הפרויקט המתואר נתמך על ידי מספר הפרס 5R01AI116895 מהמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות או מכוני בריאות הלאומיים.

1. דוגמאות יצירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים להפעיל ג difficile נבגים על 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחסן על הקרח. הערה: ג נבגי difficile ניתן לייצר וטהר כפי שתוארו לעיל 7,9,10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון הנביטה ב X + 1 מ&quot;ל כאשר X הוא מספר דגימות להילקח במהלך assay. הערה: פתרון הנביטה הוא ספציפית המינים של חיידקי Spore נלמדים. עבור assaying ג הנביטה נבג difficile, השתמשנו פתרון של 10 מ&quot;מ טריס (pH 7.5), 150 מ&quot;מ NaCl, 100 גליצין מ&quot;מ ו -10 מ&quot;מ חומצה taurocholic במים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת assay, לצייר מדגם 1.0 מיליליטר של פתרון הנביטה ללא נבגים לשמש ריק לגילוי שבר בקליפת המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף נבגים ל OD 600 של ~ 3.0 לפתרון נביטת המערבולת במהירות. הערה: מחקרי הנביטה שלנו ב subtilis, השתמשנו באותן OD 600 נבגים ובאשר ג difficile. הערה: סכום זה של נבגים עבד טוב לשחרור שבר בקליפת ניטור במהלך C. נביטת נבג difficile. כמות הנבגים המשמשת assay זה צריכה להיקבע באופן ניסיוני עבור כל חיידק או זן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדגם 1.2 מ&quot;ל מיד לאחר הוספת הנבגים צנטריפוגות בטמפרטורת החדר למשך דקות 1 ב 14,000 × גרם. זוהי נקודת אפס הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 1.0 מיליליטר של supernatant מן המדגם centrifuged לצינור טרי לניתוח שבר בקליפה שלאחר מכן. הערה: האם DPA צריך להיות פיקוח, להסיר מדגם נפרד 100 μl לצורך זיהוי של DPA בתמיסה באמצעות assay המבוסס על הקרינה terbium 9,18,19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את המדגם נאספו ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 1.4 ו -1.5 במרווחים קבועים עד בכל נקודות הזמן הושלמו. הערה: בגלל הזמן הדרוש צנטריפוגה ודגימה, מועדים לפי שעון ה פחות2 דקות זה מזה לא היו אפשריות במהלך ההליך שלנו, כך מרווחי הדגימה שלנו היו פעם כל 2 דקות במשך 14 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כביקורת חיובית להפחתת סוכר איתור וכימות, כוללים את הסכומים הבאים של N -acetylglucosamine (nmol): 0, 12.5, 25, 50, 100, 250, 500, ו -5,000. הכן דגימות אלה בעת ובעונה אחת כמו דגימות קליפה ולהפעיל יחד עם דגימות הקליפה כך עקום הסטנדרט רלוונטי הנתונים שעלו נבט נבגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הכל דגימות נקודת הזמן נאספים, Lyophilize הדגימות. הערה: אנו lyophilized דגימות שלנו צינורות 2 מ&quot;ל בורג מכסה. </li></ol> 2. מדידת Cortex שברי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend דגימות lyophilized ב 120 μl של 3 N HCl השלימו עם פנול 1% ו -0.5% β-mercaptoethanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות resuspended לצינורות בורג מכסה 2 מ&quot;ל. הערה: שחזור, להבטיח שכל המדגם lyophilized הוא resuspended והועבר. </li> &lt;li&gt; דגירת הדגימות באמבט מים הסירקולציה המחודשת על 95 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, מניח את הדגימות על קרח עד שהם מגניבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל את הדגימות עם 120 μl של 3 M NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 80 μl של פתרון סודיום ביקרבונט רווי 80 μl של פתרון אנהידריד אצטית 5% לטעום כל מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הדגימות חזרה באמבט מי C ° 95 בדיוק 3 דקות. הערה: שלב זה הוא זמן פעמים רגישות יותר יכולות להשפיע על התפתחות אות במורד זרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר דגימות מן האמבטיה במים מגניב על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 400 μl של 6.54% K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O כדי צינור כל מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הדגימות באמבט מים הסירקולציה המחודשת ב 95 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות בדיוק. הערה: שלב זה הוא זמן פעמים רגישות יותר יכולות להשפיע על התפתחות אות במורד זרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לְהַסִירהדגימות ומניחות על קרח למשך 5 דקות. </li></ol> 3. צבע מגיב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד דגימות הן על קרח (שלב 2.12), להכין את מגיב הצבע. ממיסים 0.320 גרם של p -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB; מגיב של ארליך) ב 1.9 מ&quot;ל של חומצה אצטית קרחונית. הערה: מגיב זמן, טמפרטורה רגישה לאור ולא צריך להיעשות מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר DMAB מתמוסס לחלוטין, להוסיף 100 μl של 10 N HCl ו מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של חומצה אצטית קרחונית מערבולת. </li></ol> 4. תגובת מדד-צבע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 100 μl של כל מקורר מדגם קליפת לצינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 700 μl של פתרון צבע טרי מוכן מדגם זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להעביר את דגימות באמבט מים 37 ° C ו דגירה של בדיוק 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 200 μl של כל דגימה לצלחת 96-גם ברורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את הדגימות ב 585 ננומטר על צלחתקוֹרֵא. דוגמאות צריכות להתחיל בכל צבע צהוב תגובה חיובית תעבור לסגול. ככל נוכחי הקליפה, הצבע הסגול העמוקה. </li></ol>

