ويدعم المشروع التي وصفها جائزة عدد 5R01AI116895 من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية أو المعاهد الوطنية للصحة.

1. عينات توليد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحرارة تفعيل C. صعب الجراثيم عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وتخزينها على الجليد. ملاحظة: C. جراثيم صعب يمكن أن تنتج وتنقيته كما هو موضح سابقا 7،9،10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل الإنبات في X + 1 مل حيث X هو عدد العينات التي تؤخذ أثناء الفحص. ملاحظة: الحل إنبات محددة لأنواع من البكتيريا الجراثيم التي تجري دراستها. لمعايرة C. صعب بوغ الإنبات، استخدمنا حل 10 ملي تريس (7.5 درجة الحموضة)، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 100 الجلايسين ملي و 10 ملي حمض taurocholic في الماء منزوع الأيونات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البدء في الفحص، رسم 1.0 مل عينة من الحل إنبات الجراثيم دون أن تكون فارغة للكشف عن القشرة شظية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الجراثيم إلى OD 600 من ~ 3.0 إلى حل الإنبات ودوامة بسرعة. ملاحظة: للحصول على الدراسات الإنبات لدينا في B. الرقيقة، استخدمنا نفس OD 600 الجراثيم بالنسبة للC. صعب. ملاحظة: هذا المبلغ من الجراثيم عملت بشكل جيد للرصد القشرة الافراج عن جزء خلال C. صعب بوغ الإنبات. وينبغي أن تحدد كمية من الجراثيم المستخدمة في هذا الاختبار تجريبيا لكل بكتيريا أو السلالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 1.2 مل عينة فورا بعد إضافة الجراثيم وأجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة في 14000 × ز. وهذه هي النقطة الساعة الصفر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 1.0 مل من طاف من العينة طرد لأنبوب جديد لتحليل قشرة جزء لاحق. ملاحظة: يجب DPA تحتاج إلى رصد، إزالة عينة 100 ميكرولتر منفصلة للكشف عن DPA في الحل باستخدام مقايسة على أساس التيربيوم مضان 9،18،19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد العينة التي تم جمعها في -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 1.4 و 1.5 على فترات منتظمة حتى الانتهاء من جميع نقاط الوقت. ملاحظة: بسبب الوقت اللازم لالطرد المركزي وأخذ العينات، ونقاط وقت أقل عشركان ل2 دقيقة بعيدا يكن من الممكن أثناء إجراء دينا، لذلك كانت فترات أخذ العينات لدينا مرة واحدة كل دقيقة 2 لمدة 14 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما تحكم إيجابية للحد من الكشف عن السكر وتقدير، وتشمل المبالغ التالية N -acetylglucosamine (نانومول): 0، 12.5، 25، 50، 100، 250، 500، و 5،000. إعداد هذه العينات في نفس الوقت الذي عينات القشرة وتشغيل جنبا إلى جنب مع عينات القشرة بحيث منحنى هو معيار ذات الصلة البيانات التي تم إنشاؤها من قبل الإنبات جراثيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن يتم جمع كل العينات نقطة زمنية، يجفد العينات. ملاحظة: نحن مجفف بالتجميد عينات لدينا في 2 مل أنابيب المسمار الحد الأقصى. </li></ol> 2. قياس اللحاء شظايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend العينات مجفف بالتجميد في 120 ميكرولتر من 3 N حمض الهيدروكلوريك تستكمل مع الفينول 1٪ و 0.5٪ β-المركابتويثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العينات معلق إلى 2 مل أنابيب المسمار الحد الأقصى. ملاحظة: للحصول على التكاثر، وضمان معلق كل عينة مجفف بالتجميد ونقل. </li> &lt;لى&gt; احتضان هذه العينات في حمام مائي إعادة تدوير في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة، ووضع العينات على الجليد حتى أنها باردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحييد العينات مع 120 ميكرولتر من 3 M هيدروكسيد الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 80 ميكرولتر من محلول بيكربونات الصوديوم المشبعة و 80 ميكرولتر من 5٪ محلول أنهيدريد الخل لكل عينة ودوامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العينات إلى 95 ° C حمام الماء لمدة 3 دقائق بالضبط. ملاحظة: هذه الخطوة وقتا طويلا الأوقات الحساسة وأطول يمكن أن يؤثر على نمو إشارة المصب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عينات من الحمام المائي وتبرد على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 400 ميكرولتر من 6.54٪ K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O لكل أنبوب والدوامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان هذه العينات في حمام مائي إعادة تدوير في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 7 دقائق بالضبط. ملاحظة: هذه الخطوة وقتا طويلا الأوقات الحساسة وأطول يمكن أن يؤثر على نمو إشارة المصب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالةالعينات ومكان على الجليد لمدة 5 دقائق. </li></ol> 3. اللون الكاشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما العينات على الجليد (الخطوة 2.12)، وإعداد كاشف اللون. حل 0.320 غرام من ص -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB، كاشف إرليخ) في 1.9 مل من حمض الخليك الجليدي. ملاحظة: الكاشف الوقت ودرجة الحرارة والضوء حساسة ويجب أن لا يتم مقدما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد DMAB يذوب تماما، إضافة 100 ميكرولتر من 10 N حمض الهيدروكلوريك ودوامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل من حمض الخليك الجليدي ودوامة. </li></ol> 4. رد الفعل اللونية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 100 ميكرولتر من كل عينة تبرد القشرة إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 700 ميكرولتر من محلول اللون الطازجة إلى كل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الفور نقل العينات إلى 37 درجة مئوية الماء حمام واحتضان لمدة 20 دقيقة بالضبط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 200 ميكرولتر من كل عينة إلى لوحة 96-جيدا واضحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد العينات عند 585 نانومتر على طبق من ذهبقارئ. وينبغي أن تبدأ عينات في اللون الأصفر، وسوف رد فعل إيجابي يتحول إلى اللون الأرجواني. المزيد من القشرة الوقت الحاضر، وعمق اللون الأرجواني. </li></ol>

