Microscopia neste trabalho foi realizada no Instituto de transformadora Bio-moléculas (WPI-ITbM) da Universidade de Nagoya e suportada pelo Japão avançado Plant Science Network. Este trabalho foi financiado por doações do Japão de ciência e tecnologia agência (projeto ERATO T.H. e Magal) e da sociedade do Japão para a promoção da ciência: um subsídio para a investigação científica em áreas inovadoras (n º s. JP24113514, JP26113710, JP15H05962 e JP15H05955 para Magal e n º s. JP16H06465, JP16H06464 e JP16K21727 para Silvia), um subsídio para jovens cientistas (B, n º s. JP24770045 e JP26840093 para Magal) e um subsídio para pesquisa exploratória desafiador (n. º JP16K14753 para Magal).

1. preparação do meio de cultura In Vitro Ovule <ol><li>fazer o meio líquido para o in-vitro cultura ovule (&#34; N5T médio &#34;) contendo 1 x Nitsch basal sal mistura, 5% (p/v) trealose dihidratado, 0.05 % (p/v) 2-(N-Morpholinos) ácido etanesulfónico (MES)-KOH (pH 5,8) e 1 x Gamborg &#39; solução de vitamina s.</li>
	<li>Ajustar o pH a 5.8 com KOH.</li>
	<li>Esterilizar o meio em autoclave (121 ° C, 20 min) ou filtragem através de um filtro de 0,22 µm. 
	Nota: O meio esterilizado pode ser armazenado a 4 ° C durante 2-3 meses.</li>
</ol> 2. Preparação do dispositivo matriz PDMS Micropillar <ol><li>corta o dispositivo de micropillar PDMS por uma faca, lâmina de barbear ou tesoura para se encaixar a parte de vidro (φ 14mm) de um prato de vidro-fundo de 35 mm. 
	Nota: O procedimento completo da construção do dispositivo PDMS é descrito em anterior papéis 8 , 9, e, portanto, os detalhes são omitidos aqui. Pratos de vidro-fundo com volumes menores, tais como placas 4-bem ou 96 poços, podem ser usados para a imagem latente a curto prazo, sem o dispositivo.</li>
	<li>Esterilize o lado superior do dispositivo PDMS sob luz UV de 15 min.</li>
	<li>Rode o dispositivo de PDMS por usando uma pinça de ponta quadrada e mantê-lo sob UV luz por 15 min esterilizar fundo.</li>
	<li>Transferir o dispositivo PDMS esterilizado para uma placa de cultura de 35mm e adicionar o N5T médio até que o dispositivo é completamente embebido no meio (aproximadamente 5-7 mL).</li>
	<li>Colocar o prato em uma câmara de vácuo e reduzir a pressão para desgaseificar. Manter aspiração para 3h durante a noite até que o ar no dispositivo é substituído pelo meio. 
	Nota: O dispositivo pode ser desanexado por bolhas de ar sob um vácuo forte.</li>
	<li>Leve o dispositivo do prato, segurando-o com uma pinça de ponta quadrada e colocá-lo em uma toalha de papel para remover o meio extra na parte lateral e inferior. 
	Nota: O meio na matriz de micropillar (superfície superior) não deve ser removido porque isso será usado para o cultivo do ovule.</li>
	<li>Transferir o dispositivo para um vidro de slide 76 x 26 mm, garantindo para manter a parte de micropillar como o lado superior e cubra o dispositivo com tampa de prato de cultura de 35mm para evitar que o meio de secar durante a extração seguinte do ovule.</li>
</ol> 3. Síliqua dissecação e extração Ovule <ol><li>esterilizar uma agulha (0,40 mm G) e uma pinça bem esfregando com etanol a 70%. A agulha é facilmente manipulada, anexando-o a uma vara de madeira ou seringa.</li>
	<li>Verificar a inflorescência da planta e selecione os siliques adequados para o experimento. Os siliques mm aproximadamente 5 contêm zigotos, e os siliques de 8-10 mm incluem jovens embriões globulares.</li>
	<li>Excisar as siliques usando uma pinça e colocá-los em fita dupla-face em um vidro de slide 76 x 26 mm. Uma síliqua contém cerca de 40-60 óvulos e 3-4 siliques (ou seja, 120-240 óvulos) são suficientes para um dispositivo.</li>
	<li>Abrir a síliqua (parede do ovário) para ver os óvulos dentro usando a agulha esterilizada e pinça sob um estereomicroscópio. Corte apenas a parede do ovário, de forma que os óvulos não estão danificados.</li>
	<li>Transferir a síliqua abriu no meio de N5T no dispositivo de PDMS (preparado na etapa 2.7) e liberar os óvulos no meio de, com a agulha ou pinça.</li>
	<li>Colocar um vidro de tampa pequeno (18 x 18 mm) para o dispositivo PDMS para empurrar os óvulos para os espaços na matriz micropillar.</li>
	<li>Tirar o tampa de vidro, puxando-o na horizontal, usando pinças ou dedos para remover extra médio.</li>
	<li>Rode o dispositivo de PDMS de cabeça para baixo, coloque-o em um prato de vidro-fundo de 35mm e pressione ligeiramente o dispositivo pressionando usando as pinças de ponta quadrada para ficar grudado no vidro.</li>
	<li>Médio N5T Despeje delicadamente no vidro-fundo por decantação o frasco médio até que o dispositivo PDMS é completamente embebido no meio do prato e selar o prato com película de parafina. 
	Nota: O dispositivo PDMS pode ser reciclado, mas dispositivos que são muito velhos são facilmente destacados da parte inferior do vidro. Além disso, o dispositivo pode flutuar se isso não é totalmente desgaseificado na etapa 2.5 ou o meio é derramado demasiado rapidamente.</li>
</ol> <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig2.jpg" /> Figura 2: procedimento esquemático para preparação de amostras. 
