This work was supported by the European Research Council (ERG) and EMBO installation (ERG) and by a PhD fellowship from the Funda&#231;&#227;o para a Ci&#234;ncia e Tecnologia (MP).

注：約2 35mm皿または2ライブイメージングの料理なので、計画mattings、解剖、それに応じてコーティングする（ステップ2.6）のための1匹のマウスの利回り十分な筋芽細胞。 10匹の動物 - 筋芽細胞は、シーケンシャル遠心分離し、プレめっきを介して分離されているので、プロトコルは5のバッチで行われるべきです。 動物を対象とするすべての手順は、研究所デMedicina分子と大学ピエールエマリー・キュリーで動物倫理委員会によって承認されました新生児マウス後肢の筋肉の1解剖<ol><li>事前（ 材料表 ）内のすべてのソリューションを準備し、濾過（0.22μmのフィルター）により滅菌します。すべてのメディアが基底膜マトリックス（ 例えば、マトリゲル）を含有する製剤を除き、細胞に添加する前に37℃であることを確認してください。 </li><li> 、湾曲はさみ、ストレートはさみ、定期的な鉗子：解剖材料（1のそれぞれを滅菌しますそして、先の細いピンセット）、70％エタノールでそれらを拭き作業台。 </li><li>筋肉のコレクションのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）5mlで100ミリメートルペトリ皿を準備し、ミンチ工程まで氷上で保管してください。 </li><li>ストレートはさみでP8マウスおよび70％エタノールで皮膚を殺菌 - P6を刎ねます。 </li><li>背中の皮膚の切開部を作成し、それが除去されるまで後肢に向かってゆっくりと引いて、完全に後肢の筋肉組織を露出させます。 </li><li>筋肉を損傷することなく、脂肪組織を除去するために鉗子を使用してください。 </li><li>背側後肢の筋肉を削除するには、伸ばし手足を維持し、かかとの腱を露出するように足を曲げます。静かにスライドさせて上向きに切断することにより、腱から出発し、骨から筋肉を分離するために湾曲したハサミを使用してください。筋肉を切除し、氷冷DPBSに配置します。 </li><li>先の細いピンセットで筋肉をつまんおよび大腿骨または膝関節に損傷を与えることなく、その周りを切断することにより、大腿四頭筋を分離します。</li><li>すべての動物を解剖した後、以下のすべてのステップが実行されるべき無菌層流細胞培養フード、に進みます。 </li></ol> 2.筋芽細胞の単離<ol><li> DPBSの過剰を削除します。均一な塊を得るために、滅菌湾曲鋏で組織をミンチ。 </li><li>消化ミックスの5ミリリットルを使用して50 mLコニカル遠心管中で細分化した組織を収集し、37℃で90分間攪拌しながら、それをインキュベートします。 </li><li>解剖媒体の6ミリリットルを追加することによって、消化を停止し、残りの組織をペレットに75×gで5分間のサスペンションを遠心します。 </li><li>注意深く上清を収集します。 組織破片を収集していないようにしてください 。 5分間350×gで、それを遠心。解剖培地5mLにそれを再懸濁します。 </li><li> 40μmのセルストレーナーを介して細胞懸濁液をフィルタリングします。 &lt;解剖培地25mlを加え、細胞培養インキュベーター中で4時間、150 mmディッシュでそれをpreplate（37℃、5％CO 2/サブ&gt;）の線維芽細胞が付着することを可能にします。 </li><li>室温で1時間の冷IMDMで100：プレプレーティングが、基底膜マトリックスの500μLとコートの料理は1に希釈しました。 DPBSで1回洗浄し、直ちに（ステップ2.8）に細胞をプレーやメッキまで増殖培地で残します。 </li><li>プレプレーティングした後、上清を回収し、10分間、350×gでそれを遠心。 </li><li>増殖培地中でそれを再懸濁し、血球計数器で細胞を数えます。 150,000および250,000細胞が基底膜マトリックスでコーティングしたシャーレごとにメッキされるように、音量を調整します。細胞培養インキュベーター中で細胞を保管してください。 </li></ol> 3.筋線維の分化注：3日後、細胞を、約70％の密集度（ 図1B）で筋管を融合し、形成するために開始する必要があります。 <ol><li>所望であれば、この時点では、関心対象のsiRNAまたはDNAで細胞をトランスフェクトします。細胞は、トランスフェクトされるべきではない場合は、分化培地とスキーに直接変更pが3.4に進みます。 </li><li>製造者の指示に従ってトランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトします。 siRNAの脂質複合体（20 nMの+試薬の1μL）またはDNA-脂質複合体（1μgの+試薬の1μL）で5時間細胞をインキュベートします。必要に応じて、siRNAおよびDNA濃度を最適化します。 </li><li>分化培地で1回洗った後、新しい分化培地に切り替えます。 </li><li>次の日、基底膜マトリックス1を希釈：2を氷冷分化培地中。既存の培地を除去し、各皿に氷のように冷たい行列の200μLを追加します。 </li><li>細胞培養インキュベーター中で30分間インキュベートします。 </li><li>アグリン（100ng / mlの）と分化培地を補完し、慎重に細胞に2 mLを加え。 </li><li>慎重に、常に100 ngの/μLの最終濃度にアグリンで補う、培地の半分ごとに2日を変更します。 </li><li>細胞分化および生存率を監視します。このようなFBSおよびcなどの要因（の種類によって完全な成熟（ 図2）に到達するために10分化さd - hickenは胚芽抽出物起源）、細胞が5間がかかる場合があります。 </li></ol>ガラスボトムディッシュ4.免疫染色<ol><li>免疫染色のために、目的の任意の時点で、DPBSで細胞を1回洗浄し、10分間室温で4％PFAで固定し。 </li><li> DPBSで二回、それらを洗ってください。この時点で、細胞を4℃で保存することができます。 </li><li> RTで5分間、0.5％トリトンX-100でそれらを透過。 </li><li> PBSで2回洗って、室温で30分間ブロッキング溶液でブロックします。 </li><li>ソリューションのO / N、4°Cでブロッキング希釈した一次抗体を用いて、それらをインキュベートします。 </li><li>室温で5分間、DPBSで洗浄3倍。 </li><li>二次抗体と室温で1時間のためのDAPI0.2μgの/ mLでそれらをインキュベートします。 </li><li>室温で5分間、DPBSで洗浄3倍。 </li><li>マウンティング培地200μLを追加し、イメージングに進みます。 </li></ol>