<ol>
	<li>Al-Hinai, M. A., Jones, S. W., Papoutsakis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Clostridium+sporulation+programs:+diversity+and+preservation+of+endospore+differentiation.">The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 79, 19-37 (2015).</li><li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germination+of+spores+of+Bacillus+species:+what+we+know+and+do+not+know.">Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know.</a> J Bacteriol. 196, 1297-1305 (2014).</li><li>Tan, I. S., Ramamurthi, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spore+formation+in+Bacillus+subtilis.">Spore formation in Bacillus subtilis.</a> Environ Microbiol Rep. 6, 212-225 (2014).</li><li>Fimlaid, K. A., Shen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+mechanisms+regulate+sporulation+sigma+factor+activity+in+the+Firmicutes.">Diverse mechanisms regulate sporulation sigma factor activity in the Firmicutes.</a> Curr Opin Microbiol. 24, 88-95 (2015).</li><li>Popham, D. L., Helin, J., Costello, C. E., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+peptidoglycan+structure+of+Bacillus+subtilis+endospores.">Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores.</a> J Bacteriol. 178, 6451-6458 (1996).</li><li>Atrih, A., Zollner, P., Allmaier, G., Foster, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+Bacillus+subtilis+168+endospore+peptidoglycan+and+its+role+during+differentiation.">Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during differentiation.</a> J Bacteriol. 178, 6173-6183 (1996).</li><li>Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+salts+and+glycine+as+cogerminants+for+Clostridium+difficile+spores.">Bile salts and glycine as cogerminants for Clostridium difficile spores.</a> J. Bacteriol. 190, 2505-2512 (2008).</li><li>Paredes-Sabja, D., Shen, A., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile+spore+biology:+sporulation,+germination,+and+spore+structural+proteins.">Clostridium difficile spore biology: sporulation, germination, and spore structural proteins.</a> Trends Microbiol. 22 (7), (2014).</li><li>Francis, M. B., Allen, C. A., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spore+cortex+hydrolysis+precedes+DPA+release+during+Clostridium+difficile+spore+germination.">Spore cortex hydrolysis precedes DPA release during Clostridium difficile spore germination.</a> J Bacteriol. 197 (14), (2015).</li><li>Francis, M. B., Allen, C. A., Shrestha, R., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acid+recognition+by+the+Clostridium+difficile+Germinant+Receptor,+CspC,+is+important+for+establishing+infection.">Bile acid recognition by the Clostridium difficile Germinant Receptor, CspC, is important for establishing infection.</a> PLoS Pathog. 9, e1003356 (2013).</li><li>Moir, A., Smith, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genetics+of+bacterial+spore+germination.">The Genetics of bacterial spore germination.</a> Annu. Rev. Microbiol. 44, 531-553 (1990).</li><li>Zhang, P., Kong, L., Wang, G., Setlow, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Raman+tweezers+and+quantitative+differential+interference+contrast+microscopy+for+measurement+of+dynamics+and+heterogeneity+during+the+germination+of+individual+bacterial+spores.">Combination of Raman tweezers and quantitative differential interference contrast microscopy for measurement of dynamics and heterogeneity during the germination of individual bacterial spores.</a> Journal of biomedical optics. 15, 056010 (2010).</li><li>Ghuysen, J. -. M., Tipper, D. J., Strominger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymes+that+degrade+bacterial+cell+walls.">Enzymes that degrade bacterial cell walls.</a> Methods Enzymol. 8, 685-699 (1966).</li><li>Park, J. T., Johnson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+submicrodetermination+of+glucose.">A submicrodetermination of glucose.</a> J Biol Chem. 181, 149-151 (1949).</li><li>Thompson, J. S., Shockman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modification+of+the+Park+and+Johnson+reducing+sugar+determination+suitable+for+the+assay+of+insoluble+materials:+its+application+to+bacterial+cell+walls.">A modification of the Park and Johnson reducing sugar determination suitable for the assay of insoluble materials: its application to bacterial cell walls.</a> Anal Biochem. 22, 260-268 (1968).</li><li>Paredes-Sabja, D., Setlow, P., Sarker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SleC+is+essential+for+cortex+peptidoglycan+hydrolysis+during+germination+of+spores+of+the+pathogenic+bacterium+Clostridium+perfringens.">SleC is essential for cortex peptidoglycan hydrolysis during germination of spores of the pathogenic bacterium Clostridium perfringens.</a> J Bacteriol. 191, 2711-2720 (2009).</li><li>Paredes-Sabja, D., Sarker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+cortex-lytic+enzyme+SleC+from+non-food-borne+Clostridium+perfringens+on+the+germination+properties+of+SleC-lacking+spores+of+a+food+poisoning+isolate.">Effect of the cortex-lytic enzyme SleC from non-food-borne Clostridium perfringens on the germination properties of SleC-lacking spores of a food poisoning isolate.</a> Can J Microbiol. 56, 952-958 (2010).</li><li>Hindle, A. A., Hall, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dipicolinic+acid+(DPA)+assay+revisited+and+appraised+for+spore+detection.">Dipicolinic acid (DPA) assay revisited and appraised for spore detection.</a> The Analyst. 124, 1599-1604 (1999).</li><li>Kort, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+heat+resistance+of+bacterial+spores+from+food+product+isolates+by+fluorescence+monitoring+of+dipicolinic+acid+release.">Assessment of heat resistance of bacterial spores from food product isolates by fluorescence monitoring of dipicolinic acid release.</a> Appl Environ Microbiol. 71, 3556-3564 (2005).</li><li>Elson, L. A., Morgan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+colorimetric+method+for+the+determination+of+glucosamine+and+chondrosamine.">A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine.</a> The Biochemical journal. 27, 1824-1828 (1933).</li><li>Ramirez, N., Abel-Santos, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+germination+of+Clostridium+sordellii+spores+in+vitro.">Requirements for germination of Clostridium sordellii spores in vitro.</a> J. Bacteriol. 192, 418-425 (2010).</li><li>Akoachere, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indentification+of+an+in+vivo+inhibitor+of+Bacillus+anthracis+spore+germination.">Indentification of an in vivo inhibitor of Bacillus anthracis spore germination.</a> J. Biol. Chem. 282, 12112-12118 (2007).</li><li>Duncan, C. L., Strong, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+medium+for+sporulation+of+Clostridium+perfringens.">Improved medium for sporulation of Clostridium perfringens.</a> Appl Microbiol. 16, 82-89 (1968).</li><li>Heffron, J. D., Lambert, E. A., Sherry, N., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+four+cortex+lytic+enzymes+to+germination+of+Bacillus+anthracis+spores.">Contributions of four cortex lytic enzymes to germination of Bacillus anthracis spores.</a> J Bacteriol. 192, 763-770 (2010).</li><li>Meador-Parton, J., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+Bacillus+subtilis+spore+peptidoglycan+during+sporulation.">Structural analysis of Bacillus subtilis spore peptidoglycan during sporulation.</a> J Bacteriol. 182, 4491-4499 (2000).</li><li>Lambert, E. A., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacillus+anthracis+SleL+(YaaH)+protein+is+an+N-acetylglucosaminidase+involved+in+spore+cortex+depolymerization.">The Bacillus anthracis SleL (YaaH) protein is an N-acetylglucosaminidase involved in spore cortex depolymerization.</a> J Bacteriol. 190, 7601-7607 (2008).</li><li>Wang, S., Shen, A., Setlow, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Dynamic+Germination+of+Individual+Clostridium+difficile+Spores+Using+Raman+Spectroscopy+and+Differential+Interference+Contrast+Microscopy.">Characterization of the Dynamic Germination of Individual Clostridium difficile Spores Using Raman Spectroscopy and Differential Interference Contrast Microscopy.</a> J Bacteriol. 197, 2361-2373 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

