この研究が、ノバルティス財団医療 - と (ピム) 生物学研究、ゴットフリートとジュリア ・ バンガーター ・ Rhyner 財団 (MW、ピムと) と (ピム) にフリブール大学の研究プールによって財政上支えられる部分で。追加の助成金 (KAB SM し) 外国の学者のスイス政府優秀奨学金があります。テクニカル サポート、イザベルの Fellay と Solange Kharoubi ヘスに感謝します。

人間の赤血球は、Swissethics (swissethics.ch) のガイドラインに従って、健康なドナーの血液から得られました。
注:マラリア寄生虫文化 (3 7) や EV 生産以前に記載された Mbagwu、ら。11 マラリアは人間の病原体、取り扱いの地域の規制にご相談ください。文化べき滅菌全体の時間。
1 EVs の蛍光標識
注: 次の手順は、EV 膜の脂質領域で大きな脂肪族尾安定緑色蛍光色素 (PKH67) を組み込むラベリング技術の利点をかかります。200 μ L の最終 PKH67 の 20 μ M の最終的な集中を含むボリュームを染色で反応を行います。周囲温度 (20-25 ° C) ですべての手順を実行します
<ol><li>微量遠心チューブに 1 mL の PBS で EVs の場所 100 μ。</li>
	<li>ペレットに最大速度 (20,000 x g) 7 分で微量遠心チューブ内の EVs を遠心します。 注: とくにヘモゾインが EVs に存在するので赤暗い茶色ペレットを観察すべき。服従上清は赤みを帯びた、EVs が分離します。</li>
	<li>遠心分離の後に、任意の EVs を削除を避けるために、慎重に、上清を吸引しています。 注: は、再現性と染色の効率を高めるために希釈 C で EVs を再前にバッファーの残りの量を最小化します。</li>
	<li>希釈 C の 100 μ L で EV ペレットを再懸濁します (EV 停止 X 2) と完全な分散を保証するためにゆっくりピペットで移しなさい。</li>
	<li>新しい遠心チューブを準備し、PKH67 エタノール色素溶液の 4 μ L を希釈 C. 渦もミックスの 100 μ L に追加します。汚れる前にすぐにこの 2 x 色素溶液 (40 μ M) を準備します。 注: 異種染色避けるために、EV のペレットに直接に PKH67 エタノール色素溶液を追加しないでください。</li>
	<li>急速に、染料の解決 (手順 1.5) × 2 の 100 μ L で EV 懸濁液 (手順 1.4) X 2 の 100 μ L を結合します。その後、上下に 10 回ピペッティングによるサンプルをミックスします。</li>
	<li>5 分孵化の間に 3-4 回ボルテックスによって光とミックスから保護から 5 分ステップ 1.6 EV/色素サスペンションを孵化させなさい。 注: EV/染料懸濁液をインキュベート時間が長くなるメリットもありません、染色が速いので。</li>
	<li>血清の等しいボリューム (200 μ L) を追加することによって染色反応を停止し、余分な染料のバインドを許可する 1 分間インキュベートします。 注: 染色を停止する前に、20 分 20,000 × g で遠心分離による EVs から血清を使い果たします。</li>
	<li>PBS 洗浄 3 回、20,000 x g で 5 分間でスピンダウンの最終濃度 1 μ g/μ L に到達する PBS 100 μ L に EVs を再懸濁します。</li>
</ol>2. 共焦点顕微鏡を用いた電気自動車の吸収を可視化します。
注: 次のプロトコルでは、EV ガラス coverslips 上に成長した内皮細胞によって内面の追跡について説明します。血管内皮細胞は、12に記載されている半不死化ひと骨髄内皮細胞です。
<ol><li>無菌環境での作業、0.01% ポリ-L-リジン (RT) 室温で 10 分間を超えると coverslips をコートします。</li>
	<li>ポリ L リジン ソリューションを吸引し、完全に乾燥する coverslips を許可します。</li>
	<li>トリパン ブルー色素排除と診断を使用して実行可能な内皮細胞数を実行します。</li>
	<li>1 x 105 1 mL の完全培の内皮細胞成長ポリ L リジン コーティング coverslips にサプリメントのミックスを含むし、単分子層に成長する細胞の内皮細胞を転送します。 メモ: メディアに含まれる成長因子細胞単層を形成し、タイトな接合を形成することができます。</li>
	<li>セルは、単層を形成、一度慎重に培地を吸引し、セルを洗浄して新鮮培地 1 mL を追加します。洗濯物をもう一度繰り返します。PKH67 ラベル EVs の 50 μ g を追加し、4 時間インキュベートします。 注: 吸収の時間の最適なポイントを見つけるには、時間コースを実行することができます。</li>
	<li>4 時間後、培地を吸引し、洗浄 3 回過剰および非連結の EVs を削除する PBS のセル。PBS で 3% パラホルムアルデヒド溶液中 15 分間とセルを修正します。 注: メタノール固定プロセス中にアクチンを破壊できます。したがって、定着剤または他の溶剤系の定着剤を含む任意のメタノールを回避することをお勧めします。定着剤としてメタノール無料ホルムアルデヒドを使用することをお勧めします。</li>