<ol>
	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> J Appl Physiol. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>Manring, H., Abreu, E., Brotto, L., Weisleder, N., Brotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+excitation-contraction+coupling+related+genes+reveal+aspects+of+muscle+weakness+beyond+atrophy-new+hopes+for+treatment+of+musculoskeletal+diseases.">Novel excitation-contraction coupling related genes reveal aspects of muscle weakness beyond atrophy-new hopes for treatment of musculoskeletal diseases.</a> Front Physiol. 5, 37 (2014).</li><li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle.">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).</li><li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Individual+Myofibers+and+their+Satellite+Cells+from+Adult+Skeletal+Muscle.">Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle.</a> J Vis Exp. (73), (2013).</li><li>Meng, H., Janssen, P. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Triage+and+Freezing+for+Models+of+Skeletal+Muscle+Disease.">Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li><li>Demonbreun, A. R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Electroporation,+Isolation+and+Imaging+of+Myofibers.">DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers.</a> J Vis Exp. (106), (2015).</li><li>Falcone, S., Roman, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-WASP+is+required+for+Amphiphysin-2/BIN1-dependent+nuclear+positioning+and+triad+organization+in+skeletal+muscle+and+is+involved+in+the+pathophysiology+of+centronuclear+myopathy.">N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy.</a> EMBO Mol Med. 6 (11), 1455-1475 (2014).</li><li>Flucher, B. E., Phillips, J. L., Powell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dihydropyridine+receptor+alpha+subunits+in+normal+and+dysgenic+muscle+in+vitro:+expression+of+alpha+1+is+required+for+proper+targeting+and+distribution+of+alpha+2.">Dihydropyridine receptor alpha subunits in normal and dysgenic muscle in vitro: expression of alpha 1 is required for proper targeting and distribution of alpha 2.</a> J Cell Biol. 115 (5), 1345-1356 (1991).</li><li>Cooper, S. T., Maxwell, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C2C12+co-culture+on+a+fibroblast+substratum+enables+sustained+survival+of+contractile,+highly+differentiated+myotubes+with+peripheral+nuclei+and+adult+fast+myosin+expression.">C2C12 co-culture on a fibroblast substratum enables sustained survival of contractile, highly differentiated myotubes with peripheral nuclei and adult fast myosin expression.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 58 (3), 200-211 (2004).</li><li>Al-Qusairi, L., Laporte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-tubule+biogenesis+and+triad+formation+in+skeletal+muscle+and+implication+in+human+diseases.">T-tubule biogenesis and triad formation in skeletal muscle and implication in human diseases.</a> Skelet Muscle. 1, 26 (2011).</li><li>Vilmont, V., Cadot, B., Ouanounou, G., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+to+study+mechanisms+of+neuromuscular+junction+development+and+maintenance.">A system to study mechanisms of neuromuscular junction development and maintenance.</a> Development. , (2016).</li><li>Vilmont, V., Cadot, B., Vezin, E., Le Grand, F., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+disruption+perturbs+post-synaptic+components+and+contributes+to+impaired+MuSK+clustering+at+the+NMJ:+implication+in+ALS.">Dynein disruption perturbs post-synaptic components and contributes to impaired MuSK clustering at the NMJ: implication in ALS.</a> Sci Rep. 6, 27804 (2016).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