على التحفيز، الجراثيم التي تمر بعملية الإنبات تفقد خصائص مقاومة من دون الحاجة إلى تركيب الجزيئات. عندما يتم تشغيل إنبات الجراثيم، جوهر بوغ النشرات DPA مقابل الماء 2. نظرا لما يحتويه DPA عالية من الجراثيم نائمة، جوهر بوغ تحت الضغط الاسموزي الشديد وببتيدوغليكان المتخصصة، والقشرة، يساعد على منع الأساسية من تورم من خلال العمل، ويفترض، كحاجز للتوسع 2. الطريقة المذكورة أعلاه يستخدم كاشف إرليخ (حل الأصفر) للكشف عن وجود السكريات المختزلة تحولا للقياس إلى لون بنفسجي. خلال التحلل القشرة، تتحرر NAG وحركة عدم الانحياز السكريات (اعتمادا على مدى الانزيمات hydrolyzing، والسكريات يمكن أن تتحرر كما السكرية الثنائية أو السكريات). التحلل من الروابط غليكوزيدية بواسطة حمض الهيدروكلوريك (الخطوة 2.1) يولد السكريات الأحادية مع خدمة غايات الحد من 7. بعد neutralizجي الحامض مع مبلغ مساو من هيدروكسيد الصوديوم (الخطوة 2.5)، وacylated كحول المحيطة NAG والسكريات الأحادية حركة عدم الانحياز التي كتبها أنهيدريد الخليك (الخطوة 2.6) 13. بعد ذلك، يتم تحويل أنهيدريد الخليك غير المتفاعل إلى حامض الخليك عن طريق تسخين العينة (الخطوة 2.8). كما افترض مورغان والسون 20، ألدهيد محطة تحويل تلقائيا إلى شكل إنول. تحت الظروف القلوية (الخطوة 2.10)، وهذا يمكن شكل إنول تتفاعل مع الاسيتيل المجاور لتوليد مشتق oxazole الذي يتفاعل مع كاشف إرليخ (الخطوة 4.3) لإنشاء اللون الأرجواني 15،20. هذه الطريقة المذكورة أعلاه غلة، نتائج متسقة موثوقة للكشف عن أجزاء القشرة من الإنبات جراثيم، سواء B. الرقيقة وC. صعب 9،16،17. يتطلب فحص اهتمام خاص لضمان رد فعل يتم تنفيذ مرات، ودرجات الحرارة والإجراءات بدقة. دون الاهتمام المناسببالتفاصيل، فمن السهل لظروف التفاعل فشل أو عدم إعادة إنتاج بين التجارب 13. ومع ذلك، فإن إدراج NAG الوسائل القياسية في تطبيق الفحص بين بيئات المختبرات. نجع معيار السيطرة الإيجابية التي تضمنها كل الضوابط التجربة لأي التباين بين التجريبي (على سبيل المثال، هناك اختلافات طفيفة في أوقات رد الفعل أو فعالية كاشف اللون). ردود الفعل باستخدام الظروف عازلة فقط، وردود الفعل مع جراثيم قادرة على hydrolyzing القشرة على حد سواء لم تسفر عن أي تغيير في اللون. المشكلة الأكثر شيوعا مع هذا الأسلوب هو التباين بين التجريبي أو انعدام تام للإشارة. للسيطرة على التغير، يجب أن تكون الاستعدادات بوغ خالية من أي حطام خلية الخضري. وسيتضمن هذا الحطام الخلية شظايا ببتيدوغليكان (NAG وحركة عدم الانحياز)، وسوف يؤدي في إشارة خلفية عالية للجراثيم الإنبات. لضمان إعداد بوغ النقي (&gt; 99.9٪ الجراثيم)، تشير إلى literatuإعادة لطرق لإعداد تعليق بوغ نقية في الكائن الحي لدراستها 7،9،21-23. إذا كان الفحص لا يحقق أي إشارة يمكن كشفها، لاحظنا أن الخطوة lyophilizing يمكن إدخال التغير. ويرجع ذلك إلى القوة التي يتم تحريرها من فراغ، لاحظنا أن مسحوق العينة المجففة يمكن تخرج من أنبوب العينة. للحد من / منع هذا من الحدوث، واستخدام إبرة حقنة صغيرة لكزة ثقوب في قمم أنابيب العينات. فإن منطقة صغيرة من الثقوب قدم يقلل من احتمالات العينة مجفف بالتجميد (الآن في شكل مسحوق) من يجري بالانزعاج. وأخيرا، كما لوحظ في أساليب أعلاه، فإن العديد من الخطوات حضانة وقتا طويلا جدا حساسة. التأكد من أن جميع الخطوات توقيت تتم مراقبتها بعناية. أحد الاعتبارات الهامة لهذا الاختبار هو أن شظايا القشرة يجب الإفراج عن بوغ الإنبات من أجل الكشف عنها. إذا تحلل القشرة إلى شظايا كبيرة، قد تكون هذه الشظايا كبير جدا ليكون releASED من خلال معطف بوغ. وعلى الرغم من اعتبار مهم عند استكشاف التجربة التي لا تسفر عن إشارة، فإننا نوصي للتأكد من أن الظروف المستخدمة لتنبت معظم الجراثيم في حل وغيرها من الخيارات استكشاف الأخطاء وإصلاحها المذكورة هنا قبل النظر في حجم القشرة جزء باعتباره مشكلة محتملة في الفحص. ليس كل مخازن إنبات / الشروط هي مناسبة لهذا الاختبار. لأن هذا الفحص بالكشف عن وجود السكريات المختزلة تتحرر أثناء عملية الإنبات 13، أي عازلة إنبات التي تحتوي على السكريات المختزلة أو أي germinant التي هي، في حد ذاته، والسكر المختزل (على سبيل المثال، الجلوكوز) سيؤدي في إشارة قوية في هذا الاختبار. إذا كان هذا هو الحال، وارتفاع ضغط اللوني السائل (HPLC) يمكن استخدامها للكشف عن وجود شظايا القشرة 24-26. ومع ذلك، لأنه لم يتم تجهيز جميع المختبرات مع هذه الأجهزة، والطريقة الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم من قبل معظممختبرات، ويقدم نتائج بسيطة وقابلة للقياس بسهولة. وإلى حد كبير درس الإنبات بواسطة الجراثيم البكتيرية في العصوية وعدد قليل من الأنواع المطثية 2،8. يتم حفظها عملية عموما، ومع ذلك توجد اختلافات. الأهم من ذلك، ليس كل الكائنات الحية تنبت باستخدام آليات إنبات الجراثيم كما لوحظ في نموذج بوغ المتألق 9،27. لأن إنبات أصبحت تدرس في الكائنات أكثر تنوعا، ويمكن تطبيق الفحص المذكورة أعلاه لهذه الكائنات للكشف عن أجزاء القشرة خلال إنبات الجراثيم. من خلال تطبيق هذا الأسلوب لهذه الكائنات درس حديثا، يمكن للباحثين تحديد دور البروتينات المختلفة إنبات تلعب في التحلل القشرة.

