この研究は、NIH の補助金 HL66299 SL、TS へ HL60024 と mf HL136869、RB、TS によって部分で賄われていた。

動物のすべてのプロシージャを行った機関と動物ケア委員会南アラバマ大学によって承認し、すべての連邦、州、およびローカル規則に従って行われました。初代培養ラット肺微小血管内皮細胞 (PMVECs) の肺生物学南アラバマ大学センターで細胞培養コアから得られました。前に説明した手順16を使用して電池を作製しました。
1. 細胞培養上清の世代
注: ここで、我々 は緑膿菌の 2 つの異なる系統使用: PA103 標的細胞に感染、およびタイプ III の分泌システムに欠けている、∆PcrV の中に ExoU と ExoT exoenzymes を転送することができるそのままタイプ III 分泌システムを持っています。exoenzymes を接種対象セルに転送することができません。
<ol><li>フォーゲル ボナー (VB) 寒天培地プレート17に細菌を連勝し、37 ° C で一晩成長<ol>
<li>プレートを準備するように次の原液 (フォーゲル ボナー塩; 10 x の在庫): 2 g MgSO4、20 g のクエン酸の酸 (遊離酸)、100 g K2PO4、および 35 g NaH2PO4を測定します。1 L と低速排気で 15 分間オートクレーブに ddH2O を追加します。</li>
		<li>450 mL ddH2O で 7.5 g の寒天と上記としてオートクレーブを配置します。</li>
		<li>オートクレーブ、次クールに 50 ° C の水浴に両方のソリューションを配置します。</li>
		<li>寒天に 10 x VB ストック塩溶液 50 mL を追加します。</li>
		<li>(使用されている膿の系統) の 400 μ g/mL に carbenicillin を追加し、フラスコを旋回でよく混ぜます。</li>
		<li>個々 の無菌培養皿に VB の寒天液の場所 5 mL は、固化し、細菌の播種日まで 4 ° C で保存する寒天を許可します。</li>
		<li>細菌の播種日前 37 ° c のプレートを温めるし、プレート滅菌ループを使って細菌を連勝します。37 ° C の定温器のプレートの場所は一晩します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>肯定的な染色蛍光グリフォニア simplicifolia PMVEC 純度を確認レクチンおよび否定的な汚損蛍光リンゴマイマイレクチン (血管内皮細胞のマーカー)。細胞分注、液体窒素で凍結。</li>
	<li>実験用セル ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 10% 牛胎児血清を添加したを維持し、5% CO2を含む 37 の ° C の定温器で細胞を成長します。5-15 の通路でセルを使用します。<ol>
<li>細胞培養上清の世代、個々 の 150 cm 皿に 2 x 10 の6セルをプレート、合流点を達成するまで 3-4 日の拡張します。2 枚実験 (下記参照) を使用します。</li>
		<li>、細胞培養上清の分析プレート 1 × 105セル 6 ウェルの個々 の井戸には皿し、合流が達成されるまで 4 日間の成長します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>上清を生成するリン酸緩衝生理食塩水でステップ 1.3.1 から PMVECs の 2 つの 150 cm の料理の一つ、trypsinize、洗ってその後セルをカウント (我々 は、自動化された細胞カウンターを使用して、製造元のプロトコルに従う;材料の表を参照してください)。PMVECs とハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS) の他の皿を洗って、20:1 の感染 (MOI) の多様性で膿のいずれかの株に感染してしまいます。これは、次のとおり達成されます。<ol>
<li>膿の540 0.25 = 2 × 108 CFUs/mL を OD します。この希釈を準備するには、1 mL の使い捨てのキュベットに 1 mL HBSS を追加します。分光光度計を使用して測定したとき、0.25 の外径540が得られるまで手順 1.1 で準備されたプレートから十分な細菌をこすり。次のステップは、細菌が必要とどのくらいの計算になります。</li>
		<li>培養皿の PMVECs の数が決定される (1.4 上記の手順)、適切な PMVECs を含む 2 番目、非トリプシン培養皿に追加する細菌数を決定します。たとえば、PMVECs の培養皿は 10 の7セル x 1.3 が含まれているし、1.3 × 107セル x 20 細菌/携帯 x 1 mL/108 CFUs の準備と判断された場合は、1.3 mL の細菌を = します。</li>
		<li>20 mL の最終巻には HBSS に細菌の 1.3 mL を希釈する、150 センチメートルの皿の表面全体液で覆われることができますし、PMVECs のプレートに希釈した細菌を追加します。</li>
		<li>プレートは、顕微鏡で観察するときセル単分子膜の形成、ギャップを見ることができるまで、4-5 時間 5% CO2インキュベーターで 37 ° C で細菌を接種した PMVECs (ギャップ形成の適切なレベルを参照してください図 1 ) 孵化させなさい。</li>
		<li>、上清を収集し、細胞の残骸を削除する卓上遠心分離機で 2,000 x g で 10 分間遠心します。 注: 十分な g を生成することができる任意のテーブル トップ遠心強制ペレット unlysed 細胞及び大細胞断片はこの手順で使用できるには。</li>
		<li>上清を上澄みの細菌を除去するフィルターを通過し、その末尾に添付 0.2 μ m フィルターを持つ注射器に注ぐ。</li>
		<li>無菌培養上清の因数を使用して細胞毒性をテスト (2.1 を参照) し、将来使用するため-80 ° C で培養上清の残りの部分を凍結します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 細胞培養上清の分析
<ol><li>細胞毒性の試金<ol>
<li>合流点まで 6 よく料理の PMVECs を成長します。洗浄井戸一度 HBSS で追加 1.5 mL (どちらか PA103 または ∆PcrV 接種の細胞採取) フィルター滅菌培養上清の個々 の井戸。また一つに陰性対照として滅菌 HBSS を追加します。</li>
		<li>21-24 h の CO2インキュベーターにプレートを配置し、セル殺害/細胞毒性のための観察 (次の手順を参照してください)。さらに実験のため細胞毒性を示す培養上清を使用し、細胞の殺害を表示しないものを破棄します。</li>
		<li>セル殺害の定量<ol>
<li>市販の LDH アッセイ キットと製造元を使用して死んだ細胞からメジャー乳酸脱水素酵素 (LDH) のリリースでは、手順をお勧めします。</li>
			<li>また、顕微鏡的 ImageJ ソフトウェアを使用してセル殺害を定量化します。このため、顕微鏡画像とそのままセルを含む培養皿のエリアを記録、セル (単層の細胞死を示す) に欠けている地域を定量化するカスタム ImageJ (健康の国民の協会) マクロ (を参照してくださいのコーディングの補足ファイルを使用).必要な場合は、手動で次のようにマクロのステップを実行します。<ol>
