説明プロジェクトは、アレルギーと国立感染症研究所から賞数5R01AI116895でサポートされています。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立アレルギー感染症研究所や国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。

1.生成のサンプル<ol><li>熱はCを活性化させます氷上で30分間、店舗65℃でディフィシレ胞子。 注：C.以前7,9,10説明したようにディフィシレ胞子は生産、精製することができます。 </li><li> Xは、サンプル数がアッセイ中に撮影されるX + 1 mlの発芽溶液を調製します。 注：発芽液が細菌の種に固有のもので検討されて胞子。 C.をアッセイするためのディフィシレ胞子発芽、我々は、10mMトリス（pH7.5）を、150mMのNaCl、脱イオン水中の100 mMグリシンおよび10mMタウロコール酸の溶液を用います。 </li><li>アッセイを開始する前に、皮質の断片を検出するためのブランクとして機能するように胞子をせずに発芽溶液1.0mlサンプルを描きます。 </li><li>すぐに発芽液と渦に〜3.0のOD 600に胞子を追加します。 注：Bの私たちの発芽試験のために枯草菌 、我々は同じODを使用6C.用として00胞子ディフィシル 。 注：胞子のこの量は、Cの間に皮質断片の放出をモニターするためによく働きましたディフィシレ胞子の発芽。このアッセイで使用される胞子の量は、それぞれ細菌または株について実験的に決定されるべきです。 </li><li> 14,000×gで1分間室温で胞子および遠心分離機を追加した直後に1.2ミリリットルのサンプルを削除してください。これは、ゼロ時点です。 </li><li>その後の皮質断片分析のために新しいチューブに遠心分離し、試料からの上清の1.0ミリリットルを転送します。 注：DPAを ​​監視する必要がある場合、テルビウム蛍光9,18,19に基づくアッセイを用いて、溶液中にDPAの検出のための別々の100μlのサンプルを削除します。 </li><li> -80℃で採取した試料を凍結します。 </li><li>全ての時点が完了するまで繰り返して、定期的に1.4と1.5を繰り返します。 ために遠心分離し、サンプリングに必要な時間を、時間点は以下番目注2分は離れて私たちの手順の間には不可能だったので、私たちのサンプリング間隔は、一回14分ごとに2分でした。 </li><li> 0、12.5、25、50、100、250、500、および5000：砂糖の検出および定量化を減少させるためのポジティブコントロールとして、N個の -acetylglucosamine（ナノモル）以下の量が含まれています。皮質サンプルと同時にこれらのサンプルを調製し、標準曲線は、胞子を発芽によって生成されたデータに関連しているように、皮質サンプルと一緒に実行します。 </li><li>すべての時点のサンプルを収集した後、サンプルを凍結乾燥。 注：私たちは、2ミリリットルのスクリューキャップチューブ中で私たちのサンプルを凍結乾燥しました。 </li></ol> 2.皮質断片を測定<ol><li> 1％のフェノール及び0.5％のβメルカプトエタノールを補充した3 N HClを120μlの凍結乾燥試料を再懸濁します。 </li><li> 2 mlのスクリューキャップチューブに再懸濁したサンプルを転送します。 注：再現性のために、すべての凍結乾燥した試料は再懸濁し、転送されていることを確認。 </li> &lt;LI&gt; 4時間95℃で再循環水浴中でサンプルをインキュベートします。 </li><li>彼らはクールになるまでインキュベートした後、氷上にサンプルを置きます。 </li><li> 3 M NaOHを120μlのサンプルを中和します。 </li><li>飽和重炭酸ナトリウム溶液の80μlを、各サンプルと渦に5％無水酢酸溶液の80μLを加えます。 </li><li> 10分間、室温でサンプルをインキュベートします。 </li><li>丁度3分のために戻って95℃の水浴にサンプルを転送します。 注：このステップは敏感で、より長い時間が下り信号の発達に影響を与えることができる時間です。 </li><li>水浴からサンプルを取り出して、氷上で冷却します。 </li><li>各チューブとボルテックスに6.54パーセントのK 2 B 4 O 7・4H 2 Oの400μlのを追加します。 </li><li>丁度7分間95℃の循環水浴中でサンプルをインキュベートします。 注：このステップは敏感で、より長い時間が下り信号の発達に影響を与えることができる時間です。 </li><li>削除します氷上で5分間のサンプルと場所。 </li></ol> 3.色試薬<ol><li>サンプルは氷（ステップ2.12）であるが、発色試薬を準備します。氷酢酸1.9ミリリットルであり、pの -dimethylaminobenzaldehyde（エールリッヒ試薬DMAB）の0.320グラムを溶解させます。 注意：試薬は、時間、温度と光に敏感であり、事前に行われるべきではありません。 </li><li> DMABが完全に溶解した後、10 N HCl及び渦の100μlを添加します。 </li><li>氷酢酸と渦の5ミリリットルを追加します。 </li></ol> 4.比色反応<ol><li>各100μlのを転送新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに皮質のサンプルを冷却しました。 </li><li>各サンプルに新たに調製した色溶液700μLを加えます。 </li><li>直ちに37℃の水浴にサンプルを転送し、正確に20分間インキュベートします。 </li><li>透明な96ウェルプレートに200μlの各サンプルを転送します。 </li><li>プレート上の585 nmでのサンプルを定量リーダー。サンプルは黄色で開始すべきであると陽性反応が紫にシフトします。より多くの皮質の存在、深い紫色。 </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacillus+anthracis+SleL+(YaaH)+protein+is+an+N-acetylglucosaminidase+involved+in+spore+cortex+depolymerization.">The Bacillus anthracis SleL (YaaH) protein is an N-acetylglucosaminidase involved in spore cortex depolymerization.</a> J Bacteriol. 190, 7601-7607 (2008).</li><li>Wang, S., Shen, A., Setlow, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Dynamic+Germination+of+Individual+Clostridium+difficile+Spores+Using+Raman+Spectroscopy+and+Differential+Interference+Contrast+Microscopy.">Characterization of the Dynamic Germination of Individual Clostridium difficile Spores Using Raman Spectroscopy and Differential Interference Contrast Microscopy.</a> J Bacteriol. 197, 2361-2373 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