一次筋芽細胞の培養にこのプロトコルの使用を大幅に筋線維の発達を育む特別なニッチを生じさせます。これはまた、非常に少数で存在する他の細胞型に部分的に起因します。筋芽細胞濃度および培養純度のバランスが達成されなければなりません。良好な細胞培養はまた、培地製剤に使用される製品の品質に依存します。動物源由来すべての製品は、徹底的にテストする必要があります。我々の経験では、消化条件も監視する必要があります。 初代培養のためにいつものように、実験的な変動は、単離された繊維または不死化筋芽細胞を用いた研究に比べて高くすることができます。この変動は、培地、消化成分、マウスの年齢およびサイズ、および培養操作と結果の収集のための時間ポイントの標準化によって減少することができます。それにもかかわらず、複雑なメカニズムをリアルタイムで精査の利点筋線維の開発に必要な大幅に変動欠点を凌駕しています。 このプロトコルは、細胞分化を損なうことなく、インビトロのアプローチの利点を与えます。三和音が形成されており、収縮はカルシウムスパークに結合されるまで、筋線維が成熟します。これらの機能の出力は異なる実験条件でアクセスすることができます。また、プロトコルに作られた多くの技術的なバリエーションが存在し得ます。筋芽細胞は、筋肉の発達に関連する関心の変異を有する新生児マウスから採取することができます。細胞は、異なる分化時点で生化学分析のために溶解され得ます。カルシウムインジケーターは、そのダイナミクスを追跡するために培養物に添加することができます。光遺伝学の構築物は、特定のシグナル伝達経路を強制するか、特定のローカル応答を誘導するために使用することができます。最後に、筋線維は、それらの相互作用を研究するために、他の細胞型と共培養することができます。

