalten werden, wie in Abbildung 1dargestellt, Hintergrund-Signale in das Endosperm und andere Ovulum Gewebe können die true-Signal in den Embryo (Abbildung 4) Maske. Darüber hinaus um ein schwaches Signal zu erkennen, die Laserleistung des Mikroskops erhöht werden muss, aber dies kann das Ovulum Schaden, während der Langzeit-Beobachtung. Zusätzliche Video-4 zeigt, dass die hohe Laserleistung Auto-Fluoreszenz in das Ovulum erhöht, und schließlich verkleinert den Embryo Sac, in dem die Zygote niedergeschlagen wurde. Daher sollte eine spezifische und hellen Markierungslinie hergestellt werden, vor Beginn des Experiments. In Bezug auf höhere Helligkeit sind TdTomato und Klee bzw. besser als RFP und GFP.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig4.jpg"> 
Abbildung 4: Hintergrund Fluoreszenzsignal in Ovulum Masken embryonalen Signal. Bild der das Ovulum die Marker der embryonalen Zellkern (Histon 2 b-TdTomato, Magenta) und den epidermalen Kern (Histon 2 b-Clover; grün) zum Ausdruck zu bringen. Ganze Ovulum und ausgeschnittenen Embryo erscheinen in der oberen und Platten, bzw. zu senken. Pfeile zeigen auf die Position des Embryos. Die Histon-2 b-Klee drückt sich nicht nur im Embryo, sondern auch in das gesamte Ovulum, und so ist es schwierig, das embryonale Signal durch das Ovulum zu finden. Skalieren Sie Bars: 50 µm (A) und 10 µm (B). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55975/55975fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Der Grundkörper Plan eines Organismus entwickelt sich aus einem einzelligen Zygote. Bei den meisten Blütenpflanzen erzeugt zygotic Division eine apikale und eine basale Zelle, die zu dem Shooting und Wurzel, bzw.1zu entwickeln. Daher ist es wichtig zu verstehen, wie der Pflanzenkörper in der Embryogenese gebildet wird, aber es wurde kein wirksames Instrument, um die Dynamik des lebendigen Zygoten und Embryonen direkt zu beobachten, weil sie tief in der Blüte entwickeln. Eine in-vitro- Befruchtung-Methode wurde in mehreren Monocot Arten, wie Mais und Reis etablierten2,3. Bei dieser Methode isolierten Spermien und Eizellen sind verschmolzen, elektrisch oder chemisch, und die generierten Zelle in eine fruchtbare Pflanze entwickeln kann. In Dicot Pflanzen ist jedoch keine in-vitro- Befruchtung Methode, die richtige Embryonen, vermutlich aufgrund der nicht synchronisierten Zellzyklus von männlichen und weiblichen Gameten4,5produzieren kann. Darüber hinaus spielt das Embryo umgebenden Gewebe (Endosperm) eine wichtige Rolle im Embryo Entwicklung6.
In einem Modell Dicot Arten, A. Thaliana, wurde eine in-vitro- Kultivierung Methode entwickelt, durch die Konzentration auf das ganze Ovulum, das den Embryo und Endosperm7enthält. Dieses System wurde erfolgreich verwendet, um die Auswirkungen der verschiedenen chemischen Reagenzien auf Embryogenese analysieren, aber es ist nicht geeignet für Zeitraffer-imaging, weil es eine geringe Überlebensrate hat. Daher wurde eine neuartige in-vitro- Ovulum Anbausystem entwickelt, um so früh wie die Zygote Bühne und fruchtbaren Pflanzen in einem hohen Verhältnis8zu produzieren. Nach verschiedenen Studien wurde festgestellt, dass Nitsch-Medium und Trehalose erheblich verbessert die Überlebensrate der Eizellen8. Da das Ovulum erweitert wird, wie es wächst und so häufig bewegt sich weg vom Feld der Beobachtung des Mikroskops, wurde darüber hinaus ein PDMS Gerät entwickelt, um das Ovulum im mittleren9zu beheben. Das PDMS-Gerät aktiviert die langfristige Imaging für 3-4 Tage, die ausreicht, um die Entwicklung von einer Zygote zu einem Herz-Bühne Embryo zu verfolgen. Mit dieser Methode wird es möglich, die Dynamik der Zygote Polarisation und Embryo-Strukturierung, nicht nur unter normalen Bedingungen, aber auch in Anwesenheit von chemische Inhibitoren oder in verschiedenen mutierten Hintergründe8,10 visualisieren ,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Schematische Darstellung der spezifischen fluoreszierenden Marker verwendet, um zu visualisieren Zygoten und Embryonen durch das Ovulum. Die Arabidopsis Zygote entwickelt sich ein Embryo in das Ovulum, die tief im Inneren der Blume erzeugt wird. In dieser in-Vitro -Anbausystem der Zygote und Embryo durch das Ovulum eingehalten werden, und so ist es wichtig, bestimmte fluoreszierende Marker zu verwenden, die nicht in anderen Ovulum Geweben ausgedrückt werden. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55975/55975fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>