刺激を受けると、発芽の過程を経て胞子は巨大分子の合成を必要とせずに、それらの抵抗特性を失います。胞子の発芽がトリガされると、胞子コアは水2と引き換えにDPAを ​​解放します。休眠胞子の高いDPA内容に、胞子コアは、拡張2に対するバリアとして、おそらく、作用することにより、膨潤コアを防ぐことができます強烈な浸透圧や専門ペプチドグリカン、皮質下にあります。 上述の方法は、紫の色合いの測定シフトと還元糖の存在を検出するためにエールリッヒ試薬（黄色溶液）を使用します。皮質の加水分解の間、NAGとNAM糖が遊離する（加水分解酵素の程度に応じて、糖は、二糖類または多糖類として遊離させることができます）。塩酸（ステップ2.1）によるグリコシド結合の加水分解は、自由還元末端7で単糖を生成します。 neutraliz後水酸化ナトリウム（ステップ2.5）の等量酸る、NAGとNAM単糖類を囲むアルコールは無水酢酸（ステップ2.6）13によりアシル化されます。その後、未反応の無水酢酸を試料（ステップ2.8）を加熱して酢酸に変換されます。モーガンとエルソン20によって仮説を立てたように、末端アルデヒドは、自発的にエノール型に変換します。アルカリ性条件（ステップ2.10）の下で、このエノール形態は紫色15,20を生成するために、エールリッヒ試薬（ステップ4.3）と反応し、オキサゾール誘導体を生成するために、隣接アセチルと反応することができます。 上記のこの方法は、胞子を発芽から皮質の断片を検出するための一貫性のある、信頼性の高い結果が得られ、両方のB.枯草菌およびC.ディフィシル 9,16,17。アッセイは、反応時間、温度および手順を精密に行われることを保証するために特別な注意が必要です。適切な配慮なし反応条件は、実験13との間で再現失敗するかしないために詳細に、それは簡単です。しかし、実験室環境間アッセイのアプリケーションでNAG標準補助を含めます。 NAG陽性対照標準は、任意の実験間のばらつき（ 例えば 、反応時間で、わずかな変動や色試薬の有効性）のため、すべての実験のコントロールに含まれています。緩衝液のみの条件と皮質の両方を加水分解することができないの胞子との反応を用いて、反応は、色に変化は生じませんでした。 この方法の最も一般的な問題は、実験間のばらつきや信号の完全な欠如です。変動を制御するために、胞子調製物は、任意の栄養細胞破片の自由でなければなりません。この細胞破片はペプチドグリカンフラグメント（NAGとNAM）を含有し、発芽胞子のための高いバックグラウンドシグナルになります。純粋な胞子製剤（&gt; 99.9％の胞子）を確保するために、literatuを参照してください。再7,9,21-23を研究する生物に純粋な胞子懸濁液を調製するための方法のために。 アッセイは、検出可能なシグナルが得られていない場合は、凍結乾燥工程は、変動性を導入することができることを観察しました。真空が解放される力のために、我々は、乾燥した試料粉体を試料管から噴出することができることを観察しました。減らすために/試料管の上部の穴を突くために小さな注射針を使用し、これを防ぎます。導入孔の小領域が乱されるから（現在粉末形態の）凍結乾燥されたサンプルの可能性を減少させます。上記の方法で述べたように最後に、いくつかのインキュベーションステップは非常に時間に敏感です。すべての時限の手順を注意深く監視していることを確認してください。このアッセイの重要な考慮事項は、皮質断片を検出するために発芽胞子から放出されなければならないということです。皮質は、大きな断片に加水分解されている場合は、これらの断片はRELEであるには余りにも大きくなることがあり胞子殻を通してASED。信号が得られない実験のトラブルシューティングを行うときに考慮すべき重要なことが、私たちは前に潜在的な問題のように皮質のフラグメントサイズを考慮に条件がここに記載されている溶液中の胞子およびその他のトラブルシューティングオプションのほとんどを発芽するために使用されることを確認することをお勧めしますアッセイ。 全て発芽バッファは/条件は、このアッセイに適しています。このアッセイは発芽過程13の間に遊離還元糖の存在、糖または、それ自体が任意の発芽を減らす含む任意の発芽・バッファを検出するので、還元糖（ 例えば 、グルコース）は、このアッセイで強いシグナルをもたらすであろう。この場合、高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）は、皮質断片24-26の存在を検出することができます。すべての研究所は、このような計測機器が装備されていないので、しかし、本明細書に記載される方法は、ほとんどの地域で使用されることができます研究所や、シンプルで簡単に定量化可能な結果を​​提供しています。 細菌胞子によって発芽は、主としてバチルスといくつかのクロストリジウム属の種2,8に研究されてきました。差異が存在するが、プロセスは、一般的に、保存されています。モデルの胞子形成剤9,27に観察されるように重要なことは、すべての生物は、胞子の発芽のメカニズムを使用して発芽しません。発芽は、より多様な生物において研究になっているので、上述のアッセイは、胞子発芽の間皮質断片を検出するために、これらの生物に適用することができます。これらの新たに研究の生物にこの方法を適用することにより、研究者はさまざまな発芽タンパク質が皮質の加水分解において果たす役割を決定することができます。