Este fluxo esquemático corresponde às etapas 3.5 para 4.1. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55975/55975fig2large.jpg" target="_blank"> clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
 4. tempo-lapso Imaging <ol><li>Coloque o prato de vidro de fundo que foi preparado no passo 3.9 em um microscópio invertido e selecione óvulos apropriados para se concentrar em. 
	Nota: Porque os óvulos variam em palco, posição e direção, óvulos apropriados devem ser encontrados, verificando sua fluorescência marcador.</li>
	<li>Começar a viver de imagem de acordo com o fabricante &#39; instruções de s do sistema microscópio. 
	Nota: O equipamento do microscópio e os parâmetros são diversos, e, portanto, os usuários devem escolher as configurações corretas que cabem para o propósito do experimento. Como exemplo, as configurações usadas neste manuscrito estão listadas na tabela 1.</li>
</ol> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><td><tr>/configuração de equipamentos</td> <td>Figura 3 (A) e suplementar vídeos 1 e 4</td> <td> Figura 3 (B) e 2 de vídeo suplementar</td> <td>suplementar vídeo 3</td></tr> <tr><td>microscópio</td> de <td>varredura a laser microscópio (A1R MP) invertido</td> <td>- disco giratório do microscópio confocal invertido (CSU-W1)</td> <td> caixa-tipo invertido sistema microscópio confocal com uma câmara de incubação estável (CV1000)</td></tr> <tr><td>Laser</td> <td>Ti:sapphire femtosecond laser de pulso</td> <td>488 nm e 561-nm laser LD</td> <td>488 nm e 561-nm laser LD</td></tr> <tr><td>O BJECTIVO lente</td> <td>40 X lente objetiva de imersão de água (at = 1,15) com meio de imersão</td> <td>60 X silicone óleo lente objetiva de imersão (at = 1,30), montado em uma unidade de foco Piezo</td> <td>40 X da lente objetiva (at = 0,95)</td></tr> <tr><td>detectar ou</td> <td>externo não-descanned PMT GaAsP detector</td> <td>câmera EMCCD</td> <td>câmera EMCCD</td></tr> <tr><td>espelho Dichroic</td> <td>DM495 e DM560</td> <td>DM488/561</td> <td>DM400-410/488/561</td></tr> <tr><td>filtro</td> < td > band-pass filtros; 534/30 nm e 578/105 nm</td> <td>filtros passa-banda; 520/35 nm e 593/46 nm</td> <td>filtros passa-banda; 520/50 nm e 617/73 nm</td></tr> <tr><td>fatia ao longo do eixo z</td> <td>z 31 - pilhas com intervalos de 1 µm</td> <td>17 z-pilhas com 3 µm inter Vals</td> <td>7 z-pilhas com intervalos de 5 µm</td></tr> <tr><td>intervalo de tempo</td> <td>20 min</td> <td>5 min</td> <td>10 min</td></tr></tbody></table> tabela 1: O Sistemas de microscópio e configurações usadas neste manuscrito. 
Os microscópios e os parâmetros são diversos, e assim, cada usuário deve escolher o sistema adequado para o experimento.
<ol start="3"> <li>Verifique a sequência de imagem adquirida e convertê-lo para o formato geral do filme, como. avi ou. MOV para apresentação. 
	Nota: Se o software de microscópio não pode saída as imagens como um formato de filme, é possível salvar as imagens como. tif e então abri-los no ImageJ, um programa open source inspirado pela imagem do NIH, para alterar o tipo de arquivo. ImageJ é fornecido em: https://imagej.nih.gov/ij/. ImageJ também pode ser usado para fazer um Z-sDobre o filme, como a projeção de intensidade máxima, conforme descrito em: https://imagej.net/Z-functions.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Natesh, S., Rau, M. A., Johri, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Embryology of Angiosperms. , 377-443 (1984).</li><li>Kranz, E., Lorz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fertilisation+of+maize+by+single+egg+and+sperm+cell+protoplast+fusion+mediated+by+high+calcium+and+high+pH.">In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH.</a> Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).</li><li>Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+in+vitro+fertilization+system+in+rice+(Oryza+sativa+L.).">Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.).</a> Planta. 226 (3), 581-589 (2007).</li><li>Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+double+fertilization+in+Nicotiana+tabacum+(L.):+the+role+of+cell+volume+in+cell+fusion.">In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion.</a> Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).</li><li>Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+double+fertilization+and+the+cell+cycle+in+male+and+female+gametes+of+tobacco.">Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco.</a> Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).</li><li>Costa, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+cell-derived+peptides+regulate+early+embryo+patterning+in+flowering+plants.">Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants.</a> Science. 344 (6180), 168-172 (2014).</li><li>Sauer, M., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+of+Arabidopsis+embryos+within+their+ovules.">In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules.</a> Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).</li><li>Gooh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+and+optical+manipulation+of+Arabidopsis+early+embryogenesis.">Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis.</a> Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).