الأبواغ هي عملية الأيض أشكال نائمة من البكتيريا التي تسمح للبكتيريا ان تستمر في البيئات غير المواتية. في كثير من البكتيريا المكونة للبوغ، هو فعل تشكيل بوغ بالحرمان من المغذيات ولكن يمكن التحكم في هذه العملية من خلال التغييرات في درجة الحموضة، والتعرض للأكسجين أو ضغوط أخرى 1. بينما في شكل بوغ نائمة عملية الأيض، والبكتيريا تقاوم الأشعة فوق البنفسجية، جفاف، ارتفاع درجات الحرارة، وتجميد 2. معظم المعارف على عملية تكاثر يأتي من دراسات في الكائن الحي نموذج، العصوية الرقيقة. تبدأ عملية تبوغ مع تكرار الحمض النووي وتشكيل 3،4 خيوط المحوري. والحاجز غير المتماثلة ثم يقسم الخلية إلى قسمين الحجم غير متكافئ. مقصورة أكبر، الخلية الأم، يجتاح حجرة صغيرة، وforespore. كل من الخلية الأم وforespore تنسيق التعبير الجيني لانضاج الجراثيم والخلية الأم انحلال في نهاية المطاف، والإفراج عن دورمانر بوغ في البيئة المحيطة 1. يتم حفظها هيكل الجراثيم والتكوين عبر العديد من الأنواع البكتيرية. جوهر بوغ يحتوي على نسبة الماء أقل من الخلية النباتية وغنية بحمض dipicolinic (د ب أ) 1،2. خلال تشكيل بوغ، يتم ضخ DPA في صلب بوغ في مقابل الماء. المحيطة الأساسية هو غشاء بوغ الداخلي حيث، في معظم البكتيريا بوغ تشكيل، والمستقبلات التي تعترف الجزيئات الصغيرة التي تحفز إنبات (germinants) تقع 2. يقع خارج الغشاء الداخلي للبوغ هو طبقة من ببتيدوغليكان جدار الخلية. وهناك طبقة ببتيدوغليكان المتخصصة (القشرة) تحيط ببتيدوغليكان جدار الخلية وتتكون من العديد من نفس المكونات كما ببتيدوغليكان جدار الخلية [بالتناوب N-اسيتيل (ناغ) وحمض N-acetylmuramic (NAM)]. ومع ذلك، فقد تم تحويل ما يقرب من 50٪ من بقايا حركة عدم الانحياز في القشرة لالموراميك-δ لاكتام 5،6 </sتصل&gt;. خلال إنبات الجراثيم، يتم التعرف على هذه المخلفات الموراميك-δ لاكتام من قبل بوغ قشرة الانزيمات التحللي (SCLEs)، مما يسمح للقشرة إلى أن يتحلل (وهي عملية ضرورية لإتمام الإنبات) ولكن ليس جدار الخلية. المحيطة القشرة هو الغشاء الخارجي وعدة طبقات من البروتينات معطف 2. السيطرة على عملية الإنبات أمرا شديد الأهمية للبكتيريا تشكيل بوغ. يبدأ الإنبات عندما تتفاعل مستقبلات germinant مع germinants كل فيما يخصه 2. في كثير من البكتيريا المكونة للبوغ، هذه germinants هي الأحماض الأمينية والسكريات، النيوكليوتيدات، أيونات أو خليط منها 2. C. يبدأ صعب بوغ إنبات عن طريق مزيج من بعض أنواع الحوامض الصفراء، [على سبيل المثال، حمض taurocholic (TA)] والأحماض الأمينية (على سبيل المثال، الجلايسين) 7-10. على الرغم من وجود اختلافات بين C. العسيرة مسار الإنبات ومسارات درس في البعض تشكيل بوغالبكتيريا، مثل B. الرقيقة، مشتركة بين جميع هو شرط مطلق للحط من القشرة بوغ للسماح للخلية النباتية لتنمو من بذرة نبتت 2،8. تدهور القشرة يمكن أن يتحقق من قبل SCLEs CwlJ / SleB (كما هو موجود في B. الرقيقة) أو SleC (كما هو موجود في كثير من المطثيات). قشرة المائي يقلل من القيود على جدار الخلية والجراثيم. وهذا يسمح لمعالجة الجفاف الأساسية كاملة، خطوة ضرورية في تنشيط العديد من البروتينات اللازمة لعمليات أيض الخلايا 2. عندما تنبت الجراثيم، والتغيرات بوغ نائمة من دولة مرحلة مشرقة لدولة مرحلة مظلمة وهذه العملية يمكن قياس التغير في الكثافة الضوئية (OD) في 600 نانومتر 11. ويشير التقرير السابق أن جزءا كبيرا من هذا التغيير في التطوير التنظيمي ويرجع ذلك إلى الإفراج عن DPA من بوغ 12. خلال دراستنا الأخيرة، سعينا لمقارنة توقيت C. صعب بوغ الإنبات ومراقبةالافراج عن الشؤون السياسية والقشرة شظايا 9. لهذه الدراسة انه من الضروري مراقبة الإفراج عن شظايا القشرة لأنها بدأت سيصدر من قبل الإنبات جراثيم. واستند الفحص اللونية المستخدمة هنا على طريقة للكشف عن السكريات مع الحد من الغايات وضعت Ghuysen وآخرون. 13. لأن الآخرين قد وصف بروتوكولات للكشف عن السكريات المختزلة 14 أو عدلت هذه البروتوكولات 15، والأدب حول هذا الموضوع يمكن أن يكون مربكا. هنا، ونحن بالتفصيل طريقة خطوة بخطوة للكشف اللونية من السكريات المختزلة تتحرر من الإنبات C. جراثيم صعب. على الرغم من يستخدم هذه الدراسة C. جراثيم صعب، والسكريات المختزلة صدر خلال إنبات الجراثيم من البكتيريا الأخرى لتشكيل بوغ هي قادرة على أن الكشف عن هذا البروتوكول 9،16،17.