内生胞子は、細菌が不利な環境で存続することを可能にする細菌の代謝的に休止状態の形態です。多くの胞子形成細菌は、胞子形成は、栄養欠乏によって誘導されるが、このプロセスは、pH、酸素への曝露または他のストレス1に変更することによって制御することができます。それらの代謝休眠胞子の形で、一方、細菌は、UV照射、乾燥、高温、および2の凍結に耐えます。胞子形成過程に関する知識のほとんどは、モデル生物での研究、 枯草菌（Bacillus subtilis）から来ています。胞子形成のプロセスは、DNA複製および軸方向フィラメント3,4の形成から始まります。非対称隔壁は、2つの不均等サイズの区画にセルを分割します。大きなコンパートメントは、母細胞は、小さな区画、前胞子を飲み込みます。母細胞とドーマンを解放し、胞子、最終的に溶解する母細胞を成熟するために遺伝子発現を調整する前胞子の両方周囲の環境1へのT胞子。 胞子の構造と組成は、多くの細菌種間で保存されています。胞子コアは栄養細胞よりも低い含水量を有しており、ジピコリン酸（DPA）1,2と豊富です。胞子形成中、DPAは、水と引き換えに胞子コアに圧送されます。コアを囲むことは、ほとんどの芽胞形成菌で、発芽を刺激する小分子を認識する受容体（germinants）が2に位置している、内側の胞子膜です。ちょうど胞子の内膜の外側に位置する細胞壁ペプチドグリカンの層です。特殊なペプチドグリカン層（皮質）は、細胞壁のペプチドグリカンを囲み、[N-アセチルグルコサミン（NAG）およびN-アセチルムラミン酸（NAM）交互】細胞壁ペプチドグリカンと同じ構成要素の多くで構成されています。しかし、皮質におけるNAM残基の約​​50％は、ムラミン-δラクタム5,6に変換されています</s&gt;アップ。胞子発芽時には、これらのムラミン-δラクタム残基は、このように皮質はなく、細胞壁（発芽を完了するのに必須のプロセス）を分解することができるように、胞子皮質溶​​解酵素（SCLEs）によって認識されます。皮質の周囲には外膜とコートタンパク質2のいくつかの層です。 発芽のプロセスを制御することは芽胞形成菌のために非常に重要です。発芽受容体は、それぞれのgerminants 2を操作する際に発芽が開始されます。多くの胞子形成細菌では、これらのgerminants 2そのアミノ酸、糖、ヌクレオチド、イオンまたはこれらの組み合わせである。C.ディフィシレ胞子の発芽は、特定の胆汁酸[ 例えば 、タウロコール酸（TA）]およびアミノ酸（ 例えば 、グリシン）7-10の組み合わせによって開始されます。 Cの相違はありますがディフィシル発芽経路および他の胞子形成に研究経路このようなB.などの細菌、 枯草菌は、すべてに共通の栄養細胞が発芽胞子2,8から成長できるようにするために胞子皮質を分解するための絶対条件です。 （多くのクロストリジウムに見られるような）皮質の劣化がSCLEs CwlJ / SleB（ 枯草菌に見られるような）またはSLECによって達成することができます。皮質の加水分解は、細胞壁と胞子上の制約を軽減します。これは完全なコアの再水和、細胞代謝2のために必要なタンパク質の多くを再活性化に必要なステップを可能にします。 胞子が発芽したときに、位相暗状態と、このプロセスのフェーズ明状態から休眠胞子の変更は600での光学密度（OD）の変化によって測定することができます。 11 nmの。前回のレポートでは、ODの変化の多くは胞子12からのDPAのリリースによるものであることを示唆しています。我々の最近の研究の間、我々はCのタイミングを比較しようとしましたディフィシレ胞子の発芽・監視DPAおよび皮質の断片9のリリース。彼らは胞子を発芽によって解放されるようになったように、この研究のためには、皮質の断片の放出を監視するために重要でした。 ここで使用される比色アッセイはGhuysen らが開発した還元末端を有する糖を検出するための方法に基づいていた。13。他の人が還元糖14の検出のためのプロトコルを記述しているか、それらのプロトコル15を変更したので、このテーマに関する文献は混乱することができます。ここでは、詳細C.発芽から遊離した還元糖の比色検出のためのステップバイステップ方法ディフィシレ胞子。この研究では、Cを使用しますがディフィシレ胞子は、他の芽胞形成菌からの胞子の発芽中に放出された還元糖は、このプロトコル9,16,17で検出することができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0 mL screw cap tube</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1420-3700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 eppendorf pippet</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 eppendorf pippet</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20 eppendorf pippet</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1250uL pipet tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-200uL pipet tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-D-glucosamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3286-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid - 10N</td>
			<td>BDH-Aristar</td>
			<td>BDH3032-3.8LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Anhydride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L04295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH0280-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Tetraborate tetrahydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>39435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH8019-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(Dimethylamino)benzaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>156477-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saturated Phenol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1750-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M3</td>
			<td colspan="2">Molecular Devices</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH3098-3.8LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated, Circulating Water Bath</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>Model 1136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtest 96</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td>96 well clear tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Blocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting cortex fragments during bacterial spore germination