<ol>
	<li>Al-Hinai, M. A., Jones, S. W., Papoutsakis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Clostridium+sporulation+programs:+diversity+and+preservation+of+endospore+differentiation.">The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 79, 19-37 (2015).</li><li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+Bacillus+species:+what+we+know+and+do+not+know.">Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know.</a> J Bacteriol. 196, 1297-1305 (2014).</li><li>Tan, I. S., Ramamurthi, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spore+formation+in+Bacillus+subtilis.">Spore formation in Bacillus subtilis.</a> Environ Microbiol Rep. 6, 212-225 (2014).</li><li>Fimlaid, K. A., Shen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+mechanisms+regulate+sporulation+sigma+factor+activity+in+the+Firmicutes.">Diverse mechanisms regulate sporulation sigma factor activity in the Firmicutes.</a> Curr Opin Microbiol. 24, 88-95 (2015).</li><li>Popham, D. L., Helin, J., Costello, C. E., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+peptidoglycan+structure+of+Bacillus+subtilis+endospores.">Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores.</a> J Bacteriol. 178, 6451-6458 (1996).</li><li>Atrih, A., Zollner, P., Allmaier, G., Foster, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+Bacillus+subtilis+168+endospore+peptidoglycan+and+its+role+during+differentiation.">Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during differentiation.</a> J Bacteriol. 178, 6173-6183 (1996).</li><li>Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+salts+and+glycine+as+cogerminants+for+Clostridium+difficile+spores.">Bile salts and glycine as cogerminants for Clostridium difficile spores.</a> J. Bacteriol. 190, 2505-2512 (2008).</li><li>Paredes-Sabja, D., Shen, A., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile+spore+biology:+sporulation,+germination,+and+spore+structural+proteins.">Clostridium difficile spore biology: sporulation, germination, and spore structural proteins.</a> Trends Microbiol. 22 (7), (2014).</li><li>Francis, M. B., Allen, C. A., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spore+cortex+hydrolysis+precedes+DPA+release+during+Clostridium+difficile+spore+germination.">Spore cortex hydrolysis precedes DPA release during Clostridium difficile spore germination.</a> J Bacteriol. 197 (14), (2015).</li><li>Francis, M. B., Allen, C. A., Shrestha, R., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acid+recognition+by+the+Clostridium+difficile+Germinant+Receptor,+CspC,+is+important+for+establishing+infection.">Bile acid recognition by the Clostridium difficile Germinant Receptor, CspC, is important for establishing infection.</a> PLoS Pathog. 9, e1003356 (2013).</li><li>Moir, A., Smith, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genetics+of+bacterial+spore+germination.">The Genetics of bacterial spore germination.</a> Annu. Rev. Microbiol. 44, 531-553 (1990).</li><li>Zhang, P., Kong, L., Wang, G., Setlow, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Raman+tweezers+and+quantitative+differential+interference+contrast+microscopy+for+measurement+of+dynamics+and+heterogeneity+during+the+germination+of+individual+bacterial+spores.">Combination of Raman tweezers and quantitative differential interference contrast microscopy for measurement of dynamics and heterogeneity during the germination of individual bacterial spores.</a> Journal of biomedical optics. 15, 056010 (2010).</li><li>Ghuysen, J. -. M., Tipper, D. J., Strominger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymes+that+degrade+bacterial+cell+walls.">Enzymes that degrade bacterial cell walls.</a> Methods Enzymol. 8, 685-699 (1966).</li><li>Park, J. T., Johnson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+submicrodetermination+of+glucose.">A submicrodetermination of glucose.</a> J Biol Chem. 181, 149-151 (1949).</li><li>Thompson, J. S., Shockman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modification+of+the+Park+and+Johnson+reducing+sugar+determination+suitable+for+the+assay+of+insoluble+materials:+its+application+to+bacterial+cell+walls.">A modification of the Park and Johnson reducing sugar determination suitable for the assay of insoluble materials: its application to bacterial cell walls.