</li><li>Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microcage+arrays+to+fix+plant+ovules+for+long-term+live+imaging+and+observation.">Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation.</a> Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).</li><li>Kimata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+dynamics+control+the+first+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis+zygote.">Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).</li><li>Nambo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Synthetic+Chemistry+and+Live-Cell+Imaging+Identified+a+Rapid+Cell+Division+Inhibitor+in+Tobacco+and+Arabidopsis+thaliana.">Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).</li><li>Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+with+longer+wavelength+excitation+in+intact+Arabidopsis+tissues.">Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues.</a> Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este manuscrito introduz um simples em vitro ovule cultivo protocolo que é eficiente para uso na imagem ao vivo-célula de desenvolvimento de zigotos e embriões.
O design do aparelho PDMS pode precisar de otimização de acordo com a fase de embrião. O primeiro dispositivo desenvolvido era uma matriz de microcage para ajustar a orientação e para corrigir a posição dos óvulos9, e em seguida um dispositivo de micropillar foi construído para interceptar óvulos mais eficientemente8. Além disso, os micropillars são mais finos e macios do que um microcage e, portanto, não impedem a expansão do ovule durante a observação a longo prazo. Este dispositivo micropillar pode segurar um ovule durante vários dias, desde a fase zigóticos até o coração embrionário estágio8. Em última análise, no entanto, a altura do óvulo totalmente expandida excede a altura de micropillar, e assim, empurra o dispositivo fora. Portanto, a altura e o espaçamento do micropillars devem ser ajustadas se posteriormente embriões são o foco.
Porque o óvulo é posicionado no fundo do prato, deve ser usado um microscópio invertido. Um microscópio confocal é suficiente para monitorar o padrão de divisão celular, como mostrado na Figura 3B e suplementar vídeos 2 e 3de8,11, e um disco giratório de microscópio confocal é importante executar a longo prazo imagem sem danos celulares. Em contraste, uma microscopia de dois fotões de excitação, que é apropriada para a imagem latente profunda de viver organismos12, é necessário Visualizar a dinâmica intracelular do zigoto (Figura 3A e 1 de vídeo suplementar)10. Portanto, é fundamental a utilização do sistema de microscópio apropriado para os experimentos.
Conforme descrito na introdução e Resultados de representante, não havia nenhum método existente que pode monitorar a dinâmica da vida do zigoto e embrião desenvolver-se do ovule. Portanto, usando esse método de cultivo do ovule, detalhes de polarização de zigoto e padronização do embrião foram esclarecidos pela primeira vez.
Este método é aplicável para experimentos farmacológicos, como mostrado no vídeo suplementar 3. Além disso, este sistema da imagem latente foi utilizado para avaliar os efeitos dos compostos recentemente sintetizados na divisão de células embrionárias11. Foi combinado também com êxito com o rompimento do laser e, portanto, revelou que, quando a célula apical é prejudicada, os basocelular derivados mudam seu destino de célula para produzir uma nova célula apical8. Portanto, ainda mais a aplicação deste método para vários materiais e técnicas fornecerá ferramentas poderosas para compreender os mecanismos moleculares da embriogênese.
Para realizar a longo prazo de imagem com este método, a etapa crucial é preparar um marcador fluorescente específico e brilhante que rotula os tecidos-alvo e/ou estruturas. Porque o zigoto e embrião são observados através do ovule, conforme mostrado na Figura 1, sinais de fundo no endosperma e outros tecidos do óvulo podem mascarar o verdadeiro sinal no embrião (Figura 4). Além disso, para detectar um sinal fraco, o poder do laser do microscópio precisa ser aumentado, mas isso pode prejudicar o óvulo durante a observação a longo prazo. Suplementar Video 4 mostra que a potência do laser de alta aumentou autofluorescência no óvulo e finalmente encolheu o sac do embrião, em que o zigoto foi esmagado. Portanto, uma linha específica e brilhante marcador deve ser estabelecida antes de iniciar o experimento. Em relação ao brilho mais elevado, tdTomato e trevo são melhores do que o RFP e GFP, respectivamente.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig4.jpg"> 
Figura 4: Fundo sinal fluorescente no Ovule máscaras sinal embrionária. Imagem do óvulo expressando os marcadores do núcleo embrionário (2B-tdTomato de histona; magenta) e o núcleo epidérmico (2B-trevo de histona; verde). Toda ovule e embrião excisado são mostrados na parte superior e inferior painéis, respectivamente. As setas apontam para a posição do embrião. O histona 2B-trevo é expressa não só no embrião, mas também no ovule inteira, e assim é difícil encontrar o sinal embrionário através do ovule. Barras de escala: (A) de 50 µm e 10 µm (B). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55975/55975fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