<li>マクロに画像 (RGB または Tiff 形式) を入力し、15% 飽和ピクセルのコントラストを調整します。コントラスト調整後の画像を複製し、ビューのフィールド内のセルとギャップ領域のコントラストの高い画像を得る「背景を引く」コマンドを実行します。</li>
				<li>元のイメージからこのイメージを減算し、イメージ電卓"AND"関数を使用して元のイメージと結果のイメージを結合します。ブラック (ギャップ) と白 (セル) マスク (最低 0、最大 5) しきい値関数を得られる画像に変換し、画像からノイズを除去する「バイナリをむしばむ」関数を使用します。</li>
				<li>「面積率」測定結果のイメージ内の白いピクセルを黒の比率を測定します。プロットし、最大ギャップ領域の % として各治療時点の小数のエリアを表現します。</li>
				<li>手段を計算し、テューキー事後テストで重要と見なされる 0.05 未満のp値と、一方向の分散分析を使用して比較します。</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>培養上清中の a β オリゴマー タウ、アミロイドのプレゼンスを確立するのにイムノブロット解析を使用します。標準的な手順10、11,12、電気泳動前に、少なくとも 10 倍培養上清を集中以外を用いたイムノブロット解析を実行します。<ol>
<li>上清を集中、その膜が 10 kDa の分子量カットオフ遠心フィルター ユニットに 1-2 mL の培養上清を配置します。その後、フィルター ユニットを配置テーブル トップ遠心分離機、遠心分離 2,000 x に g まで濃度の必要度は達成 (通常 45-60 分)。</li>
			<li>11濃縮培養上清中のタンパク質の量を決定し、ゲルの個々 の井戸にサンプルの同量を読み込みます。</li>
			<li>ゲルを実行し、硝酸セルロースに蛋白質を転送、A11 抗アミロイド抗体、T22 反オリゴマー タウ抗体または適切な二次抗体に続いて MOAB2 抗 a β 抗体でしみをプローブします。化学発光の標準的なプロシージャを使用してしみを開発します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>Thioflavin T アッセイを行う、上清中にアミロイドを定量化するのに蛍光 thioflavin T (ThT) を使用します。これらの測定はフィルター滅菌培養上清を使用します。<ol>
<li>10 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に 8 mg thioflavin T (ThT) を停止することによって thioflavin T の原液 (50 倍) を準備します。混合した後、粉じんを除去する 0.22 μ m のフィルターを通してソリューションをフィルターします。</li>
			<li>測定は、1 mL の PBS で 1 mL 分光光度計のキュベットに ThT 株式の 20 μ L を追加します。希釈したサンプルを蛍光測定装置に配置します。</li>
			<li>425 nm 励起 2 nm 刻みで 450-575 nm の蛍光性の放出をスキャンしてベースライン蛍光発光を測定します。</li>
			<li>425 nm 励起を用いたコマ撮りのスキャンを実行し、482 nm 発光、データ取得ごとの 0.2 s 60 s。</li>
			<li>初期の 20 コマのスキャンの s 対策空白キュベットで蛍光します。20 s、スキャンを一時停止し、フィルター滅菌清 10 μ L をキュベットに追加。逆解析によるキュベットをミックスし、蛍光測定装置に置きます。</li>
			<li>再開最終 40 を取得、時間ベースのスキャン データの s。</li>
			<li>コマのスキャンが完了したら、2.1.5.3 の詳細として同一の設定を使用して最終的な蛍光発光スペクトル スキャンを実行します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+pneumonia+really+the+old+man's+friend?+Two-year+prognosis+after+community-acquired+pneumonia.">Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia.</a> Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).</li><li>Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+of+importance+for+the+long-term+prognosis+after+hospital+treated+pneumonia.">Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia.</a> Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).</li><li>Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. E., Vasilakis, C., Jick, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+respiratory+tract+infections+and+risk+of+first-time+acute+myocardial+infarction.">Acute respiratory tract infections and risk of first-time acute myocardial infarction.</a> Lancet. 351 (9114), 1467-1471 (1998).</li><li>Waterer, G. W., Kessler, L. A., Wunderink, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium-term+survival+after+hospitalization+with+community-acquired+pneumonia.">Medium-term survival after hospitalization with community-acquired pneumonia.</a> Am J Resp Crit Care Med. 169 (8), 910-914 (2003).</li><li>Yende, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+markers+at+hospital+discharge+predict+subsequent+mortality+after+pneumonia+and+sepsis.">Inflammatory markers at hospital discharge predict subsequent mortality after pneumonia and sepsis.</a> Am J Resp Crit Care Med. 177 (11), 1242-1247 (2008).