<table width="606">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">Nitsch basal salt mixture</td>
			<td style="width:104px;">Duchefa</td>
			<td style="width:119px;">N0223</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">trehalose dihydrate</td>
			<td style="width:104px;">Wako Pure Chemical</td>
			<td style="width:119px;">206-18455</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">MES</td>
			<td style="width:104px;">Dojindo</td>
			<td style="width:119px;">345-01625</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">Gamborg&#8217;s vitamin solution</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G1019</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">35-mm glass-bottom dish</td>
			<td style="width:104px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">D111300</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">35 mm culture dish</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430588</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">PDMS</td>
			<td style="width:104px;">Dow Corning Co.</td>
			<td style="width:119px;">Sylgard184</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">76 &#215; 26 mm slide glass</td>
			<td style="width:104px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">S1225</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">18 &#215; 18 mm slide glass</td>
			<td style="width:104px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">C018181</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">needle (gauge 0.40mm)</td>
			<td style="width:104px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">NN-2719S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">Immersion medium Immersol W 2010</td>
			<td style="width:104px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">444969-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">A1R MP</td>
			<td style="width:104px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="width:216px;height:84px;">CSU-W1</td>
			<td style="width:104px;">Yokogawa Electric</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">CV1000</td>
			<td style="width:104px;">Yokogawa Electric</td>
			<td style="width:119px;">CV1000-SP84</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro ovule cultivation for live-cell imaging of zygote polarization and embryo patterning in arabidopsis thaliana

In den meisten Blütenpflanzen die Zygote und Embryo sind tief in das Gewebe der Mutter versteckt, und so es ist seit langem ein Rätsel wie sie dynamisch entwickeln; z. B. polarisiert wie die Zygote um Körperachse und wie der Embryo gibt verschiedene Zelle Schicksale während Orgel Bildung zu schaffen. Dieses Manuskript beschreibt eine in-vitro- Ovulum Kultur-Methode ausführen live Cell Imaging Zygoten und Embryonen von Arabidopsis Thalianazu entwickeln. Das optimierte Anbau Medium ermöglicht Zygoten oder frühen Embryonen bis zu fruchtbaren Pflanzen heranwachsen. Durch die Kombination mit einem poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Micropillar Array Gerät, wird das Ovulum in das flüssige Medium in der gleichen Position gehalten. Diese Fixierung ist entscheidend für die gleichen Eizelle unter dem Mikroskop für mehrere Tage aus der zygotic Division Spätstadium Embryo zu beobachten. Das resultierende live-Cell Imaging kann verwendet werden, um die Echtzeit-Dynamik der Zygote Polarisation, wie nukleare Migration und Cytoskelett Neuordnung, und auch das Timing der Zellteilung und Zelle Schicksal Spezifikation beim Embryo Musterung zu überwachen. Darüber hinaus sind diese Ovulum Anbausystem mit Inhibitor Behandlungen, die Auswirkungen verschiedener Faktoren auf die Entwicklung des Embryos zu analysieren und mit optischen Manipulationen wie z. B. Laser-Unterbrechung, die Rolle der Zell-Zell-Kommunikation zu untersuchen kombinierbar.

Durch die Verwendung dieser Ovulum Anbausystem, kann diese Methode die lebendige Dynamik der Zygote Polarisation und Embryo Musterung zurückverfolgen. Dies ist eine Leistung, denn bisher gab es keine Technik zu visualisieren das Echtzeitverhalten der Zygote und Embryo, die tief in das Gewebe der Mutter versteckt sind. Abbildung 3A und ergänzenden Video 1 zeigen, dass die Mikrotubuli (MTs) in die junge Zygote als transversale Ring in der subapikal Region10ansammeln. Diese MT-Ring wird beibehalten, während die Zygote in die apikale Richtung verlängert. Nach der Fertigstellung der Zygote Dehnung und nukleare Migration in der apikalen Region die MT-Ring verschwindet und die MTs bilden eine Spindel um die DNA zu trennen. Abbildung 3 b und ergänzenden Video 2 zeigen, dass embryonale Zellen koordinativ teilen, um eine radial symmetrische kugelige Form8bilden. Dieses Verfahren ist anwendbar für pharmakologische Experimente. Zum Beispiel nach der Anwendung ein Aktin-Polymerisation Inhibitor (Latrunculin B; Lat B) in das flüssige Medium Kultivierung der Zygote-haltigen Eizellen, die polare nuklearen Migration gehemmt wurde und somit die Zygote unterteilt in mehr symmetrische Weise zeigt die Rolle der Aktin-Filament auf die Zygote Polarisation (Supplemental Video 3 )10. Langfristige Darstellung der Entwicklung des Embryos ermöglicht die Rückverfolgung der Richtung und Timing der einzelnen Zellteilungen, was bedeutet, dass die Geometrie und die Zelle Zyklus Dauer statistisch analysiert werden kann. In der Tat haben wir zuvor gezeigt, dass die Zellteilung der apikale Zelle Linie schneller als der basalen Zelle Region8.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Live-Imaging der Zygote Polarisierung und Embryo Musterung. (A) Zeitraffer Beobachtung eine Zygote mit dem Ausdruck spezifischer Marker für den Kern (Histon 2 b-TdTomato, Magenta) und Mikrotubuli (MTs, Klee-TUA6; grün). Die Bilder wurden mit einem Laser-scanning umgekehrtes Mikroskop (A1R MP) erworben. (B) Zeitraffer Beobachtung eines Embryos mit dem Ausdruck Marker für den Kern (Histon 2 b-sGFP; grün) und die Plasmamembran (PM, TdTomato-LTI6b; Magenta). Die Bilder wurden mit einem Spinning-Disk konfokale umgekehrtes Mikroskop (CSU-W1) erworben. Die Bilder wurden als maximale Intensität Projektion von Bildern gezeigt, und die Zahlen geben die Zeit (Trocknungsdauer) ab dem ersten Bild. Pfeilspitzen und gelben Klammern zeigen jeweils den Kern und die transversale MT-Ring. Cyan Klammern kennzeichnen die Spindel (A) und teilende Kern (B). Skalieren Sie Bars: 10 µm (A) und 30 µm (B). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55975/55975fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