	<li>PBS で 3 回洗浄を行う。慎重に 250 μ l 添加 0.1% のセルを permeabilize PBS でトリトン X-100。室温で 5 分間インキュベートします。</li>
	<li>3 回を PBS で洗浄します。非特異的結合をブロックする RT で 30 分のブロック バッファー (PBS で 5 %bsa) の 400 μ L を追加します。</li>
	<li>PBS で 1 回洗浄を行う。各カバー スリップあたり 200 μ L PBS/1% BSA にファロイジン原液の 5 μ L に希釈して染色液を準備します。ピペット 200 μ L、coverslip の染色液のルートで 20 分間インキュベートし、</li>
	<li>3 回を PBS で洗浄します。30 の DNA を counterstain 最終濃度 200 μ L の PBS で 2 μ G/ml ヘキスト 33342 で s。</li>
	<li>400 μ L の PBS を追加することによって、coverslip x 2 を洗います。慎重に、coverslip 鉗子でつかんで滴スライド ガラスにメディアをマウント antifade の上に反転します。優しくティッシュで余分なメディアを削除して各側は爪のポーランド語のシールします。</li>
	<li>4 ° C で光から保護されたスライドを保存します。</li>
	<li>レーザー励起 543、488、405 nm と 63 X 450-470 nm (青色)、505 530 nm (緑)、620 で蛍光排出量 1.3 NA 石油目的で共焦点顕微鏡を使って細胞を可視化する nm。 注: 典型的な F アクチン染色結果は図 1のとおりです。</li>
</ol>3. 血管内皮細胞の透過性
注: 内皮細胞の透過性は、単層の内皮細胞にローダミン B イソチオ シアン酸デキストラン (平均 MW 70,000) の転送を測定することによって評価されます。デキストランは、血管透過性を研究するための優れたツールを提供します。
<ol><li>0.4% トリパン ブルー色素排除と診断を使用して実行可能な血管内皮細胞を数えます。</li>
	<li>24 ウェル培養挿入 (0.4 μ m 孔サイズ) や差別化された単分子膜を形成するため、少なくとも 5 日間妨げられていないままに合流点 105セル × 0.6 の密度で内皮細胞をプレートします。媒体ごとの 2 日目を更新します。</li>
	<li>細胞が単層に達すれば、EVs を読み込む (1 mL に 50 μ g) 上部室に。ローダミン デキストランを最終濃度 20 mg/mL でトップの井戸に追加します。5% CO2と 37 ° C でセルを孵化させなさい。</li>
	<li>40 μ L 中因数からの蛍光発光を測定することによっても下に蛍光のデキストランの転送を監視します。544 nm 励起と測定について 590 nm 発光マルチラベル プレート リーダーを設定します。 注: 拡散デキストランの量が原液と確立の較正曲線を用いて定量化することができます。さらに、運動の実験は、時間コース (図 2) の間に外側室内の中の小さなサンプルを削除することによって実行できます。どんな治療がなくて、デキストランに細胞膜を通して拡散します。</li>
</ol>4. ピューロマイシン感度を決定します。
注: レンチ ウイルスと細胞を伝達する前にそれはその特定のセル行の選択した薬の殺す曲線を決定することが重要。すべてのセルを殺すために必要な薬物濃度の最小量を決定する、選択した薬の増分の用量を用いた線量応答実験を実行します。各哺乳類セルライン、実験する前に、別の感受性を持っているので抗生物質の最適濃度を決定して下記のとおり殺すカーブ滴定法を開発してください。
<ol><li>検定を使用してセルをカウントします。サプリメントのミックスを含んでいる完全な内皮細胞成長媒体で 1 × 105細胞/ml の濃度で内皮細胞を再懸濁します。</li>
	<li>内皮細胞成長培地を 100 μ l 添加の最終巻の 96 ウェル プレートにプレート 1 x 10 の4セルです。</li>
	<li>0.1 10 μ G/ml の濃度に抗生物質を添加した培地を 100 μ l 添加 (図 3参照)。</li>
	<li>20 × 対物を使用して顕微鏡下で 2 日ごと細胞生存率を調べる。10-14 日の培養し、細胞増殖によって 2-3 日毎ピューロマイシンを含むメディアを交換します。</li>
	<li>各ウェル、ミックスに 10 μ L/ウェル MTS 試薬を追加し、標準培養条件で 37 ° C で 4 時間インキュベートします。</li>
	<li>シェーカーで簡単にプレートを振るし、490 プレート リーダーを用いた処理と未処理のセルの吸光度を測定 nm (図 3)。</li>
</ol>5. 血管内皮細胞のレンチウイルスベクターの伝達
<ol><li>プレート 1 × 105 1 mL の完全培地における内皮細胞伝達の前日。セルが 50-80% の confluency に達したときは、情報伝達を実行します。</li>