</li><li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+hospitalization+for+pneumonia+and+subsequent+risk+of+cardiovascular+disease.">Association between hospitalization for pneumonia and subsequent risk of cardiovascular disease.</a> J Am Med Assoc. 313 (3), 264-274 (2015).</li><li>Frank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exoenzyme+S+regulon+of+Pseudomonas+aeruginosa.">The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa.</a> Mol Microbiol. 26 (4), 621-629 (1997).</li><li>Engel, J., Balachandran, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Pseudomonas+aeruginosa+type+III+effectors+in+disease.">Role of Pseudomonas aeruginosa type III effectors in disease.</a> Curr Opin Microbiol. 12 (1), 61-66 (2009).</li><li>Ochoa, C. D., Alexeyev, M., Pastukh, V., Balczon, R., Stevens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+Y+is+a+promiscuous+cyclase+that+increases+endothelial+tau+phosphorylation+and+permeability.">Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y is a promiscuous cyclase that increases endothelial tau phosphorylation and permeability.</a> J. Biol. Chem. 287 (30), 25407-25418 (2012).</li><li>Balczon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+Y-mediated+tau+hyperphosphorylation+impairs+microtubule+assembly+in+pulmonary+microvascular+endothelial+cells.">Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells.</a> PLoS One. 8, e74343 (2013).</li><li>Morrow, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+exoenzymes+U+and+Y+induce+a+transmissible+endothelial+proteinopathy.">Pseudomonas aeruginosa exoenzymes U and Y induce a transmissible endothelial proteinopathy.</a> Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 310 (4), L337-L353 (2016).</li><li>Balczon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+infection+liberates+transmissible,+cytotoxic+prion+amyloids.">Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids.</a> FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).</li><li>Stevens, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pseudomonas+aeruginosa+exoenzyme+Y+impairs+endothelial+cell+proliferation+and+vascular+repair+following+lung+injury.">The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury.</a> Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).</li><li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creutzfeldt-Jakob+disease+and+scrapie+prions.">Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions.</a> Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).</li><li>Hunter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrapie:+Uncertainties,+biology,+and+molecular+approaches.">Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches.</a> Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).</li><li>King, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characteristics+of+lung+macro-+and+microvascular+endothelial+cell+phenotypes.">Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes.</a> Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).</li><li>Marmont, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomeric+lipoprotein+PelC+guides+Pel+polysaccharide+export+across+the+outer+membrane+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).</li></ol>