<table><tbody><tr><td>2.0 ml screw cap tube</td><td>USA scientific</td><td>1420-3700</td><td></td></tr><tr><td>p1000 Eppendorf pipet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p200 Eppendorf pipet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p20 Eppendorf pipet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 - 1,250 &amp;#956;l pipet tips</td><td>VWR</td><td>89079-486</td><td></td></tr><tr><td>1 - 200 &amp;#956;ll pipet tips</td><td>VWR</td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl-D-glucosamine</td><td>Sigma</td><td>A3286-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid - 10 N</td><td>BDH-Aristar</td><td>BDH3032-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Anhydride</td><td>Alfa Aesar</td><td>L04295</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>BDH</td><td>BDH0280-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Tetraborate tetrahydrate</td><td>Alfa Aesar</td><td>39435</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>BDH</td><td>BDH8019-500G</td><td></td></tr><tr><td>4-(Dimethylamino)benzaldehyde</td><td>Sigma</td><td>156477-100G</td><td></td></tr><tr><td>Saturated Phenol</td><td>Fisher</td><td>BP1750-400</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M3</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid, Glacial</td><td>BDH</td><td>BDH3098-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>Heated, Circulating Water Bath</td><td>VWR Scientific</td><td>Model 1136</td><td></td></tr><tr><td>Microtest 96</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td>96 well clear tissue culture plates</td></tr><tr><td>Culture tubes</td><td>VWR</td><td>89000-506</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat Blocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex Machine</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detecting cortex fragments during bacterial spore germination