	<li>氷の上のレンチ ウイルスを解凍し、凍結融解サイクルを避けるためにウイルス株の因数を作る。30 の 200 x g で材料をスピン上流出を避けるために開く前に管内の s。</li>
	<li>最終 8 μ G/ml の濃度で細胞に hexadimethrine ブロマイドを追加します。 しかし、いくつかのケースでは、セルのために有毒がある場合があります注: Hexadimethrine 臭化伝達効率ができます。したがって、最適な濃度は、伝達の前に殺害の曲線を実行することによって決定する必要があります。</li>
	<li>ミックスに軽くプレートを旋回します。感染症 (MOI) の適切な多様性でウイルス粒子 (0.5-2 x 106粒子) の間の適切な量を追加し、軽く 30 の板を渦巻きを混在させる s。</li>
	<li>RT で伝達効率を高めるための 300 x g で 45 分間の遠心でミックスを細胞ウイルスの粒子を遠心します。37 ° C で細胞ウイルスの粒子の混合物を一晩インキュベートします。</li>
	<li>削除ウイルス粒子含有培地では慎重に、適切に廃棄します。新鮮な予め温めておいた完全な培養液中に置き換えます。</li>
	<li>2 日目は、ピューロマイシンを選択を開始: メディアを取り出して、ピューロマイシン セクション 4 (図 3) で定める以前の正しい濃度を含む新鮮な培地に交換します。</li>
	<li>ピューロマイシンを選択後細胞を収穫し、製造元の指示に従ってキットを分離する RNA を使用して RNA を分離します。</li>
	<li>選択した cDNA 合成を行う逆のトランスクリプションを用いた Mirna キット (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>引用プロトコル13によると qPCR 反応を設定します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO Malaria Report 2015. , (2015).</li><li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).</li><li>Mantel, P. Y., Marti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+vesicles+in+Plasmodium+and+other+protozoan+parasites.">The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites.</a> Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).</li><li>Couper, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasite-derived+plasma+microparticles+contribute+significantly+to+malaria+infection-induced+inflammation+through+potent+macrophage+stimulation.">Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation.</a> PLoS Pathog. 6 (1), e1000744 (2010).</li><li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis.">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nat Rev Immunol. 5 (9), 722-735 (2005).</li><li>Mantel, P. 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著者が明らかに何もありません。

トキソ プラズマ、トリパノソーマ、リーシュ マニア、トリコモナスを含むいくつかの寄生虫が感染させた宿主細胞によって電気自動車のリリースをトリガーします。、病原体によってリリースされた EVs は宿主の免疫応答を調節したり寄生虫6間の携帯電話の通信を仲介します。まだ、これらの小胞がマラリア病に貢献する方法を示唆する少し証拠があります。ここでは、マラリア原虫の感染時に EVs の機能を調査するいくつかの方法を説明しました。例えば、PKH67 蛍光色素ラベルで受信者細胞体内の EVs の吸収を効率的に監視できます。いくつかのコントロールは、ラベルの特異性を保証するために行います。一度希釈 C と混ぜ、PKH67 色素集合体を形成する傾向があると非特異染色を決定する Ev なしで単独での色素を持つコントロールを含めることが必要ですが重要です。共焦点顕微鏡は、表面にバインドされ、本当に受信者の細胞によって内面化は小胞を区別する選択の方法です。また、それは追跡し、小胞の細胞によってとらの数を監視するための優れたツールを提供します。しかし、それは不明のまま受信者セル14; の EVs の処理方法したがって、実行時間コース 2、4、および 8 h の時間ポイントを使用して吸収の最適条件を決定するために非常に役に立つ可能性があります。細胞レベル下コンパートメント マーカーの追加は、共焦点顕微鏡による細胞内の EVs を追跡する使用できます。EV の吸収は、膜融合やエンドサイトーシス15を介して発生する示されています。融合は、ラベリングの Ev オクタデシル ローダミン B (R18) によって監視できます。EVs の細胞膜との融合は、蛍光の16の増加につながる R18 の希釈で結果します。EVs のエンドサイトーシスによる取り込みはダイナミン10、微小管とアクチンの特異的阻害剤を使用して学ぶことが。