なしにレポートします。

ここでは、簡単な培養方法の生物を引き起こす肺炎感染中の細胞毒性アミロイドの生成のデモンストレーションをするとおりです。これらのメソッドは、細胞培養の細胞毒性の試金、免疫ブロット、顕微鏡法と ThT バインドを使って細胞の定量。細胞毒性薬の分析を示した (図 2 と図 4) は本質的にアミロイドが、プリオンの12の特徴を表わします。肺炎の中に細胞傷害性プリオン分子の生成は、次の病院退院肺炎み高い死亡率のための潜在的な説明を提供します。進行中の実験は、この可能性をテストしています。
説明研究のすべてのキーのイベントが細胞上清の世代と 2 つの重要な変数を考慮しなければ。まず、輪郭を描かれた実験ラットでは、PMVECs は両方感染ステップと細胞毒性の試金のために使用されました。Cytotoxins の生産のため他の細胞型を使用できるかどうかは調査されていない、詳細に、他のセルは緑膿菌系統による細胞培養上清を生成することができる可能性があります。示すように、cytotoxins、自然の中のアミロイド、オリゴマー タウと a β を含まれます。テストするこの可能性が残っているが、細菌の接種 cytotoxins を生成するタウや β アミロイド蛋白質を表現する他の細胞型が誘発されるかもしれないことを期待するが妥当ででしょう。輪郭を描かれたプロシージャは、次の異なる侮辱細胞傷害性のアミロイドを生成する他のセルタイプを誘起することかどうかを調べることにされる可能性があります。
細胞培養上清の世代で 2 番目の重要な変数は、細菌による治療の期間です。単層のギャップを見ることができるまで進歩できる、PMVECs の培養が不可欠です。単層細胞のギャップの識別が表示 exoenzymes にシュードモナス細菌によってホスト細胞の細胞質に挿入されているし、exoenzymes がアクティブ、セルの罫線 (図 1) の取り消しの結果であります。我々 の経験は、培養上清をグリコプロテイン リリースの信頼性の高い指標であるセルの罫線の撤回の時点です。2 つのイベントが 1 つ解放される細胞傷害性のアミロイドのオリゴマー タウとタウの活動の中断の結果細胞形状の変化に寄与する微小管脱重合と関連するいると推測する魅力的です。どこの治療は、ギャップの形成を誘導するために必要な時間の量よりも少なくされている実験、少し成熟した細胞傷害性アミロイドが検出されました。
本稿で説明した細胞毒性アッセイは、シンプルで信頼性の高いです。細胞死の顕微鏡検査で容易に観察し、記録された顕微鏡画像から直接定量化できます。ここで説明されている方法は、専ら感染ラット肺血管内皮細胞の膿の毒素生産を評価するために使用されています。手順生成細胞毒性アミロイドには院内の両方を含むエージェントの原因他の肺炎、感染するかどうかを評価するためにすぐに適応できるそうだが細菌および細菌・ ウイルスの責任コミュニティ-取得肺炎の種類。また、報告された手順のみ感染培養細胞の中に細胞傷害性アミロイドの生成を確認する使用されています。細胞培養は人工的なシステムと、ほとんどの場合ここに記載されている手順は、肺感染症の動物モデルと人間の患者の両方で cytotoxins の発生を評価するために合わせることができます。体液から感染した動物や患者の気管支肺胞洗浄などのコレクションは、同じ種類のアッセイ細胞毒性アミロイドが体内感染プロセス中に生成されるかどうかを評価するためにここで報告で使用可能性があります。もちろん、動物に接種するときに細菌培養の期間がかなり異なる場合があります、気管支肺胞洗浄は、究極治療期間を決定するための複数の時点で収集しなければならないと思います。
イムノブロット解析は、アミロイドがオリゴマー タウと a β (図 3) などを含む、上清中に存在することを示しています。イムノブロット手順が標準、イムノブロット解析を開始する前に実行する必要があります重要なステップがあります。具体的には、培養上清こと集中して少なくとも 10 倍免疫ブロットする前に非集中の上澄みのアミロイドの量がのイムノブロットによる検出限界以下が重要です。ここで報告、遠心分離、フィルター搭載チューブを使用して、日常的にこの濃度ステップの使用方法が、TCA 沈殿物などの他の方法が同様のこの手順に便利になる合理的なようです。
重要な画像を用いた細胞の定量を表します。現在細胞死を定量化するための使用可能なプロシージャは死んだ細胞から LDH 放出の測定を許可するかなり高価なキットの購入に依存しています。ここで説明アッセイは、ImageJ プログラムは NIH のウェブサイトからダウンロードして無料、不要コストです。ImageJ プログラムの簡単な適応セル殺害のかなり正確な測定が可能します。ただし、輪郭を描かれたプロトコルのパフォーマンス中にマイナーな人工物のいくつかが発生したことを指摘する価値があります。主要な問題はフォーカル コンタクト エリアなどの細胞断片が細胞死ぬよう培養皿に関連付けられて残ることがあります。これらの残留細胞断片カメラによって検出することができます、セルがお皿に残っている人工の指示を与えます。など、この手順を使用して、100% セル殺害の値が得られることはまれです。
報告されたアッセイ系の弱点は、準備のグリコプロテイン アミロイドが完全に定義されていません。このように、定量は困難です。ELISA の試金は、各に備えて個々 の種について詳細な情報を提供することがなく異なるアミロイドのレベルの合計を提供するために使用できます。正確なアッセイまで質量仕様または体外アミロイド オリゴマーを合成、開発することができます最高の 1 つは現時点で行うことができます、セルの同じ番号を持つ各実験を開始、同じ期間インキュベートなど確認細胞毒性は、使用されている前の準備として同じ割合で発生します。確立された規範のいずれかからの変化は、追加の不確実性を紹介します。
要約すると、肺炎の原因となるエージェントと感染肺血管内皮細胞による毒性アミロイド分子の生産の「論証のため簡単な培養方法のとおりです。法は信頼でき、他の生物との使用感染した動物や人間の患者から得られた生物学的流体を用いた適応でしょう。これらのメソッドは肺炎の長期的な影響を調査し、研究および退院後の患者の終末器官障害につながるメカニズムを確立するために有用であります。