O plano básico do corpo de um organismo se desenvolve a partir de um zigoto unicelular. Na maioria das plantas de floração, extinta Divisão gera uma apical e uma célula basal, que se desenvolvem na raiz, respectivamente1e atirar. Portanto, é importante entender como o corpo da planta é formado durante a embriogênese, mas lá não tem sido uma ferramenta eficaz para observar diretamente a dinâmica da vida zigotos e embriões porque eles desenvolvem no fundo da flor. Em diversas espécies de plantas, como milho e arroz, um método de fertilização em vitro tem sido estabelecida2,3. Neste método, isolado de esperma e os óvulos são fundidos eletricamente ou quimicamente, e a célula gerada pode evoluir para uma planta fértil. No entanto, em plantas de dicot, não há nenhum in vitro método de fertilização que pode produzir embriões adequados, presumivelmente por causa do estado do ciclo de pilha não-sincronizadas de gâmetas masculinos e femininos4,5. Além disso, o tecido circundante de embrião (endosperma) tem um papel importante no desenvolvimento de embrião6.
Em uma espécie de modelo dicot, a. thaliana, um método de cultivo em vitro foi desenvolvido focando o ovule inteiro, que contém o embrião e o endosperma7. Este sistema foi usado com sucesso para analisar os efeitos de vários reagentes químicos na embriogênese, mas não é adequado para imagens lapso de tempo, porque tem uma taxa de sobrevivência de baixo. Portanto, foi desenvolvido um sistema de cultivo de ovule romance em vitro para começar tão cedo quanto o estágio de zigoto e produzir plantas férteis em uma alta proporção de8. Depois de vários testes, verificou-se esse meio de Nitsch e trealose melhorou significativamente a taxa de sobrevivência de óvulos8. Além disso, porque o óvulo se expande à medida que cresce e, portanto, frequentemente se move longe do campo de observação do microscópio, um dispositivo PDMS foi desenvolvido para corrigir o ovule na média9. O dispositivo PDMS habilitado a imagem a longo prazo para 3-4 dias, que é suficiente para traçar o desenvolvimento de um zigoto de um embrião de coração-estágio. Usando esse método, torna-se possível visualizar a dinâmica da polarização de zigoto e embrião de padronização, não só em condições normais, mas também na presença de inibidores químicos ou em vários contextos mutantes8,10 ,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig1.jpg"> 
Figura 1: Diagrama esquemático dos marcadores fluorescentes específicos usados para visualizar zigotos e embriões através do Ovule. O Arabidopsis zigoto se desenvolve em um embrião no óvulo, que é gerado no fundo da flor. Neste sistema cultivo em vitro , o zigoto e embrião são observados através do ovule e, portanto, é importante o uso de marcadores fluorescentes específicos que não são expressas em outros tecidos do óvulo. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55975/55975fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table width="606">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">Nitsch basal salt mixture</td>
			<td style="width:104px;">Duchefa</td>
			<td style="width:119px;">N0223</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">trehalose dihydrate</td>
			<td style="width:104px;">Wako Pure Chemical</td>
			<td style="width:119px;">206-18455</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">MES</td>
			<td style="width:104px;">Dojindo</td>
			<td style="width:119px;">345-01625</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">Gamborg&#8217;s vitamin solution</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G1019</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">35-mm glass-bottom dish</td>
			<td style="width:104px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">D111300</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">35 mm culture dish</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430588</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">PDMS</td>
			<td style="width:104px;">Dow Corning Co.</td>
			<td style="width:119px;">Sylgard184</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">76 &#215; 26 mm slide glass</td>
			<td style="width:104px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">S1225</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">18 &#215; 18 mm slide glass</td>
			<td style="width:104px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">C018181</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">needle (gauge 0.40mm)</td>
			<td style="width:104px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">NN-2719S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">Immersion medium Immersol W 2010</td>
			<td style="width:104px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">444969-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">A1R MP</td>
			<td style="width:104px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="width:216px;height:84px;">CSU-W1</td>
			<td style="width:104px;">Yokogawa Electric</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">CV1000</td>
			<td style="width:104px;">Yokogawa Electric</td>
			<td style="width:119px;">CV1000-SP84</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro ovule cultivation for live-cell imaging of zygote polarization and embryo patterning in arabidopsis thaliana