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

表1は、NAG標準を使用した典型的な結果を示しています。データは、標準曲線を生成するために使用される。 表2は、100 mMグリシン及び10 mMのTA（発芽促進条件）、または100mMのグリシンのみ（未発芽状態）を補充した発芽バッファにおける発芽アッセイの代表的な結果を示しています。 TA、Cの非存在下ではディフィシレ胞子は発芽せず、溶液中の皮質の断片の存在はほとんど変化しません。しかし、C.、TAお ​​よびグリシンの両方の存在下で、 ディフィシレ胞子は発芽し溶液中に皮質の断片を放出します。これは、反応した試料の経時的なOD 585の増加として観察されます。このアッセイの間に放出さ皮質断片（ナノモル）の合計量は、 図1Bと同様の標準曲線を用いて計算しました。このアッセイでは、皮質の大部分が加水分解される（または解放）15分後により発芽暴露、胞子の大部分はこの時間枠（ 図2;以前の出版物7と一貫）で発芽していることを示唆しています。 発色試薬でサンプルを開発した後、ほとんどのサンプルは、肉眼に紫色が表示されない場合があります。 図1は、N-アセチルグルコサミンから生成された代表的なサンプルを示しています。サンプルの多くは、目に見える紫色を示していません。しかし、250ナノモル、500ナノモル及び5000 nmolのサンプルは、陰性対照（0ナノモル）と視覚的に異なる表示されます。 OD 585 nmで測定した場合、信号が最高の線形回帰（R 2 = 0.999）をフィット生成しました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54146/54146fig1.jpg" /> 図1： 検出N-アセチルグルコサミン （A）N-アセチルグルコサミンサンプル（0ナノモル、12.5ナノモル、。25ナノモル、50ナノモルを、100ナノモル、250ナノモル、500ナノモル、5,000ナノモル）が記載された手順に従って凍結乾燥して反応させました。 （B）サンプルを、96ウェルプレート、および585 nmで検出した反応物質の量に添加しました。信号は、標準曲線を作成するために使用されました。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54146/54146fig2.jpg" /> 図2： 発芽結果のグラフィカルな表現は、 表2の計算されたナノモル皮質は、時間に対してプロットしました。 （●）100 mMグリシン+ 10mMのTA。 （■）100 mMグリシン。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54146/54146fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> NAG濃度（ナノモル） </td><td> OD 585 </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 0.047 </td></tr><tr><td> 12.5</td><td> 0.054 </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 0.066 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 0.084 </td></tr><tr><td> 100 </td><td> 0.128 </td></tr><tr><td> 250 </td><td> 0.285 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 0.556 </td></tr><tr><td> 5,000 </td><td> 4.0 </td></tr><tr><td>ブランク= </td><td> 0.046 </td></tr></tbody></table> 表1：NAG標準。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> クロストリジウム・ディフィシレ胞子の発芽</td></tr><tr><td></td><td colspan="4">発芽液（10mMトリス（pH7.5）を、150mMのNaCl） </td></tr><tr><td></td><td colspan="2"> 100mMのグリシン+ 10mMのTA </td><td colspan="2"> 100mMのグリシン</td></tr><tr><td>時間（分） </td><td> OD 585 </td><td>計算された（ナノモル） </td><td> OD 585 </td><td>計算された（ナノモル） </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 0.046 </td><td> 0.00 </td><td> 0.047 </td><td> 0.00 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0.048 </td><td> 2.54 </td><td> 0.048 </td><td> 1.27 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 0.05 </td><td> 5.07 </td><td> 0.049 </td><td> 2.54 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 0.055 </td><td> 11.41 </td><td> 0.05 </td><td> 3.80 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 0.059 </td><td> 16.49 </td><td> 0.05 </td><td> 3.80 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 0.06 </td><td> 17.76 </td><td> 0.051 </td><td> 5.07 </td></tr><tr><td> 12 </td><td> 0.061 </td><td> 19.02 </td><td> 0.05 </td><td> 3.80 </td></tr><tr><td> 14 </td><td> 0.063 </td><td> 21.56 </td><td> 0.051 </td><td> 5.07 </td></tr></tbody></table> 表2：スポアGerminatiサンプル結果に。