肺炎を生き残るための患者は次の病院退院1,ヶ月で死亡率を上昇している2,3,4,5,6。ほとんどの場合、死は、ストローク5,6と同様、腎、肺、心臓を含むエンド臓器不全や肝のイベントのいくつかのタイプで発生します。この患者集団で高い死亡率の原因は確立されていません。
肺炎がコミュニティ買収されるどちらかとして分類されるまたは院内 (院内)、および肺炎を引き起こすことができるエージェントは、細菌、ウイルス、菌類および化学薬品。院内肺炎の主要な原因の 1 つは緑膿菌です。膿はタイプ III の分泌システムを使用して、ターゲット セル7,8の細胞質に直接 exoenzymes と呼ばれる、様々 なエフェクター分子を転送するグラム陰性生物です。肺血管内皮細胞の感染、時に、exoenzymes は微小管関連蛋白タウ9,10、11,12 の内皮のフォームを含む、各種の細胞内タンパク質をターゲットします。、肺機能と、多くの場合、死に低下した重度の肺浮腫の結果血管内皮バリア破壊に至る、です。
前述したように、初期の肺炎を生き残るための患者は退院後最初の 12 ヶ月で死亡率を上昇しています。この現象を説明するための潜在的なメカニズムは、長期的な予後につながる初期の感染時に長命毒素のいくつかの種類が生成されることです。2 つの観測は、この可能性をサポートします。膿と最初に扱われる最初、培養肺血管内皮細胞は、細菌が抗生物質13によって殺された後の週までの増殖に失敗します。第二に、長命のプリオンとプリオンの特性を持つエージェントは、様々 な人間や動物疾患、特に病気に関連付けられている神経系14,15で実証されています。
肺感染症の中に長寿命の細胞毒性薬の潜在的な生産の調査の方法を記載されていること。ここで簡単な生体外の試金のシリーズのとおりグリコプロテイン生産と一般的なエージェントの肺炎原因、膿を使用して感染活動を調査するために使用できます。これらの試金は調査可能グリコプロテイン誘導感染、肺炎を引き起こす他のエージェントを使用して、次に容易に適応する必要があり、生成される清面も全部 cytotoxins の効果を調査するため役に立つはず臓器や動物。最後に、ここで最も可能性の高い説明は、アッセイは肺炎の中に cytotoxins の生産のための動物と人間の体液をテストに適応可能であります。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rabbit anti beta amyloid</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>71-5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A11 amyloid oligomer antibody</td>
			<td>StressMarq</td>
			<td>SPC-506D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T22 anti-tau oligomer antibody</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ABN454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 micron syringe filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP Goat antirabbit IgG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6721-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains PA103 and &#916;PcrV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Griffonia lectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L9381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC Helix pomatia lectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L1261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 micron nitrocellulose</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>162-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 2 collagenase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30898.03IH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PenStrep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin Disodium salt</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>795496-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium phosphate heptahydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>MP021914221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>50-103-5801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10277</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for detecting cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelial cells by pseudomonas aeruginosa