Na maioria das plantas de floração, o zigoto e embrião estão ocultos no fundo do tecido da mãe, e assim tem sido um mistério de como eles desenvolvem dinamicamente; por exemplo, como o zigoto polariza para estabelecer o eixo do corpo e como o embrião especifica vários destinos de celular durante a formação do órgão. Este manuscrito descreve um in vitro ovule cultura método para executar a imagem latente da viver-pilha de desenvolver zigotos e embriões de Arabidopsis thaliana. O meio de cultivo otimizado permite zigotos ou embriões adiantados para crescer em plantas férteis. Combinando-a com um dispositivo de matriz de micropillar de poly(dimethylsiloxane) (PDMS), o óvulo é realizado em meio líquido na mesma posição. Essa fixação é fundamental observar o óvulo mesmo sob um microscópio para vários dias da extinta Divisão para a fase tardia do embrião. A imagem latente da viver-pilha resultante pode ser usado para monitorar a dinâmica em tempo real de polarização de zigoto, tais como migração nuclear e rearranjo do citoesqueleto e também o momento da divisão celular e especificação de destino célula durante a padronização do embrião. Além disso, este sistema de cultivo do ovule pode ser combinado com tratamentos de inibidor para analisar os efeitos de vários fatores no desenvolvimento do embrião e com ópticas manipulações tais como interrupção do laser para examinar o papel da comunicação célula-célula.