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Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

細菌胞子の発芽中に皮質断片を検出

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

detecting-cortex-fragments-during-bacterial-spore-germination

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.3K ビュー.  Texas A&M University. Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

ビデオ: Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Propagating and Detecting an Infectious Molecular Clone of Maedi-visna Virus that Expresses Green Fluorescent Protein

Maedi-visna virus (MVV) is a lentivirus of sheep, causing slowly progressive interstitial pneumonia and encephalitis1. The primary target cells of MVV in vivo are considered to be of the monocyte lineage2. Certain strains of MVV can replicate in other cell types, however3,4. The green fluorescent protein is a commonly used marker for studying lentiviruses in living cells. We have inserted the egfp gene into the gene for dUTPase of MVV. The dUTPase gene is well conserved in most lentivirus strains of sheep and goats and has been shown to be important in replication of CAEV5. However, dUTPase has been shown to be dispensable for replication of the molecular clone of MVV used in this study both in vitro and in vivo6. MVV replication is strictly confined to cells of sheep or goat origin. We use a primary cell line from the choroid plexus of sheep (SCP cells) for transfection and propagation of the virus7. The fluorescent MVV is fully infectious and EGFP expression is stable over at least 6 passages8. There is good correlation between measurements of TCID50 and EGFP. This virus should therefore be useful for rapid detection of infected cells in studies of cell tropism and pathogenicity in vitro and in vivo8.

We describe a molecular clone of maedi-visna virus that expresses GFP and is fully infectious. Replication of this virus can be detected by using fluorescence microscopy and flow cytometry.

伝播と緑色蛍光タンパク質を発現Maedi -ビスナウイルスの感染分子クローンの検出

Maedi-visna virus (MVV) is a lentivirus of sheep, causing slowly progressive interstitial pneumonia and encephalitis1. The primary target cells of MVV in ...

免疫・感染学

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

マダニScapularisダニの唾液、唾液腺、および体液コレクション

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of bacteria in gene and cell therapy for cancer. Bacteria present an attractive class of vector for cancer therapy, possessing a natural ability to grow preferentially within tumors following systemic administration. Bacteria engineered to express the lux gene cassette permit BLI detection of the bacteria and concurrently tumor sites. The location and levels of bacteria within tumors over time can be readily examined, visualized in two or three dimensions. The method is applicable to a wide range of bacterial species and tumor xenograft types. This article describes the protocol for analysis of bioluminescent bacteria within subcutaneous tumor bearing mice. Visualization of commensal bacteria in the Gastrointestinal tract (GIT) by BLI is also described. This powerful, and cheap, real-time imaging strategy represents an ideal method for the study of bacteria in vivo in the context of cancer research, in particular gene therapy, and infectious disease. This video outlines the procedure for studying lux-tagged E. coli in live mice, demonstrating the spatial and temporal readout achievable utilizing BLI with the IVIS system.

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This article describes the administration of lux-tagged bacteria to mice and subsequent in vivo analysis using IVIS bioluminescence imaging.