生き残る肺炎患者は、退院後数ヶ月で死亡率を上昇しています。肺炎肺組織の感染結果後続エンド臓器不全につながることができる長寿命の cytotoxins の生産をえられています。肺感染症の中に cytotoxins が生産されている仮説をテストするための in vitroアッセイを開発しました。ラット肺血管内皮細胞と細菌緑膿菌をモデル システムとして使用され、続いて細胞培養を用いた細菌による内皮細胞の伝染に続く cytoxins の生産を示す乳酸脱水素酵素アッセイと ImageJ 技術を活用した新規顕微鏡法を用いた直接定量から。これらの cytotoxins のアミロイドの性質を示した thioflavin T 結合の試金、イムノブロットおよび A11 抗アミロイド抗体を用いた immunodepletion。イムノブロット分析は、オリゴマー タウと a β が制作され膿によって感染内皮細胞が発表したことを示した。これらのメソッドは、ひと臨床サンプルの解析に容易に適応する必要があります。

簡単な生体外の試金は、緑膿菌に感染細胞の上清中に cytotoxins の存在を試金するためにしました。基本的には、感染細胞から培養液、細菌の添加後 4 h を収集、細菌、培養上清、フィルター殺菌によって削除されます、無菌培養上清がセルの新しい人口に追加されます。細胞上清添加後に 21-24 時間観察し、細胞の殺害を定量化します。
PMVECs の合流の層に緑膿菌の添加は、細胞間のギャップの形成を誘導します。生体内でギャップの形成は肺水腫、肺機能の低下につながります。細胞培養上清に十分な期間 PA103 と孵化のグリコプロテイン リリースの検診時間ポイントに示すように単層の細胞で形成し始めるギャップの存在によって示されるように記述されているアッセイでギャップ形成を使用します。図 1。ΔPcrV 細菌はこれらの培養条件下での細胞のギャップを誘発しません。ギャップが検出されると、清は収集、フィルター、滅菌し、素朴な細胞傷害活性を評価するために PMVECs に追加されます。彼らのそれぞれの上清中に PMVECs し、21-24 h のインキュベーターは、観察し、撮影します。図 2のように、膿ひずみ PA103 に感染していた PMVECs から収集した上清には上澄みの付加の後で 21 h によって培養された細胞の死を誘導 cytotoxins が含まれています。対照的に、細胞死が認められなかった HBSS 中か上清 ΔPcrV シュードモナス菌から収集した治療コントロール細胞。イムノブロット解析中 PMVECs (図 2) の接種 ΔPcrV 株によるアミロイドは生成されません、PA103 ひずみと感染症の中に含むオリゴマー タウと、a β アミロイドの分子が生成されることを示した。この試金で cytotoxins としてのアミロイドの役割は、培養細胞12を添加する前に清からアミロイドの immunodepletion によって確認されています。ここに示されていませんが完全に A11 抗アミロイド抗体 T22 反タウ オリゴマー抗体を用いた細胞上清の immunodepletion 使い果たす PA103 感染 (Balczon et al. 2017 生産培養上清から細胞障害活性12 Balczonら、準備のために)。
小説、安価で、単純なセル殺害の定量化法を開発しました。このアッセイの ImageJ ソフトウェアはセル (セル殺害を示す) を欠いているミクロな場での直接測定を許可するように適応されています。この方法の信頼性は、測定細胞から LDH 放出である殺害, セルの確立法との直接の比較によって検証されています。図 3に示すとおり、ImageJ ソフトウェアは白セルを含むミクロな場の領域と黒セルがない領域を変換する使用できます。その後、黒に白領域の単純な比は、セル殺害を測定する使用できます。セルのコンフルエント単層にはじまって、ミクロな場のすべての地域が白いです。ただし、cytotoxins を含む上清の付加の後で 18 h で、単分子膜のギャップを検出でした。36 h 後細胞上清添加まで直線的に増加し細胞を欠いている培養皿の領域の量。LDH リリースを測定するとき細胞上清添加後 18 時間で検出される最初 LDH リリースで同一の結果が得られました。LDH リリースは、上清添加 36 h で測定した最大セル殺害まで、直線的に増加します。少しの細胞死は、細胞上清 ΔPcrV 接種した細胞 (図 3) から収集または 36 時間 HBSS 培養を測定しました。
ThT 蛍光を測定することによって細菌細胞から解放アミロイドの量を定量化することができます。ThT にアミロイドの結合分子と増加蛍光強度で構造のシフトが発生します。このアッセイのキュベットに thioflavin T を追加し、ベースラインの蛍光を測定します。サンプルの小さい因数を追加している間、蛍光録画が停止します。蛍光にキュヴェットを返し、変更は蛍光性の放出が記録されます。図 4に示すように、上清は蛍光性の放出の増加によって示されるように膿含まれているアミロイド PA103 株培養細胞から集められます。対照的に、PMVECs ΔPcrV 株を接種から上澄み増加蛍光の不在によって示されるアミロイドを欠けていた。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57447/57447fig1.jpg"> 図 1。PMVEC 形態に及ぼすp inolculation.(A)および緑膿菌 PA103 ひずみの付加(B)の後の 4 時間前に PMVECs のコンフルエント単層。ギャップは、感染細胞の細胞膜ではっきり見ることが。スケールバー = 100 μ m.<a href="/files/ftp_upload/57447/57447fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57447/57447fig2.jpg"> 図 2。細胞培養上清の分析。[I] の部分。コントロールと扱われた細胞の代表的なイメージ。PMVECs は、21 h のいずれか PA103 細菌(B)または歪み ΔPcrV (C)を接種した細胞から得られた上清と扱われました。制御の細胞も培養 HBSS バッファー (A)21 h の。スケールバー = 100 μ m. [Ii]。ΔPcrV (A)または PA103 採集、培養上清の代表 immunoblots (B)感染 PMVECs。しみは、アミロイド (A11) またはオリゴマー タウ (T22) に対する抗体をプローブしました。Mr kDa の。<a href="/files/ftp_upload/57447/57447fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57447/57447fig3.jpg"> 図 3。セル殺害の定量します。(A)代表的な顕微鏡のフィールド フィールドの領域でを含むと細胞に欠けている変換されたいずれかに白または黒、それぞれ、ImageJ ソフトウェアを使用して (上清添加後 h) で異なる時間ポイント。同じ位相差画像前に変換しているのです。バー = 100 μ m。 (B)標準 LDH リリース試金と ImageJ の試金を使用して細胞の定量の比較。N = 4、* *p < 0.05 * * *p < 0.01。<a href="/files/ftp_upload/57447/57447fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57447/57447fig4v2.jpg"> 図 4。代表 ThT 蛍光アッセイ データ。ThT を含む空白のキュベットは興奮していた、425 nm 帯および発光蛍光が 482 で測定した nm。背景の蛍光性はからどちらか PA103- または ΔPcrV-接種キュヴェットに PMVECs を追加しました 20 s と清の収集されました。蛍光性の放出は 40 秒間記録されます。