Usando este sistema de cultivo do ovule, esse método pode traçar a vida dinâmica de polarização de zigoto e padronização do embrião. Isto é uma conquista, porque anteriormente não havia nenhuma técnica para visualizar o comportamento em tempo real do zigoto e embrião, que estão escondidos no fundo do tecido da mãe. Figura 3A e 1 de vídeo suplementar mostram que os microtúbulos (MTs) no zigoto jovem acumulam como um anel transversal na região subapical10. Este anel de MT é mantido enquanto o zigoto se alonga na direção apical. Após a conclusão do zigoto alongamento e migração nuclear à região apical, o anel de MT desaparece e os MTs formam um eixo para separar o DNA. Figura 3B e 2 de vídeo suplementar mostram que células embrionárias coordenada se divide para formar uma forma globular valvas simétrica8. Este método é aplicável para experimentos farmacológicos. Por exemplo, após a aplicação de um inibidor da polimerização de actina (latrunculin B; B de lat) para o meio líquido os zigoto-contendo óvulos de cultivo, a migração polar nuclear foi inibida e, assim, o zigoto dividido de uma forma mais simétrica, indicando a função dos filamentos de actina sobre a polarização do zigoto (Supplemental vídeo 3 )10. Imagem de longo prazo do desenvolvimento embrionário permite o rastreamento da direção e sincronismo das divisões de célula individuais, o que significa que a duração da geometria e do ciclo celular pode ser analisado estatisticamente. De fato, mostramos anteriormente que a divisão de células da linhagem da célula apical é mais rápida do que o basocelular região8.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig3.jpg"> 
Figura 3: Ao vivo imagens de polarização de zigoto e embrião padronização. (A) observação de lapso de tempo de um zigoto expressando marcadores específicos para o núcleo (2B-tdTomato de histona; magenta) e microtúbulos (MTs, trevo-TUA6; verde). As imagens foram adquiridas utilizando um microscópio invertido de varredura a laser (A1R MP). (B) observação de lapso de tempo de um embrião expressando marcadores para o núcleo (histona 2B-sGFP; verde) e a membrana plasmática (PM, tdTomato-LTI6b; magenta). As imagens foram adquiridas utilizando um disco giratório confocal microscópio invertido (CSU-W1). As imagens foram mostradas imagens de projeção de intensidade máxima, e os números indicam o tempo (h:min) a partir do primeiro quadro. Pontas de flechas e suportes amarelos mostram o núcleo e o anel transversal de MT, respectivamente. Ciano colchetes indicam o eixo (A) e núcleo de divisão (B). Barras de escala: 10 µm (A) e (B) de 30 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55975/55975fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