生物発光細菌のイメージング<emインビボで&gt;</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

過ヨウ素酸シッフ染色で末梢血単核細胞中のグリコーゲンの検出

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. This information is particularly valuable in the context of host-pathogen interactions. Many pathogen proteins function within host cells in a variety of way such as, enabling evasion of the host immune system and survival within the intracellular environment. To study these pathogen-protein host-cell interactions, several approaches are commonly used, including: in vivo infection with a strain expressing a tagged or mutant protein, or introduction of pathogen genes via transfection or transduction. Each of these approaches has advantages and disadvantages. We sought a means to directly introduce exogenous proteins into cells. Electroporation is commonly used to introduce nucleic acids into cells, but has been more rarely applied to proteins although the biophysical basis is exactly the same. A standard electroporator was used to introduce affinity-tagged bacterial effectors into mammalian cells. Human epithelial and mouse macrophage cells were cultured by traditional methods, detached, and placed in 0.4 cm gap electroporation cuvettes with an exogenous bacterial pathogen protein of interest (e.g. Salmonella Typhimurium GtgE). After electroporation (0.3 kV) and a short (4 hr) recovery period, intracellular protein was verified by fluorescently labeling the protein via its affinity tag and examining spatial and temporal distribution by confocal microscopy. The electroporated protein was also shown to be functional inside the cell and capable of correct subcellular trafficking and protein-protein interaction. While the exogenous proteins tended to accumulate on the surface of the cells, the electroporated samples had large increases in intracellular effector concentration relative to incubation alone. The protocol is simple and fast enough to be done in a parallel fashion, allowing for high-throughput characterization of pathogen proteins in host cells including subcellular targeting and function of virulence proteins.

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

哺乳動物細胞への機能性細菌エフェクターのエレクトロポレーション

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

発生とのマルチ表現型ハイコンテンツスクリーニング<em&gt; Q熱リケッチア</em&gt;トランスポゾン変異体

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible for most malaria-related deaths globally. Several factors including parasite sequestration in tissues, vascular dysfunction, and inflammatory responses influence the evolution of the disease in malaria-infected people. P. falciparum-infected red blood cells (iRBCs) release small extracellular vesicles (EVs) containing different kinds of cargo molecules that mediate pathogenesis and cellular communication between parasites and host. EVs are efficiently taken up by cells in which they modulate their function. Here we discuss strategies to address the role of EVs in parasite-host interactions. First, we describe a straightforward method for labeling and tracking EV internalization by endothelial cells, using a green cell linker dye. Second, we report a simple way to measure permeability across an endothelial cell monolayer by using a fluorescently labeled dextran. Finally, we show how to investigate the role of small non-coding RNA molecules in endothelial cell function.

In this work, we describe protocols to investigate the role of extracellular vesicles (EVs) released by Plasmodium falciparum infected erythrocytes. In particular, we focus on the interactions of EVs with endothelial cells.

マラリア感染時の細胞の小胞の機能評価

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

検出細胞毒性アミロイド次感染症の肺による内皮細胞緑膿菌法

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure makes the spore extremely stable and resistant and has suggested the use of the spore as a platform to display heterologous molecules. So far, a variety of antigens and enzymes have been displayed on spores of Bacillus subtilis and of a few other species, initially by a recombinant approach and, then, by a simple and efficient nonrecombinant method. The nonrecombinant display system is based on the direct adsorption of heterologous molecules on the spore surface, avoiding the construction of recombinant strains and the release of genetically modified bacteria in the environment. Adsorbed molecules are stabilized and protected by the interaction with spores, which limits the rapid degradation of antigens and the loss of enzyme activity at unfavorable conditions. Once utilized, spore-adsorbed enzymes can be collected easily with a minimal reduction of activity and reused for additional reaction rounds. In this paper is shown how to adsorb model molecules to purified spores of B. subtilis, how to evaluate the efficiency of adsorption, and how to collect used spores to recycle them for new reactions.

This protocol focuses on the use of bacterial spores as a &#34;live&#34; nanobiotechnological tool to adsorb heterologous molecules with various biological activities. The methods to measure the efficiency of adsorption are also shown.

酵素の抗原 Nonrecombinant 表示システムとして胞子吸着

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

高スループット赤痢菌-特定の殺菌試験

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...