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Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

検出細胞毒性アミロイド次感染症の肺による内皮細胞緑膿菌法

簡単な方法は、緑膿菌による肺血管内皮細胞の感染細胞傷害性のアミロイドの生産の「論証の説明します。

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

methods-for-detecting-cytotoxic-amyloids-following-infection

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

5.5K ビュー.  University of South Alabama. 簡単な方法は、緑膿菌による肺血管内皮細胞の感染細胞傷害性のアミロイドの生産の「論証の説明します。

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

共培養モデルの緑膿菌</emライブヒト気道細胞上に成長した>バイオフィルム

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

免疫・感染学

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

フローセル内の緑膿菌と出芽酵母のバイオフィルム

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

傷害性Tリンパ球によって媒介ベータ細胞死を評価するための方法

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the disease, is characterised by an accumulation of Plasmodium falciparum infected red blood cells (iRBC) at pigmented trophozoite stage in the microvasculature of the brain2-4. This microvessel obstruction (sequestration) leads to acidosis, hypoxia and harmful inflammatory cytokines (reviewed in 5). Sequestration is also found in most microvascular tissues of the human body2, 3. The mechanism by which iRBC attach to the blood vessel walls is still poorly understood.
The immortalized Human Brain microvascular Endothelial Cell line (HBEC-5i) has been used as an in vitro model of the blood-brain barrier6. However, Plasmodium falciparum iRBC attach only poorly to HBEC-5i in vitro, unlike the dense sequestration that occurs in cerebral malaria cases. We therefore developed a panning assay to select (enrich) various P. falciparum strains for adhesion to HBEC-5i in order to obtain populations of high-binding parasites, more representative of what occurs in vivo.
A sample of a parasite culture (mixture of iRBC and uninfected RBC) at the pigmented trophozoite stage is washed and incubated on a layer of HBEC-5i grown on a Petri dish. After incubation, the dish is gently washed free from uRBC and unbound iRBC. Fresh uRBC are added to the few iRBC attached to HBEC-5i and incubated overnight. As schizont stage parasites burst, merozoites reinvade RBC and these ring stage parasites are harvested the following day. Parasites are cultured until enough material is obtained (typically 2 to 4 weeks) and a new round of selection can be performed. Depending on the P. falciparum strain, 4 to 7 rounds of selection are needed in order to get a population where most parasites bind to HBEC-5i. The binding phenotype is progressively lost after a few weeks, indicating a switch in variant surface antigen gene expression, thus regular selection on HBEC-5i is required to maintain the phenotype.
In summary, we developed a selection assay rendering P. falciparum parasites a more "cerebral malaria adhesive" phenotype. We were able to select 3 out of 4 P. falciparum strains on HBEC-5i. This assay has also successfully been used to select parasites for binding to human dermal and pulmonary endothelial cells. Importantly, this method can be used to select tissue-specific parasite populations in order to identify candidate parasite ligands for binding to brain endothelium. Moreover, this assay can be used to screen for putative anti-sequestration drugs7.