</a> Anal Biochem. 22, 260-268 (1968).</li><li>Paredes-Sabja, D., Setlow, P., Sarker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SleC+is+essential+for+cortex+peptidoglycan+hydrolysis+during+germination+of+spores+of+the+pathogenic+bacterium+Clostridium+perfringens.">SleC is essential for cortex peptidoglycan hydrolysis during germination of spores of the pathogenic bacterium Clostridium perfringens.</a> J Bacteriol. 191, 2711-2720 (2009).</li><li>Paredes-Sabja, D., Sarker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+cortex-lytic+enzyme+SleC+from+non-food-borne+Clostridium+perfringens+on+the+germination+properties+of+SleC-lacking+spores+of+a+food+poisoning+isolate.">Effect of the cortex-lytic enzyme SleC from non-food-borne Clostridium perfringens on the germination properties of SleC-lacking spores of a food poisoning isolate.</a> Can J Microbiol. 56, 952-958 (2010).</li><li>Hindle, A. A., Hall, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dipicolinic+acid+(DPA)+assay+revisited+and+appraised+for+spore+detection.">Dipicolinic acid (DPA) assay revisited and appraised for spore detection.</a> The Analyst. 124, 1599-1604 (1999).</li><li>Kort, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+heat+resistance+of+bacterial+spores+from+food+product+isolates+by+fluorescence+monitoring+of+dipicolinic+acid+release.">Assessment of heat resistance of bacterial spores from food product isolates by fluorescence monitoring of dipicolinic acid release.</a> Appl Environ Microbiol. 71, 3556-3564 (2005).</li><li>Elson, L. A., Morgan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+colorimetric+method+for+the+determination+of+glucosamine+and+chondrosamine.">A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine.</a> The Biochemical journal. 27, 1824-1828 (1933).</li><li>Ramirez, N., Abel-Santos, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+germination+of+Clostridium+sordellii+spores+in+vitro.">Requirements for germination of Clostridium sordellii spores in vitro.</a> J. Bacteriol. 192, 418-425 (2010).</li><li>Akoachere, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indentification+of+an+in+vivo+inhibitor+of+Bacillus+anthracis+spore+germination.">Indentification of an in vivo inhibitor of Bacillus anthracis spore germination.</a> J. Biol. Chem. 282, 12112-12118 (2007).</li><li>Duncan, C. L., Strong, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+medium+for+sporulation+of+Clostridium+perfringens.">Improved medium for sporulation of Clostridium perfringens.</a> Appl Microbiol. 16, 82-89 (1968).</li><li>Heffron, J. D., Lambert, E. A., Sherry, N., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+four+cortex+lytic+enzymes+to+germination+of+Bacillus+anthracis+spores.">Contributions of four cortex lytic enzymes to germination of Bacillus anthracis spores.</a> J Bacteriol. 192, 763-770 (2010).</li><li>Meador-Parton, J., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+Bacillus+subtilis+spore+peptidoglycan+during+sporulation.">Structural analysis of Bacillus subtilis spore peptidoglycan during sporulation.</a> J Bacteriol. 182, 4491-4499 (2000).</li><li>Lambert, E. A., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacillus+anthracis+SleL+(YaaH)+protein+is+an+N-acetylglucosaminidase+involved+in+spore+cortex+depolymerization.">The Bacillus anthracis SleL (YaaH) protein is an N-acetylglucosaminidase involved in spore cortex depolymerization.</a> J Bacteriol. 190, 7601-7607 (2008).</li><li>Wang, S., Shen, A., Setlow, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Dynamic+Germination+of+Individual+Clostridium+difficile+Spores+Using+Raman+Spectroscopy+and+Differential+Interference+Contrast+Microscopy.">Characterization of the Dynamic Germination of Individual Clostridium difficile Spores Using Raman Spectroscopy and Differential Interference Contrast Microscopy.</a> J Bacteriol. 197, 2361-2373 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