骨格筋は、体重1の40％までを構成します。筋肉関連障害は、莫大な健康と経済的負担2を表します。この非常に複雑で組織化組織が、形成され維持され、再生されどのように広範かつ十分に確立された研究分野を構成しています。 6 -特定の科学的関心に応じて、最も適したアプローチは、単純な培養筋管からのin vivoモデル3 における複合体に及ぶことができます。 このプロトコルの目的は、ライブイメージングおよび免疫蛍光を通して筋形成の監視を可能にするin vitroのシステムを提供することです。従来のアプローチと比較すると、このシステムは、マウス筋原プロセスに非常に完全かつダイナミックな洞察を提供しています。細胞は、筋芽細胞の段階から横方向三和音と周辺核7を表示する成熟した、多核筋線維を追跡することができます。この成熟レベルすることができます複雑な刺激または機械的な装置を必要とせず、定期的な細胞培養装置を用いて達成することができます。 試験管内システムにおけるいくつかの成功が我々の知る限り、8,9を報告されているが、これは横方向に小胞体（SR）と対になったT管と成熟したマウスの筋線維を生成する唯一のプロトコルです。したがって、このインビトロ系ではまだ不十分10を理解されトライアド形成の分子メカニズムを研究するために使用することができます。 このシステムを用いることのさらなる利点は、このような抗体、薬物、およびRNAiツールとして検証マウスターゲットリソースの利用可能性です。比較的単純なプロトコルは面倒な手順、高度に熟練した操作、または高価で専用の機器を必要としません。成熟した筋線維は、カルシウムスパーク（未発表データ）に結合された収縮性を表示し、培養分化7の5日後に現れる開始します。 1週間では、さまざまな開発哺乳類の身体の中で最も複雑なセルの一つのアル段階は、 インビトロアッセイの様々な組合せで試験することができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase&#160;type V</td>
			<td>Sigma-Aldrich-Aldrich</td>
			<td>C9263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM, Glutamax supplemented</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31980022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth reduced factor</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>protein concentration of the lot should be around 10mg/ml and endotoxin result should be &#60;1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Embryo Extract</td>
			<td>MP biomedical</td>
			<td>2850145</td>
			<td>it is also possible to prepare in the lab (Danoviz ME, Yablonka-Reuveni Z. Methods Mol Biol (2012))</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant rat agrin</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>550-AG-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>11581831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-150</td>
			<td>used to transfect siRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine LTX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15338-100</td>
			<td>used to transfect DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668030</td>
			<td>used to transfect siRNA plus DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190094&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CVFSVF0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21008-949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorodishes</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td>dishes used to cultivate cells for live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% PFA (Paraformaldehyde)</td>
			<td>Science Services GmbH</td>
			<td>E15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>use at 200ng/ul</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions and Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in DPBS 
			5 mg/ml collagenase 
			3.5 mg/ml dispase 
			sterile filtered, can be stored in working aliquotes for 2 weeks at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in IMDM Glutamax supplemented 
			10% FBS 
			1% Penicillin-Streptomycin 
			sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in IMDM Glutamax supplemented 
			20% FBS 
			1% Chicken Embryo Extract 
			1% Penicillin-Streptomycin1% Penicillin-Streptomycin 
			sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in IMDM Glutamax supplemented 
			2% Horse Serum 
			1% Penicillin-Streptomycin 
			sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in DPBS 
			10% Goat Serum 
			5% BSA 
			add 0.1% saponine when incubating with primary and secondary antibodies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro differentiation of mature myofibers for live imaging

骨格筋は筋繊維、最大の哺乳類の体内の細胞と少数の合胞体の1で構成されています。どのようにそれを構成する複雑かつ進化的に保存された構造が組み立てられていることは調査中のまま。その大きさと生理的機能は、多くの場合、操作およびイメージングアプリケーションを制約します。不死化細胞株の培養物が広く使用されているが、それだけで、分化の初期段階を複製することができます。 ここでは、初代マウス筋芽細胞由来の筋線維の簡単な遺伝子操作を可能にするプロトコルを記述します。分化の1週間後、筋線維は収縮、整列サルコメアと三和音、ならびに末梢核を表示します。全分化プロセスは、ライブイメージングまたは免疫蛍光法によって追跡することができます。このシステムは、既存のex vivoでのおよびin vitroプロトコルにおける利点を兼ね備えています。簡単かつ効率的なトランスフェクションの可能性だけでなく、すべての分化段階へのアクセスの容易さは、潜在的な用途を広げます。筋線維は、その後、関連する発達および細胞生物学の問題に対処するだけでなく、臨床応用のための筋肉疾患の表現型を再現するだけでなく、使用することができます。