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

An in vitro model for cerebral malaria sequestration is described1. Plasmodium falciparum infected red blood cells are selected for binding to immortalized human brain microvascular endothelial cells. The selected parasites show a distinct phenotype. The selection process can be applied using various P. falciparum strains and endothelial cell lines.

の選択熱帯熱マラリア原虫</em人間の脳内皮細胞へのCytoadhesion用>寄生虫

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

のRNAの単離緑膿菌マウス消化管に定着

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

細胞運命を以下に<em&gt; E大腸菌の</emラムダファージによる感染後&gt;

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

長期的な慢性<em&gt;緑膿菌</emマウスにおける&gt;気道感染

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

緑膿菌誘発肺傷害モデル

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von Willebrand Factor (VWF). This glycoprotein changes its molecular conformation in response to shear stress, thereby exposing binding sites for a broad spectrum of host-ligand interactions. In general, culturing of primary endothelial cells under a defined shear flow is known to promote the specific cellular differentiation and the formation of a stable and tightly linked endothelial layer resembling the physiology of the inner lining of a blood vessel. Thus, the functional analysis of interactions between bacterial pathogens and the host vasculature involving mechanosensitive proteins requires the establishment of pump systems that can simulate the physiological flow forces known to affect the surface of vascular cells.
The microfluidic device used in this study enables a continuous and pulseless recirculation of fluids with a defined flow rate. The computer-controlled air-pressure pump system applies a defined shear stress on endothelial cell surfaces by generating a continuous, unidirectional, and controlled medium flow. Morphological changes of the cells and bacterial attachment can be microscopically monitored and quantified in the flow by using special channel slides that are designed for microscopic visualization. In contrast to static cell culture infection, which in general requires a sample fixation prior to immune labeling and microscopic analyses, the microfluidic slides enable both the fluorescence-based detection of proteins, bacteria, and cellular components after sample fixation; serial immunofluorescence staining; and direct fluorescence-based detection in real time. In combination with fluorescent bacteria and specific fluorescence-labeled antibodies, this infection procedure provides an efficient multiple component visualization system for a huge spectrum of scientific applications related to vascular processes.

This study describes the microscopic monitoring of pneumococcus adherence to von Willebrand factor strings produced on the surface of differentiated human primary endothelial cells under shear stress in defined flow conditions. This protocol can be extended to detailed visualization of specific cell structures and quantification of bacteria by applying differential immunostaining procedures.

一定の流れの原発性ヒト内皮細胞の肺炎球菌感染

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype called mucoidy. Alginate is linked to chronic lung infections resulting in poor prognosis in patients with cystic fibrosis (CF). Understanding the pathways that regulate the production of alginate can aid in the development of novel therapeutic strategies targeting the alginate formation. Another disease-related phenotype is the small colony variant (SCV). SCV is due to the slow growth of bacteria and often associated with increased resistance to antimicrobials. In this paper, we first show a method of culturing a genetically defined form of P. aeruginosa SCV due to pyrimidine biosynthesis mutations. Supplementation of nitrogenous bases, uracil or cytosine, returns the normal growth to these mutants, demonstrating the presence of a salvage pathway that scavenges free bases from the environment. Next, we discuss two methods for the measurement of bacterial alginate. The first method relies on the hydrolysis of the polysaccharide to its uronic acid monomer followed by derivatization with a chromogenic reagent, carbazole, while the second method uses an ELISA based on a commercially available, alginate-specific mAb. Both methods require a standard curve for quantitation. We also show that the immunological method is specific for alginate quantification and may be used for the measurement of alginate in the clinical specimens.

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Here, we describe a growth condition to culture the small colony variant of Pseudomonas aeruginosa. We also describe two separate methods for the detection and quantitation of the exopolysaccharide alginate produced by P. aeruginosa using a traditional uronic acid carbazole assay and an alginate-specific monoclonal antibody (mAb) based ELISA.

緑膿菌の小コロニー変異体の培養とアルギン酸の定量

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...