על הגירוי, נבגים עוברים תהליך הנביטה לאבד התכונות העמידות שלהם ללא צורך סינתזת macromolecular. כאשר נביטת נבג מופעלת, ליבת הנבג משחררת DPA תמורת מים 2. בשל תכולת DPA הגבוהה של הנבג הרדום, ליבת הנבג היא בלחץ האוסמוטי אינטנסיבי ואת פפטידוגליקן המיוחד, קליפה, עוזר למנוע את הליבה של נפיחות המבצע במשחק, ככל הנראה, כמחסום רחב 2. השיטה המתוארת לעיל משתמשת מגיבה של ארליך (פתרון צהוב) כדי לזהות את נוכחותו של הפחתת סוכרים כמו שינוי מדיד כדי גוון סגול. במהלך הידרוליזה קליפה, סוכרים לנדנד NAM משוחררים (תלוי במידה של אנזימים hydrolyzing, סוכרים יכול להיות משוחרר כמו disaccharides או סוכרים). הידרוליזה של קשרים glycosidic ידי HCl (שלב 2.1) יוצרת מונוסכרידים עם קצוות צמצום חינם 7. לאחר neutralizing החומצה עם כמות שווה של נתרן הידרוקסידי (שלב 2.5), את כהלים סביב ולנדנד מונוסכרידים NAM הם acylated ידי אנהידריד אצטית (שלב 2.6) 13. בהמשך לכך, אנהידריד אצטית unreacted מומר חומצה אצטית על ידי חימום המדגם (שלב 2.8). כמו שיערו של מורגן אלסון 20, אלדהיד מסוף ממירה באופן ספונטני בצורה אנול. תחת תנאי בסיסי (שלב 2.10), טופס אנול זה יכול להגיב עם אצטיל סמוך ליצור נגזר oxazole אשר מגיב עם ריאגנט של ארליך (שלב 4.3) כדי ליצור צבע סגול 15,20. שיטה זו שתוארה לעיל מניב תוצאות עקביות אמינות לצורך זיהוי של שברי קליפה מן נובטי נבגים, הן ב subtilis ו- C. difficile 9,16,17. את assay דורש תשומת לב מיוחדת על מנת להבטיח את התגובה פעמים, טמפרטורות הליכים מתבצעות בדייקנות. ללא תשומת לב ראויהלפרטים, קל עבור תנאי התגובה להיכשל או לא לשחזר בין ניסויי 13. עם זאת, הכללת עזרי תקן נאג ביישום של assay בין סביבות מעבדה. התקן הבקרה החיובי נאג כלול בכל שולטת ניסוי עבור כל השתנות בין ניסוי (למשל, שינויים קלים זמן תגובה או יעילות של מגיב הצבע). תגובות באמצעות תנאי חיץ רק ותגובות עם נבגים מסוגלים hydrolyzing קליפה הן הניבו שום שינוי הצבע. הבעיה הנפוצה ביותר בשיטה זו היא השתנות בין-ניסיוני או חוסר מוחלט של אות. כדי לשלוט על ההשתנות, הכנות הנבג חייבות להיות נקיות מכל פסולת תא וגטטיבי. פסולת התא הזה תכיל שברי פפטידוגליקן (ולנדנד NAM) תגרום אות רקע גבוהה עבור הנבגים הנובטים. כדי להבטיח הכנת נבג טהורה (&gt; 99.9 נבגי%), עיין literatuמחדש עבור שיטות להכין השעיות נבג טהורות באורגניזם להיחקר 7,9,21-23. אם assay אינו מניב כל אות לזיהוי, צפינו כי הצעד lyophilizing יכול להציג השתנות. בשל הכח שבו הוואקום משתחרר, צפינו כי אבקת המדגם היבשה ניתן פוצצה מתוך הצינור המדגם. כדי להפחית / למנוע זאת התרחשות, השתמש מחט מזרק קטנה חורי הצמרות דוגמיות. האזור הקטן של החורים הציגו יפחית את הסבירות של מדגם lyophilized (כיום בצורת אבקה) מלהיות מוטרד. לבסוף, כפי שמצוין השיטות הנ&quot;ל, השלבים הדגירה כמה הם מאוד בתקופה רגישה. ודא שכל השלבים מתוזמן מנוטרים בקפידה. שיקול חשוב עבור assay זה הוא כי שברי הקליפה חייבים להשתחרר הנבג הנובט כדי להתגלות. אם הקליפה היא הידרוליזה לרסיסים גדולים, שברים אלה עשויים להיות גדולים מכדי להיות released דרך מעטפת הנבג. למרות שיקול חשוב בעת פתרון ניסוי שאינו להניב אות, אנו ממליצים לאשר כי התנאים בשימוש לנבוט ביותר של נבגי הפתרון ואת האפשרויות נוספות לפתרון בעיות האחרות המפורטות כאן לפני בהתחשב בגודל שבר בקליפה כמו בעיה פוטנציאלית assay. לא כל מאגרי הנביטה / תנאים מתאימים assay זה. בגלל זה assay מזהה הנוכחות של הפחתת סוכרים שוחררו במהלך תהליך הנביטה 13, כל חיץ נביטה המכיל הפחתת סוכרים או כל germinant כי הוא, כשלעצמו, סוכר צמצום (למשל, גלוקוז) יגרום איתות חזקה ב assay זה. אם זה המקרה, כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC) שניתן להשתמש בהם כדי לזהות נוכחות של שברי קליפת 24-26. עם זאת, כי לא כל המעבדות מצוידות במכשור כזה, השיטה המתוארת במסמך זה יכול להיות בשימוש על ידי רובמעבדות ומציע תוצאות פשוט לכימות בקלות. נביטה ידי נבגים של חיידקים נחקרה בעיקר Bacillus וכמה מינים Clostridium 2,8. התהליך נשמר בדרך כלל, אולם קיימים הבדלים. חשוב לציין, לא כל האורגניזמים לנבוט באמצעות מנגנונים של נביטה נבג כפי שנצפה במודל נבג-ומעצבי 9,27. בגלל נביטה הופכת למדה באורגניזמים מגוון יותר, assay שתואר לעיל ניתן ליישם אורגניזמים אלה כדי לזהות שברי קליפה במהלך נביטת נבג. על ידי יישום שיטה זו כדי היצורים שנחקרו חדשות הללו, חוקרים יכולים לקבוע את התפקיד חלבוני נביטה שונה לשחק הידרוליזה הקורטקס.