筋線維の発達の程度は、主に単離された筋芽細胞の純度および生存率によって決定されます。接着、増殖、および融合能力は、経験的に、これらのパラメータ（ 図1 A、B）にアクセスするために使用することができます。増殖D2では、筋芽細胞が付着している必要があり、典型的な紡錘状の形状を表示する必要があります。増殖は、自発的な筋管形成翌日（ 図1B）につながる、この段階で広範囲に起こると予想されます。 細胞集密度は、微調整が必​​要になる場合があります。筋芽細胞が増殖し、融合する以上の3日間を取る場合は、それを大きくする必要があります。筋線維は、それらの密度まで成長し、比較的まっすぐ伸長する許可されていない場合は、減少させるべきです。最高の筋線維は、外側領域に向かって発見されるべきであるので、密集度は、典型的には、皿の中心部から周辺部に減少しています。 筋管はすぐに複数の中央に整列核（ 図1C）を細長くし、表示されます。 D5によって、いくつかの細胞が光条を取得し、周囲にそれらの核の移動を開始します。成熟した特性を持つ筋線維の数は、時間とともにだけでなく、セル厚（ 図1D）と増加します。 分化の程度は、さらに免疫蛍光によって観察することができます。分化D8存在横断トライアドに固定筋繊維。これは、トライアッド（ 図2）で共局在化することが期待されているT-細管（DPHR）及びSR（triadin）のイメージング成分によって確認することができます。 筋線維の機能は、ライブイメージングによって対処することができます。以降分化D3からは、細胞は、自発的なけいれんを表示します。カルシウムセンサーをトランスフェクションすることにより（ 例えば 、、GCaMP6f 11）は、収縮カルシウムピーク（ 図3）に結合されていることを観察することができます。 このシステムを使用して、我々はそのための革新的な分子療法7のための新規の対象となり得る中心核ミオパシーおよび筋緊張性ジストロフィーで破壊された新規分子経路を特定することができました。我々はまた、神経筋接合部（NMJ）12の開発を研究するために、この方法を適応しています。ラットの脊髄の外植片との共培養を通じ、我々はNMJ形成13におけるダイニンの役割を記載しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig1.jpg" /> 図1： 筋芽細胞文化の発達段階。 A）増殖D2では、筋芽細胞が付着し、増殖し始めています。 prolifではB）eration D3、60の密集度 - 80％に達し、筋芽細胞は、自然に融合し始めます。分化D3においてC）は 、中央に位置する核を含有する筋管が優勢です。以降分化D5（ 例えば、8日目）からD）、筋線維が展示条線と周辺の核を開始し、厚くし始めます。スケールバー：50μmです。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55141/55141fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig2.jpg" /> 図2：D8 筋線維イムノの代表的な共焦点画像。 A）ジヒドロピリジン受容体（DHPR、上部パネル）の免疫染色および（TRDN、中央のパネル）triadin。 DHPR、TRDN、およびDAPIチャンネルのオーバーレイは、トライアドの構成要素の共局在を示しています。 B）<html> A. Cに描かれた黄色の線）αアクチニン（緑）およびDAPI（青）について染色した筋線維のボリュームレンダリングの3D画像の強度プロファイル。スケールバーとグリッド幅：5μmです。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55141/55141fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig3.jpg" /> 図3： 自発けいれんと筋繊維内カルシウムレベルのライブイメージング。けいれんの筋線維中のカルシウムスパークのA）高速タイムラプス（20ミリ秒フレーム）顕微鏡。カルシウムはGCaMP6f（Addgeneプラスミド＃40755）の発現を介して検出されました。パネルA中のカルシウムセンサーの経時的な蛍光強度のB）定量_blank &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

ライブイメージングのための成熟した筋線維のin vitro分化に

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

in-vitro-differentiation-of-mature-myofibers-for-live-imaging

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

10.2K ビュー.  Universidade de Lisboa. Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

ビデオ: In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;蛹アイ

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

発生生物学

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

共焦点イメージングは​​、シロイヌナズナの花の開発のライブ

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

ヒト多能性幹細胞のin vitro分化における絨毛細胞へ

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

長期のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アイディスク

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

体外受精卵の Live 細胞イメージング偏光とシロイヌナズナの胚パターン形成の胚珠培養

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

マウス二次口蓋融合のライブイメージング

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

細胞分裂時の染色体分配の生きているセルイメージ投射

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

別の植物種から茎頂の共焦点のライブ イメージング

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

ショウジョウバエ胚における筋収縮のライブイメージングと解析

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...