Dieses Manuskript beschreibt eine in-vitro- Ovulum Anbaumethode, die live Cell Imaging von Arabidopsis Zygoten und Embryonen ermöglicht. Diese Methode wird genutzt, um die intrazellulären Dynamik während der Zygote Polarisation und die Zelle Schicksal Spezifikation bei der Entwicklung von Embryonen zu visualisieren.

In-vitro- Ovulum Anbau für Live Cell Imaging der Zygote Polarisation und Embryo Musterung in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

in-vitro-ovule-cultivation-for-live-cell-imaging-zygote-polarization

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

10.8K Aufrufe.  Nagoya University. Dieses Manuskript beschreibt eine in-vitro- Ovulum Anbaumethode, die live Cell Imaging von Arabidopsis Zygoten und Embryonen ermöglicht. Diese Methode wird genutzt, um die intrazellulären Dynamik während der Zygote Polarisation und die Zelle Schicksal Spezifikation bei der Entwicklung von Embryonen zu visualisieren.

Serie: In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Charakterisierung von Thymic Einschwingzeit Vorläufern in der Mouse Embryo Verwendung<em&gt; In Vivo</em&gt; Und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily conserved structures that compose it are assembled remains under investigation. Their size and physiological features often constrain manipulation and imaging applications. The culture of immortalized cell lines is widely used, but it can only replicate the early steps of differentiation.
Here, we describe a protocol that enables easy genetic manipulation of myofibers originating from primary mouse myoblasts. After one week of differentiation, the myofibers display contractility, aligned sarcomeres and triads, as well as peripheral nuclei. The entire differentiation process can be followed by live imaging or immunofluorescence. This system combines the advantages of the existing ex vivo and in vitro protocols. The possibility of easy and efficient transfection as well as the ease of access to all differentiation stages broadens the potential applications. Myofibers can subsequently be used not only to address relevant developmental and cell biology questions, but also to reproduce muscle disease phenotypes for clinical applications.

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

In vitro Differenzierung von Mature Muskelfasern für Live - Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

Live-konfokale Bildgebung Entwicklung Arabidopsis Blumen

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

Eine Methode zur Charakterisierung der Embryogenese in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Live Imaging der Maus Sekundärer Gaumen Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and mammalian final host, respectively. The ability to isolate and sustain the different life cycle stages under in vitro culture conditions has greatly facilitated investigations of the cellular, biochemical and molecular mechanisms regulating parasite growth, development and host interactions. Transmission of schistosomiasis requires asexual reproduction and development of multiple larval stages within the snail host; from the infective miracidium, through primary and secondary sporocysts, to the final cercarial stage that is infective to humans. In this paper we present a step-by-step protocol for mass hatching and isolation of Schistosoma mansoni miracidia from eggs obtained from livers of infected mice, and their subsequent introduction into in vitro culture. It is anticipated that the detailed protocol will encourage new researchers to engage in and broaden this important field of schistosome research.

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

This article describes a protocol for the large-scale axenic isolation and collection of free-swimming miracidia of the human blood fluke Schistosoma mansoni and their subsequent processing for introduction into in vitro culture.

Masse isoliert und In-vitro- Kultivierung von Intramolluscan Stadien der menschlichen Blut Fluke Schistosoma Mansoni

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Live Cell Imaging der Segregation der Chromosomen während der Mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

Minimal invasiven Embryotransfer und Embryo-Vitrifizierung auf der Optimal-Botn-Bühne im Kaninchenmodell

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...