Endospores הם מטבולית צורות רדומות של חיידקים המאפשרים חיידקים להתמיד בסביבות שליליות. אצל חיידקים רבים יוצרי נבגים, יצירת נבגים היא מושרה על ידי מחסור באבות מזון אך תהליך זה יכול להיות נשלט על ידי שינויי pH, חשיפה לחמצן או מדגיש אחרים 1. בעוד בצורה מטבולית הרדומה הנבג שלהם, חיידקים להתנגד קרינת UV, התייבשות, בטמפרטורות גבוהות, והקפאת 2. רוב הידע על תהליך נביגה מגיעה ממחקרים באורגניזם מודל, subtilis Bacillus. תהליך נביגה מתחיל עם שכפול הדנ&quot;א ואת ההיווצרות של 3,4 נימה צירית. מחץ סימטרית אז מחלק התא לשני תאים בגודל שווה. התא הגדול יותר, התא האם, בולע את התא הקטן יותר, forespore. שניהם תא אמא forespore לתאם ביטוי גנים להבשיל לנבגים ואת התא האם בסופו של דבר lyses, שחרור דורמןt נבג לתוך הסביבה 1. מבנה הנבג וההרכב נשמרים על פני מינים רבים של חיידקים. ליבת הנבג יש תכולת מים נמוכה יותר מאשר בתא וגטטיבי והוא עשיר בחומצת dipicolinic (DPA) 1,2. במהלך יצירת נבגים, DPA נשאב לתוך ליבת נבג תמורת מים. המקיף את הליבה הוא קרום נבג פנימי שבו, רוב החיידקים ויוצרים נבג, הקולטנים אשר מזהים את המולקולות הקטנות המעודדות נביטה (germinants) ממוקמים 2. ממוקם ממש מחוץ הקרום הפנימי של הנבג היא שכבה של פפטידוגליקן דופן תא. שכבת פפטידוגליקן מיוחדת (קורטקס) המקיפה את פפטידוגליקן דופן תא והוא מורכב רב של אותם הרכיבים כמו פפטידוגליקן דופן תא [לסירוגין N-acetylglucosamine (נאג) וחומצת N-acetylmuramic (NAM)]. עם זאת, כ -50% של שאריות NAM בקליפה הומרו muramic-δ-לקטם 5,6 </sעד&gt;. במהלך נביטת נבג, שאריות muramic-δ-לקטם אלה מוכרות על ידי האנזימים הממסים קליפת נבג (SCLEs), ובכך מאפשרות את הקליפה להיות מושפלת (תהליך חיוני כדי להשלים נביטה) אבל לא את דופן התא. המקיף את הקליפה הוא קרום חיצוני וכמה שכבות של מעייל חלבונים 2. שליטה על תהליך הנביטה היא חשובה ביותר עבור חיידקים יוצרי נבגים. נביטה מופעלת כאשר קולטנים germinant אינטראקציה עם germinants שלהם 2. אצל חיידקים רבים יוצרי נבגים, germinants אלה הם חומצות אמינו, סוכרים, נוקלאוטידים, יונים או צירופם של אלה 2. ג נביטת נבג difficile היא שיזמה שילובים של חומצות מרות מסוימות, [למשל, חומצת taurocholic (ת&quot;א)] וחומצות אמינו (למשל, גליצין) 7-10. אמנם יש הבדלים בין ג מסלול נביטת difficile ואת המסלולים למדו אחרים נבג יוצריםחיידקים, כגון B. subtilis, משותף לכל הוא הדרישה ההכרחית כדי לבזות את קליפת הנבג לאפשר תא צמח לצמוח מן הנבג ניבט 2,8. השפלה Cortex ניתן להשיג על ידי SCLEs CwlJ / SleB (כפי שנמצאו ב subtilis) או SleC (כפי שנמצאו רבים וקלוסטרידיאה.את). הידרוליזה Cortex מפחיתה את המגבלה על קיר התא לבין הנבג. זה מאפשר התייבשות ליבה מלאה, צעד הכרחי בהפעלה מחדש של רבים מן החלבונים דרושים חילוף חומרים תאיים 2. כאשר נבגים לנבוט, שינויי הנבג הרדומים ממצב שלב בהיר למצב שלב כהה ותהליך זה יכול להימדד על ידי שינוי הצפיפות אופטית (OD) ב 600 ננומטר 11. דו&quot;ח קודם מצביע על כך הרבה מהשינוי הזה ב OD הוא עקב השחרור של DPA מן הנבג 12. במהלך מחקר שנערך לאחרונה שלנו, ביקשנו להשוות עיתוי ג נביטת נבג difficile וליוותה אתשחרורו של שברי DPA ואת קליפת 9. במחקר זה היה חיוני כדי לפקח על שחרורו של שברי קליפה כשהחלו להתפרסם על ידי נובטי נבגים. את assay colorimetric משמש כאן התבסס על שיטה לאיתור סוכרים עם קצות צמצום שפותח Ghuysen et al. 13. מכיוון אחרים תיארו פרוטוקולים לצורך זיהוי של סוכרים הפחתת 14 או שינית אותם פרוטוקולים 15, בספרות העוסקת בנושא זה יכול להיות מבלבל. כאן, אנו בפירוט צעד-אחר-צעד שיטה לאיתור colorimetric הפחתת סוכרים ששוחרר נובטת ג נבגי difficile. למרות מחקר זה משתמש ג נבגי difficile, סוכרי הצמצום שפורסמו במהלך הנביטה של נבגים מחיידקים אחרים להרכיב נבג מסוגלים להתגלות עם פרוטוקול זה 9,16,17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0 mL screw cap tube</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1420-3700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 eppendorf pippet</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 eppendorf pippet</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20 eppendorf pippet</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1250uL pipet tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-200uL pipet tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-D-glucosamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3286-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid - 10N</td>
			<td>BDH-Aristar</td>
			<td>BDH3032-3.8LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Anhydride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L04295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH0280-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Tetraborate tetrahydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>39435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH8019-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(Dimethylamino)benzaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>156477-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saturated Phenol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1750-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M3</td>
			<td colspan="2">Molecular Devices</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH3098-3.8LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated, Circulating Water Bath</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>Model 1136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtest 96</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td>96 well clear tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Blocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Machine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting cortex fragments during bacterial spore germination