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

ويبين الجدول 1 نتائج نموذجية باستخدام معايير ناج. وتستخدم البيانات لإنشاء منحنى القياسية. ويبين الجدول 2 النتائج نموذجية من فحص الإنبات في المخزن إنبات تستكمل مع 100 الجلايسين ملي و 10 ملي TA (الظروف المعززة للإنبات) أو 100 الجلايسين ملم فقط (شروط عدم الإنبات). في غياب TA، C. جراثيم صعب لا تنبت، وهناك تغيير طفيف في وجود شظايا القشرة في الحل. ومع ذلك، في حضور كل من TA والجلايسين، C. جراثيم صعب تنبت وتطلق شظايا القشرة إلى الحل. لوحظ هذا الأمر زيادة في OD 585 على مر الزمن من العينات كان رد فعل. تم احتساب المبلغ الإجمالي للأجزاء القشرة (نانومول) صدر خلال هذا الاختبار باستخدام المنحنى القياسي مشابهة للشكل 1B. في هذا الاختبار، وتحلل معظم القشرة (أو الإفراج عنهم) من خلال 15 دقيقة مرحلة ما بعدالتعرض germinant، مما يشير إلى أن معظم الجراثيم قد نبتت في هذا الإطار الزمني (الشكل 2، بما يتفق مع القراءات السابقة 7). بعد وضع العينات في كاشف اللون، معظم العينات قد لا تظهر اللون الأرجواني للعين المجردة. يوضح الشكل 1 عينة تمثيلية الناتجة عن N-اسيتيل. العديد من العينات لا تظهر اللون الأرجواني مرئية. ومع ذلك، فإن 250 نانومول، 500 نانومول و 5،000 نانومول عينات تظهر مختلفة بصريا من السيطرة السلبية (0 نانومول). عند قياسها في OD 585 نانومتر، ولدت إشارة يناسب الانحدار الخطي (R 2 = 0.999). <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54146/54146fig1.jpg" /> الشكل 1: كشف N-اسيتيل عينات (A) N-اسيتيل (0 نانومول، 12.5 نانومول،25 نانومول، 50 نانومول، 100 نانومول، 250 نانومول، 500 نانومول، 5000 نانومول) ومجفف بالتجميد وكان رد فعل وفقا للإجراءات وصفها. وأضاف (ب) عينات لوحة 96 جيدا وكمية المواد ردت الكشف على 585 نانومتر. تم استخدام إشارة لتوليد منحنى القياسية. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54146/54146fig2.jpg" /> الشكل 2: التمثيل البياني للنتائج الإنبات قد حيكت القشرة نانومول المحسوبة في الجدول 2 مقابل الوقت. (●) 100 ملي الجلايسين + 10 ملي TA. (■) 100 ملي الجلايسين. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54146/54146fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> NAG تركيز (نانومول) </td><td> OD 585 </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 0.047 </td></tr><tr><td> 12.5</td><td> 0.054 </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 0.066 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 0.084 </td></tr><tr><td> 100 </td><td> 0.128 </td></tr><tr><td> 250 </td><td> 0.285 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 0.556 </td></tr><tr><td> 5000 </td><td> 4.0 </td></tr><tr><td> = فارغة </td><td> 0.046 </td></tr></tbody></table> الجدول 1: ناج قياسي. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> المطثية العسيرة سبور الإنبات </td></tr><tr><td></td><td colspan="4"> الحل إنبات (10 ملي تريس (7.5 درجة الحموضة)، 150 مم كلوريد الصوديوم) </td></tr><tr><td></td><td colspan="2"> 100 ملي جليكاين + 10 ملي TA </td><td colspan="2"> 100 ملي جليكاين </td></tr><tr><td> الوقت (دقيقة) </td><td> OD 585 </td><td>حساب (نانومول) </td><td> OD 585 </td><td> حساب (نانومول) </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 0.046 </td><td> 0.00 </td><td> 0.047 </td><td> 0.00 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0.048 </td><td> 2.54 </td><td> 0.048 </td><td> 1.27 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 0.05 </td><td> 5.07 </td><td> 0.049 </td><td> 2.54 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 0.055 </td><td> 11.41 </td><td> 0.05 </td><td> 3.80 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 0.059 </td><td> 16.49 </td><td> 0.05 </td><td> 3.80 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 0.06 </td><td> 17.76 </td><td> 0.051 </td><td> 5.07 </td></tr><tr><td> 12 </td><td> 0.061 </td><td> 19.02 </td><td> 0.05 </td><td> 3.80 </td></tr><tr><td> 14 </td><td> 0.063 </td><td> 21.56 </td><td> 0.051 </td><td> 5.07 </td></tr></tbody></table> الجدول 2: نموذج سبور Germinatiعلى النتائج.

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination at JoVE.com

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

كشف اللحاء شظايا خلال البكتيرية سبور الإنبات

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

detecting-cortex-fragments-during-bacterial-spore-germination

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.3K Views.  Texas A&M University. Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

Video: Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.

A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.

العزلة المادية من الأبواغ من العينات البيئية التي تستهدف تحلل من الخلايا النباتية

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

Environment

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5
DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8
Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.
More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.
Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).
Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

We have recently reported a novel approach for generating fluorogenic DNAzyme probes that can be applied to set up a simple, "mix-and-read" fluorescent assay for bacterial detection. These special DNA probes catalyze the cleavage of a chromophore-modified DNA-RNA chimeric substrate in the presence of crude extracellular mixture (CEM) produced by a specific bacterium, thereby translating bacterial detection into fluorescence signal generation. In this report we will describe key experimental procedures where a specific DNAzyme probe denoted "RFD-EC1" is employed for the detection of the model bacterium, Escherichia coli (E. coli).

