シゲラ研究分野では、現在、免疫や感染によって生成される抗体の機能的役割を調べるための十分に定義されたアッセイが欠けています。このアッセイは、これらの免疫応答を修飾し、シゲラ特異的抗体の殺菌活性を測定するための明確に定義された方法を表す。このアッセイの主な利点は、複数のサンプルの高スループット分析が可能である点です。
このプロトコルで使用される技術は、抗体および血清サンプルの直接細菌の殺滅を測定するために、実践的な時間と全体的なアッセイ時間を大幅に短縮します。まず、56°Cの温水浴でサンプルを30分間加熱し、テストサンプルを活性化させます。アッセイプレートと20マイクロリットルのアッセイバッファーを1列から12行Aから12列まで取得し、各試験サンプルの列1および2列に20マイクロリットルのアッセイバッファーを追加し、アッセイプレートの行Hに複製します。
試験サンプルの三重の連続希釈を行う開始するには、マルチチャンネルピペットを使用して、ウェル3Hから12Hまでの10マイクロリットルを除去します。サンプルをG行とピペットの上下8~10回の対応するウェルに移し、サンプルをよく混ぜます。次に、これらのウェルから10マイクロリットルを取り除きます。
行Fとピペットの対応する井戸に8〜10回上下に移して混ぜます。行Aを通してこのシリアル希釈プロセスを続ける.行Aの井戸を混合した後、すべての井戸の最終容積が20マイクロリットルになるように、井戸3Aから12Aまでの10マイクロリットルを取り除いて捨てます。凍結対象細菌ストックのバイアルを1個取り出し、室温で解凍します。
次いで、20ミリリットルのアッセイバッファーで細菌を希釈します。所定の最適希釈係数に従って。マルチチャネルピペットを使用して、アッセイプレートの各ウェルに希釈細菌10マイクロリットルを加えます。
冷凍赤ちゃんウサギの賛辞の1バイアルと凍結熱活性化BRCの1バイアルを取得します。冷たい流水を使用してバイアルを室温まで解凍します。次に、100マイクロリットルの熱活性化BRCを400マイクロリットルのアッセイバッファーと混合します。
この20%の熱活性化BRC溶液の50マイクロリットルを列1のすべての井戸に加えます。天然BRCの1ミリリットルをアッセイバッファーの4ミリリットルと混合します。この20%の混合物の50マイクロリットルを2から12列のすべての井戸に加えます。
プレート1をプレートシェーカー1枚1枚10~15秒間置き、アッセイプレートを軽く混ぜます。微生物学的インキュベーターでアッセイプレートを2時間インキュベートします。一方、2つのLB寒天プレートから蓋を取り外し、プレートを生物学的安全キャビネットに40〜60分間置いて乾燥させます。
インキュベーションが完了したら、アッセイプレートを湿った氷に移し、10〜20分間インキュベートして反応を停止します。12チャネルピペットを使用して、LBAプレートの底に反応混合物の10マイクロリットルの行Hとスポットプレートのウェルを混合します。すぐにプレートを傾け、スポットが約1.5〜2センチメートルの間実行されるようにします。
行 G、F、および E に対して、前の行の上に配置して、この手順を繰り返します。溶液がLBAプレートに吸収されるまで、室温でLBAプレートをインキュベートします。その後、蓋をプレートに置き、それらを逆さまに微生物学的インキュベーターに移して一晩インキュベートします。
翌日、25ミリリットルのオーバーレイ寒天を摂氏55度で加え、1ミリリットルTTCあたり100マイクログラム、各LBAプレートに0.1%のアジドナトリウムを含む。生き残った細菌が赤い色を発達できるように、摂氏37度で2時間インキュベートします。次に、デジタルカメラを使用してプレートを撮影します。
画像をコンピュータに転送し、NISTの統合コロニー列挙ソフトウェアを使用して、テキストプロトコルで概説されているように画像を分析します。代表的なLBAプレートは、一晩のインキュベーションとオーバーレイの追加後に色の発達が行われ、生き残ったコロニーはすべて赤で見られることを示しています。細菌の殺傷は、最初の3つの希釈で試験されたすべてのサンプルについてはっきりと見られる。
細菌の殺死の減少は、サンプルがプレートのさらに上に希釈され、血清があまり濃縮されていないので見られる。マイクロコロニー数は、NISTソフトウェアを使用して実行されます。各サンプルの各希釈の平均 CFU カウントは、50% の強制終了値と同様に計算されます。
この50%の殺死値は、各血清希釈の平均CFUsに適用され、SBA KIの計算に必要な値を決定します。このプロトコルはLBオーガーの一貫した均一な細菌のめっきに依存する。良いスポットめっきおよび傾斜技術は離散的なマイクロコロニーおよび正確なコロニーの数えの成長を可能にする。この技術は、生きた毒性シゲラを使用し、適切な無菌技術とPPEを必要とし、細菌がBSL 2手順に従って安全に処理されることを保証する。