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

טבלת 1 מראה תוצאות אופייניות באמצעות סטנדרטים נאג. נתונים משמשים ליצירת עקומה סטנדרטית. טבלה 2 מראה תוצאות אופייניות מתוך assay נביטה במאגר נביטה בתוספת 100 גליצין מ&quot;מ ו -10 המ&quot;מ ת&quot;א (תנאים לקידום נביטה) או 100 גליצין מ&quot;מ בלבד (תנאים שאינם נובטים). בהעדר ת&quot;א, ג נבגי difficile לא לנבוט ויש שינוי קטן בנוכחות שברת קליפה בתמיסה. עם זאת, בנוכחות שני ת&quot;א גליצין, ג נבגי difficile לנבוט ולשחרר שברי קליפה לתוך התמיסה. זה הוא ציין גם מגידול OD 585 לאורך זמן של דגימות הגיבו. הסכום הכולל של שברי קליפת המוח (nmol) שפורסמו במהלך assay זה חושב באמצעות עקומת סטנדרט דומה איור 1B. ב assay זה, רוב הקורטקס הוא הידרוליזה (או שוחרר) ב -15 דקות פוסטחשיפת germinant, דבר המצביעה על כך שרוב הנבגים ניבטו במסגרת הזמן הזה (איור 2; בקנה אחד עם פרסום קודם 7). לאחר פיתוח הדגימות מגיבים הצבע, רוב הדגימות לא יכול להראות את הצבע הסגול לעין בלתי המזוינת. איור 1 מציג מדגם מייצג שנוצר בין ה- N-acetylglucosamine. רבים מן הדגימות לא מראים צבע סגול גלוי. עם זאת, 250 nmol, 500 nmol ו -5,000 nmol דגימות להופיע ויזואלית שונה בקרה שלילית (0 nmol). כאשר הנמדדים ננומטר OD 585, האות שנוצר בצורה מיטבית רגרסיה ליניארית (R 2 = 0.999). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54146/54146fig1.jpg" /> איור 1:. זיהוי N-acetylglucosamine (א) דגימות N-acetylglucosamine (0 nmol, 12.5 nmol,25 ננומול, 50 ננומול, 100 nmol, 250 nmol, 500 nmol, 5,000 nmol) היו lyophilized והגיב בהתאם לנוהל המתואר. דוגמאות (B) נוספו צלחת 96-היטב את כמות החומר הגיב זוהתה 585 ננומטר. האות היה השתמש כדי ליצור עקומת סטנדרט. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54146/54146fig2.jpg" /> איור 2:. ייצוג גרפי של תוצאות הנביטה קליפת nmol מחושב בטבלה 2 היה להתוות לעומת הזמן. (●) 100 מ&quot;מ גליצין + 10 מ&quot;מ ת&quot;א; (■) 100 מ&quot;מ גליצין. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54146/54146fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ריכוז נאג (nmol) </td><td> OD 585 </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 0.047 </td></tr><tr><td> 12.5</td><td> 0.054 </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 0.066 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 0.084 </td></tr><tr><td> 100 </td><td> 0.128 </td></tr><tr><td> 250 </td><td> 0.285 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> .556 </td></tr><tr><td> 5,000 </td><td> 4.0 </td></tr><tr><td> = ריק </td><td> 0.046 </td></tr></tbody></table> טבלה 1: נאג רגיל. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Clostridium difficile Spore נביטה </td></tr><tr><td></td><td colspan="4"> פתרון נביטה (10 מ&quot;מ טריס (7.5 pH), 150 מ&quot;מ NaCl) </td></tr><tr><td></td><td colspan="2"> 100 מ&quot;מ גליצין + 10 מ&quot;מ ת&quot;א </td><td colspan="2"> 100 מ&quot;מ גליצין </td></tr><tr><td> זמן (דקות) </td><td> OD 585 </td><td>מחושב (nmol) </td><td> OD 585 </td><td> מחושב (nmol) </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 0.046 </td><td> 0.00 </td><td> 0.047 </td><td> 0.00 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0.048 </td><td> 2.54 </td><td> 0.048 </td><td> 1.27 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 0.05 </td><td> 5.07 </td><td> 0.049 </td><td> 2.54 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 0.055 </td><td> 11.41 </td><td> 0.05 </td><td> 3.80 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 0.059 </td><td> 16.49 </td><td> 0.05 </td><td> 3.80 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 0.06 </td><td> 17.76 </td><td> .051 </td><td> 5.07 </td></tr><tr><td> 12 </td><td> 0.061 </td><td> 19.02 </td><td> 0.05 </td><td> 3.80 </td></tr><tr><td> 14 </td><td> .063 </td><td> 21.56 </td><td> .051 </td><td> 5.07 </td></tr></tbody></table> טבלה 2: בואו לטעום Spore Germinatiעל תוצאות.