الكشف عن البكتيريا عن طريق DNAzymes Fluorogenic

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing need for the development of methodologies that improve the detection of antigens immobilized on the surface of spores together with their quantification. Flow cytometry-based analyses have been previously proposed as fast, reliable, and specific approaches for detecting labeled cells of B. subtilis. Herein, we propose the use of flow cytometry to evaluate the display efficiency of a fluorescent antibody (FA) on the surface of the spore and quantify the number of spores using counting beads. 
For this, we used ethidium bromide as a DNA marker and an allophycocyanin (APC)-labeled antibody, which was coupled to the spores, as a surface marker. The quantification of spores was performed using counting beads since this technique demonstrates high accuracy in the detection of cells. The labeled spores were analyzed using a flow cytometer, which confirmed the coupling. As a result, it was demonstrated that DNA labeling improved the accuracy of quantification by flow cytometry, for the detection of germinated spores. It was observed that ethidium bromide was not able to label dormant spores; however, this technique provides a more precise determination of the number of spores with fluorescent protein coupled to their surface, thus helping in the development of studies that focus on the use of spores as a biotechnological platform in different applications.

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

This protocol focuses on the use of flow cytometry and counting beads to quantify bacterial spores labeled with ethidium bromide. The method is also efficient for analyzing the covalent coupling of proteins on the surface of intact spores.

تحسين تعداد بوغ العصوية الرقيقة وتحليل التسمية في قياس التدفق الخلوي

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing ...

Biochemistry

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence microscopy. Super-resolution three-dimensional Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) is a promising tool to overcome this hurdle and reveal the molecular details of the process of germination of Bacillus subtilis (B. subtilis) spores. Here, we describe the use of a modified SIMcheck (ImageJ)-assistant 3D imaging process and fluorescent reporter proteins for SIM microscopy of B. subtilis spores&#8217; germinosomes, cluster(s) of germination proteins. We also present a (standard)3D-SIM imaging procedure for FM4-64 staining of B. subtilis spore membranes. By using these procedures, we obtained unsurpassed resolution for germinosome localization and show that &#62;80% of B. subtilis KGB80 dormant spores obtained after sporulation on defined minimal MOPS medium have one or two GerD-GFP and GerKB-mCherry foci. Bright foci were also observed in FM4-64 stained spores&#8217; 3D-SIM images suggesting that inner membrane lipid domains of different fluidity likely exist. Further studies that use double labeling procedures with membrane dyes and germinosome reporter proteins to assess co-localization and thus get an optimal overview of the organization of Bacillus germination proteins in the inner spore membrane are possible.

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Germinant receptor proteins cluster in &#8216;germinosomes&#8217; in the inner membrane of Bacillus subtilis spores. We describe a protocol using super resolution microscopy and fluorescent reporter proteins to visualize germinosomes. The protocol also identifies spore inner membrane domains that are preferentially stained with the membrane dye FM4-64.

التصور جيرمينوسوميس و "الغشاء الداخلي" في الجراثيم العصوية نجحت

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Bioengineering

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of antibiotics and other secondary metabolites. Streptomyces coelicolor is a well-characterized, non-pathogenic species that is amenable to a variety of analyses in the lab. The phenotyping methods described here use S. coelicolor as a model streptomycete; however, the methods are applicable to all members of this large genus as well as some closely related actinomycetes. Phenotyping is necessary to characterize new species of Streptomyces identified in the environment, and it is also a vital first step in characterizing newly isolated mutant strains of Streptomyces. Proficiency in phenotyping is important for the many new researchers who are entering the field of Streptomyces research, which includes the study of bacterial development, cell division, chromosome segregation, and second messenger signaling. The recent crowdsourcing of antibiotic discovery through the isolation of new soil microbes has resulted in an increased need for training in phenotyping for instructors new to the field of Streptomyces research and their college or high school students. This manuscript describes methods for bacterial strain propagation, storage, and characterization through visual and microscopic examination. After reading this article, new researchers (microbiology education laboratories and citizen scientists) should be able to manipulate Streptomyces strains and begin visual characterization experiments.

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Here we present protocols for novice researchers to initiate phenotyping for the pharmacologically important bacterial genus Streptomyces.

التقييم المرئية والمجهرية من طفرات إنمائية متسلسلة

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Fusarium graminearum has become a model system for studies in development and pathogenicity of filamentous fungi. F. graminearum most easily produces fruiting bodies, called perithecia, on carrot agar. Perithecia contain numerous tissue types, produced at specific stages of perithecium development. These include (in order of appearance) formation of the perithecium initials (which give rise to the ascogenous hyphae), the outer wall, paraphyses (sterile mycelia which occupy the center of the perithecium until the asci develop), the asci, and the ascospores within the asci14. The development of each of these tissues is separated by approximately 24 hours and has been the basis of transcriptomic studies during sexual development12,8. Refer to Hallen et al. (2007) for a more thorough description of development, including photographs of each stage. Here, we present the methods for generating and harvesting synchronously developing lawns of perithecia for temporal studies of gene regulation, development, and physiological processes. Although these methods are written specifically to be used with F. graminearum, the techniques can be used for a variety of other fungi, provided that fruiting can be induced in culture and there is some synchrony to development. We have recently adapted this protocol to study the sexual development of F. verticillioides. Although individual perithecia must be hand picked in this species, because a lawn of developing perithecia could not be induced, the process worked well for studying development (Sikhakolli and Trail, unpublished).
The most important function of fungal fruiting bodies is the dispersal of spores. In many of the species of Ascomycota (ascus producing fungi), spores are shot from the ascus, due to the generation of turgor pressure within the ascus, driving ejection of spores (and epiplasmic fluid) through the pore in the ascus tip2,7. Our studies of forcible ascospore discharge have resulted in development of a "spore discharge assay", which we use to screen for mutations in the process. Here we present the details of this assay.
F. graminearum is homothallic, and thus can form fruiting bodies in the absence of a compatible partner. The advantage of homothallism is that crossing is not necessary to generate offspring homozygous for a particular trait, a facet that has facilitated the study of sexual development in this species14,7. However, heterothallic strains have been generated that can be used for crossing5,9. It is also possible to cross homothallic strains to obtain mutants for several genes in one strain1. This is done by coinoculating one Petri dish with 2 strains. Along the meeting point, the majority of perithecia will be recombinant (provided a mutation in one of the parent strains does not inhibit outcrossing). As perithecia age, they exude ascospores en masse instead of forcibly discharging them. The resulting spore exudate (called a cirrhus) sits at the tip of the perithecium and can easily be removed for recovery of individual spores. Here we present a protocol to facilitate the identification of recombinant perithecia and the recovery of recombinant progeny.