Este manuscrito descreve um in vitro ovule cultivo método que permite que a imagem latente da viver-pilha de Arabidopsis zigotos e embriões. Este método é utilizado para visualizar a dinâmica intracelular durante a polarização de zigoto e a especificação do destino de célula no desenvolvimento de embriões.

In Vitro Ovule cultivo para viver-pilha de imagem do zigoto polarização e padronização do embrião em Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

in-vitro-ovule-cultivation-for-live-cell-imaging-zygote-polarization

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

10.8K visualizações.  Nagoya University. Este manuscrito descreve um in vitro ovule cultivo método que permite que a imagem latente da viver-pilha de Arabidopsis zigotos e embriões. Este método é utilizado para visualizar a dinâmica intracelular durante a polarização de zigoto e a especificação do destino de célula no desenvolvimento de embriões.

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Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Caracterização de Thymic Settling Progenitores no embrião do rato Usando<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Os ensaios

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Biologia do Desenvolvimento

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily conserved structures that compose it are assembled remains under investigation. Their size and physiological features often constrain manipulation and imaging applications. The culture of immortalized cell lines is widely used, but it can only replicate the early steps of differentiation.
Here, we describe a protocol that enables easy genetic manipulation of myofibers originating from primary mouse myoblasts. After one week of differentiation, the myofibers display contractility, aligned sarcomeres and triads, as well as peripheral nuclei. The entire differentiation process can be followed by live imaging or immunofluorescence. This system combines the advantages of the existing ex vivo and in vitro protocols. The possibility of easy and efficient transfection as well as the ease of access to all differentiation stages broadens the potential applications. Myofibers can subsequently be used not only to address relevant developmental and cell biology questions, but also to reproduce muscle disease phenotypes for clinical applications.

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

Na diferenciação in vitro de miofibras maduras for Imaging ao vivo

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

Viva Imagem Confocal de Desenvolvimento de Arabidopsis Flores

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

Um método para caracterizar a embriogênese em Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imagem ao vivo do mouse Fusão do palato secundário

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and mammalian final host, respectively. The ability to isolate and sustain the different life cycle stages under in vitro culture conditions has greatly facilitated investigations of the cellular, biochemical and molecular mechanisms regulating parasite growth, development and host interactions. Transmission of schistosomiasis requires asexual reproduction and development of multiple larval stages within the snail host; from the infective miracidium, through primary and secondary sporocysts, to the final cercarial stage that is infective to humans. In this paper we present a step-by-step protocol for mass hatching and isolation of Schistosoma mansoni miracidia from eggs obtained from livers of infected mice, and their subsequent introduction into in vitro culture. It is anticipated that the detailed protocol will encourage new researchers to engage in and broaden this important field of schistosome research.

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

This article describes a protocol for the large-scale axenic isolation and collection of free-swimming miracidia of the human blood fluke Schistosoma mansoni and their subsequent processing for introduction into in vitro culture.

Isolamento em massa e cultivo In Vitro de Intramolluscan fases do sangue fascíola Schistosoma Mansoni

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Imagem de célula viva de segregação do cromossomo durante a mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

Transferência de embriões minimamente invasivos e vitrificação embrionária na fase de embrião ideal em modelo de coelho

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Visualizando o nó e placa Notochordal em Gastrulating embriões de rato usando microscopia eletrônica e imunofluorescência de montagem inteira

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...