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination at JoVE.com

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

זיהוי Cortex שבר במהלך בקטריאלי Spore נביטה

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

detecting-cortex-fragments-during-bacterial-spore-germination

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.3K Views.  Texas A&M University. Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

Video: Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Propagating and Detecting an Infectious Molecular Clone of Maedi-visna Virus that Expresses Green Fluorescent Protein

Maedi-visna virus (MVV) is a lentivirus of sheep, causing slowly progressive interstitial pneumonia and encephalitis1. The primary target cells of MVV in vivo are considered to be of the monocyte lineage2. Certain strains of MVV can replicate in other cell types, however3,4. The green fluorescent protein is a commonly used marker for studying lentiviruses in living cells. We have inserted the egfp gene into the gene for dUTPase of MVV. The dUTPase gene is well conserved in most lentivirus strains of sheep and goats and has been shown to be important in replication of CAEV5. However, dUTPase has been shown to be dispensable for replication of the molecular clone of MVV used in this study both in vitro and in vivo6. MVV replication is strictly confined to cells of sheep or goat origin. We use a primary cell line from the choroid plexus of sheep (SCP cells) for transfection and propagation of the virus7. The fluorescent MVV is fully infectious and EGFP expression is stable over at least 6 passages8. There is good correlation between measurements of TCID50 and EGFP. This virus should therefore be useful for rapid detection of infected cells in studies of cell tropism and pathogenicity in vitro and in vivo8.

We describe a molecular clone of maedi-visna virus that expresses GFP and is fully infectious. Replication of this virus can be detected by using fluorescence microscopy and flow cytometry.

הפצת ועל גילוי Clone מולקולרית זיהומיות של וירוס Maedi-visna המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק

Maedi-visna virus (MVV) is a lentivirus of sheep, causing slowly progressive interstitial pneumonia and encephalitis1. The primary target cells of MVV in ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

רוק, בלוטות הרוק, וכן אוסף Hemolymph מ קרציות קרצית Scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of bacteria in gene and cell therapy for cancer. Bacteria present an attractive class of vector for cancer therapy, possessing a natural ability to grow preferentially within tumors following systemic administration. Bacteria engineered to express the lux gene cassette permit BLI detection of the bacteria and concurrently tumor sites. The location and levels of bacteria within tumors over time can be readily examined, visualized in two or three dimensions. The method is applicable to a wide range of bacterial species and tumor xenograft types. This article describes the protocol for analysis of bioluminescent bacteria within subcutaneous tumor bearing mice. Visualization of commensal bacteria in the Gastrointestinal tract (GIT) by BLI is also described. This powerful, and cheap, real-time imaging strategy represents an ideal method for the study of bacteria in vivo in the context of cancer research, in particular gene therapy, and infectious disease. This video outlines the procedure for studying lux-tagged E. coli in live mice, demonstrating the spatial and temporal readout achievable utilizing BLI with the IVIS system.