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Sexual crosses and isolation of recombinant progeny are important research tools for the filamentous fungus, Fusarium graminearum, The techniques necessary successfully carry out these processes are presented.

الجنسي للتنمية والتفريغ في بوغ زقي فيوزاريوم graminearum</em

Fusarium graminearum has become a model system for studies in development and pathogenicity of filamentous fungi. F. graminearum most easily produces ...

Biology

Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure makes the spore extremely stable and resistant and has suggested the use of the spore as a platform to display heterologous molecules. So far, a variety of antigens and enzymes have been displayed on spores of Bacillus subtilis and of a few other species, initially by a recombinant approach and, then, by a simple and efficient nonrecombinant method. The nonrecombinant display system is based on the direct adsorption of heterologous molecules on the spore surface, avoiding the construction of recombinant strains and the release of genetically modified bacteria in the environment. Adsorbed molecules are stabilized and protected by the interaction with spores, which limits the rapid degradation of antigens and the loss of enzyme activity at unfavorable conditions. Once utilized, spore-adsorbed enzymes can be collected easily with a minimal reduction of activity and reused for additional reaction rounds. In this paper is shown how to adsorb model molecules to purified spores of B. subtilis, how to evaluate the efficiency of adsorption, and how to collect used spores to recycle them for new reactions.

This protocol focuses on the use of bacterial spores as a &#34;live&#34; nanobiotechnological tool to adsorb heterologous molecules with various biological activities. The methods to measure the efficiency of adsorption are also shown.

الامتزاز بوغ كنظام عرض نونريكومبينانت للإنزيمات والمضادات

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by secreting metabolites. These metabolites have the potential to modulate the physiology and differentiation of their microbial neighbors and are likely important factors in the establishment and maintenance of complex microbial communities. We have developed a fluorescence-based coculture screen to identify such chemically mediated microbial interactions. The screen involves combining a fluorescent transcriptional reporter strain with environmental microbes on solid media and allowing the colonies to grow in coculture. The fluorescent transcriptional reporter is designed so that the chosen bacterial strain fluoresces when it is expressing a particular phenotype of interest (i.e. biofilm formation, sporulation, virulence factor production, etc.) Screening is performed under growth conditions where this phenotype is not expressed (and therefore the reporter strain is typically nonfluorescent). When an environmental microbe secretes a metabolite that activates this phenotype, it diffuses through the agar and activates the fluorescent reporter construct. This allows the inducing-metabolite-producing microbe to be detected: they are the nonfluorescent colonies most proximal to the fluorescent colonies. Thus, this screen allows the identification of environmental microbes that produce diffusible metabolites that activate a particular physiological response in a reporter strain. This publication discusses how to: a) select appropriate coculture screening conditions, b) prepare the reporter and environmental microbes for screening, c) perform the coculture screen, d) isolate putative inducing organisms, and e) confirm their activity in a secondary screen. We developed this method to screen for soil organisms that activate biofilm matrix-production in Bacillus subtilis; however, we also discuss considerations for applying this approach to other genetically tractable bacteria.

Bacteria produce secreted compounds that have the potential to affect the physiology of their microbial neighbors. Here we describe a coculture screen that allows detection of such chemically mediated interspecies interactions by mixing soil microbes with fluorescent transcriptional reporter strains of Bacillus subtilis on solid media.

باستخدام Coculture لكشف كيميائيا وساطة بين الأنواع التفاعلات

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

التحقيق "تضر الآثار من منخفضة الضغط البلازما التعقيم" على البقاء لجراثيم Bacillus نجحت "باستخدام خلية يعيش مجهرية"

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are thick-walled dispersal agents. Teliospores can remain dormant for decades. The dormancy is characterized by low metabolic rates, paused macromolecular biosynthesis and greatly reduced levels of respiration. Upon receiving required environmental signals, teliospores germinate to produce haploid cells, which can initiate new rounds of infection. Teliospore germination is characterized by the resumption of macromolecular biosynthesis, increased respiration and dramatic morphological changes. In order to precisely measure changes in cellular respiration during the early stages of germination, we have developed a simple protocol employing a Clark-type respirometer. The later stages of germination are distinguished by specific morphological changes, but germination is asynchronous. We developed a microdissection technique that enables us to collect teliospores at distinct germination stages.

Smut fungi cause many devastating agricultural diseases. They are dispersed as dormant teliospores that germinate in response to environmental cues. We outline two methods to investigate molecular changes during germination: measuring respiration increase to detect metabolic activation and assessing changing molecular events by isolating teliospores at distinct morphological stages.

التحقيق الإنبات تيليوسبوري باستخدام تحليل ميكروريسبيريشن وميكروديسيكشن

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are ...