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This article describes the administration of lux-tagged bacteria to mice and subsequent in vivo analysis using IVIS bioluminescence imaging.

הדמיה בקטריאלי bioluminescent<em&gt; In Vivo</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

גילוי גליקוגן בתאי הדם היקפי mononuclear עם תקופתי חומצה שיף מכתים

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. This information is particularly valuable in the context of host-pathogen interactions. Many pathogen proteins function within host cells in a variety of way such as, enabling evasion of the host immune system and survival within the intracellular environment. To study these pathogen-protein host-cell interactions, several approaches are commonly used, including: in vivo infection with a strain expressing a tagged or mutant protein, or introduction of pathogen genes via transfection or transduction. Each of these approaches has advantages and disadvantages. We sought a means to directly introduce exogenous proteins into cells. Electroporation is commonly used to introduce nucleic acids into cells, but has been more rarely applied to proteins although the biophysical basis is exactly the same. A standard electroporator was used to introduce affinity-tagged bacterial effectors into mammalian cells. Human epithelial and mouse macrophage cells were cultured by traditional methods, detached, and placed in 0.4 cm gap electroporation cuvettes with an exogenous bacterial pathogen protein of interest (e.g. Salmonella Typhimurium GtgE). After electroporation (0.3 kV) and a short (4 hr) recovery period, intracellular protein was verified by fluorescently labeling the protein via its affinity tag and examining spatial and temporal distribution by confocal microscopy. The electroporated protein was also shown to be functional inside the cell and capable of correct subcellular trafficking and protein-protein interaction. While the exogenous proteins tended to accumulate on the surface of the cells, the electroporated samples had large increases in intracellular effector concentration relative to incubation alone. The protocol is simple and fast enough to be done in a parallel fashion, allowing for high-throughput characterization of pathogen proteins in host cells including subcellular targeting and function of virulence proteins.

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

Electroporation של effectors בקטריאלי פונקציונלי לתאי יונקים

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible for most malaria-related deaths globally. Several factors including parasite sequestration in tissues, vascular dysfunction, and inflammatory responses influence the evolution of the disease in malaria-infected people. P. falciparum-infected red blood cells (iRBCs) release small extracellular vesicles (EVs) containing different kinds of cargo molecules that mediate pathogenesis and cellular communication between parasites and host. EVs are efficiently taken up by cells in which they modulate their function. Here we discuss strategies to address the role of EVs in parasite-host interactions. First, we describe a straightforward method for labeling and tracking EV internalization by endothelial cells, using a green cell linker dye. Second, we report a simple way to measure permeability across an endothelial cell monolayer by using a fluorescently labeled dextran. Finally, we show how to investigate the role of small non-coding RNA molecules in endothelial cell function.

In this work, we describe protocols to investigate the role of extracellular vesicles (EVs) released by Plasmodium falciparum infected erythrocytes. In particular, we focus on the interactions of EVs with endothelial cells.

הערכה של תפקוד שלפוחית חוץ-תאית במהלך מלריה זיהום

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

שיטות זיהוי ציטוטוקסיות Amyloids הבאים זיהום של אנדותל תאי הריאות על ידי Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure makes the spore extremely stable and resistant and has suggested the use of the spore as a platform to display heterologous molecules. So far, a variety of antigens and enzymes have been displayed on spores of Bacillus subtilis and of a few other species, initially by a recombinant approach and, then, by a simple and efficient nonrecombinant method. The nonrecombinant display system is based on the direct adsorption of heterologous molecules on the spore surface, avoiding the construction of recombinant strains and the release of genetically modified bacteria in the environment. Adsorbed molecules are stabilized and protected by the interaction with spores, which limits the rapid degradation of antigens and the loss of enzyme activity at unfavorable conditions. Once utilized, spore-adsorbed enzymes can be collected easily with a minimal reduction of activity and reused for additional reaction rounds. In this paper is shown how to adsorb model molecules to purified spores of B. subtilis, how to evaluate the efficiency of adsorption, and how to collect used spores to recycle them for new reactions.

This protocol focuses on the use of bacterial spores as a &#34;live&#34; nanobiotechnological tool to adsorb heterologous molecules with various biological activities. The methods to measure the efficiency of adsorption are also shown.

נבג ספיחה כמערכת התצוגה Nonrecombinant אנזימים ו אנטיגנים

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

תפוקה גבוהה שיגלה-Assay אחרים ספציפיים

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...