EVs の生理学を勉強するには、PKH 色素を直接内側にラベルを付けるし、共培養血管内皮細胞に感染することが可能です。ここでの問題は、セルは、別のメディアを必要とするガス組成と EV の転送量が少ない可能性があります。さらに、ドナー細胞の in vitroとin vivo蛍光タグと融合した小胞蛋白質を表現できます。ただし、これまでのところそれはテストされていない感染と
感染した赤血球、脳マラリア17が発生する原因と思われる過程で、脳の血管に cytoadherent。したがって、EVs を介した寄生虫素材の転送は血管内皮細胞およびそれ故に血管機能18に影響を与える可能性があります。ここでは、説明の in vitroアッセイは、その透水性19例としては、血管内皮細胞の基本的なプロパティのいくつかを調べる簡単な方法を提供します。TEER や ZO 1 染色などその他のテストは、タイトな接合部の完全性10の詳細についてを提供できます。
さらに、体外モデルは、寄生虫と宿主細胞との細胞のコミュニケーションの背後にある分子メカニズムの研究の強力なツールであること判明します。ほかに取り込み、このセットアップは、分子メカニズムの調査をこのプロセスに関与できます。たとえば、リアルタイム PCR、蛍光の in situハイブリダイゼーションによる受容体細胞へ miR451a の転送を監視しています。また、直接血管機能10のこれらの小さな RNA の役割に対処するため、特定の miRNA を過剰発現細胞株を生成する方法について述べる。ただし、伝達自体が細胞の機能に影響を与えるので、非導入細胞をテストを含むいくつかのコントロールを実行する必要があります。さらに、miRNA 阻害剤は、miRNAs の効果を中和するために使用できます。

世界保健機関によると 2015 年に世界的なマラリアの 2 億 1200 万の新しいケースもあったし、約 429,000 人が死亡、子供 5 歳未満年齢1の主に。血管機能障害と関連付けられる多くの場合、深刻な病気につながるメカニズムには、不明確な2が残っています。マラリア原虫感染は分泌細胞小胞 (Ev) として知られている小さい bi 脂質膜球です。知られているこれらの EVs が潜在的に関連する宿主の免疫応答、感染プロセスに感染。しかし、ほとんどはマラリア感染症3の間にこれらの小胞の正確な機能について知られています。彼らは 2 つの重要な役割を果たすことが可能です: 1 つの手を貢献するかもしれない病因活性化マクロファージ4,の5;その一方で、寄生虫および寄生虫とホスト6,7間通信調停をする可能性があります。実際には、寄生虫は、EVs を介してお互いの間蛋白質または核酸を転送できます。たとえば、トリパノソーマrhodesiense EVs 毒性因子 Serum Resistance-Associated (SRA) を転送することができます、他t. グリコシルホスファチジルイノシトールとホストの両方の赤血球8をターゲットすることができます。さらに、マラリア感染は、EVs 内で核酸を転送することによってお互いの間通信します。これにより最適化し、その成長を同期する寄生虫です。実際には、EVs がガメトサイト変換の主要なレギュレータをしてしたがって、伝送ステージ7の規則に貢献。
だけでなく、EVs は寄生虫を規制する、彼らはまた寄生虫ホストの相互作用を仲介します。最近、内側から Ev を含む宿主由来の Microrna (Mirna; 21-25 のヌクレオチド9の範囲で小さな RNA 種) ひと内皮細胞によってとられたことを発見しました。EVs の miRNAs 形成 Ago2 と複雑な安定 (メンバーによる RNA サイレンシングの複雑な)、受信者のセルに届けた後は特にサイレンシング遺伝子発現、細胞10のバリヤ特性に影響を与えることができます。標準的なプロトコルは、EVs の機能を調査するために開発されています。ここでは、我々 はまず受信者細胞による吸収を調査する EVs の蛍光ラベリングを可能にするプロトコルをについて説明します。さらに、共焦点の顕微鏡を使用して、セル内の EV の運命を追跡することが可能です。いくつかの蛍光染料は、EVs を追跡する使用ことができます。アミン反応性色素、5-(and-6) Carboxyfluorescein ジアセテート サクシニミジルエステル (CFSE) と小胞内カルセイン AM になる蛍光を一度。明るくより均一な信号を与えるので PKH、両親媒性ラベルを使うことが望ましい。このアプローチは、EVs と受信者の細胞間の相互作用を理解するための重要な情報を提供します。一方、いくつかのケースで EVs は細胞の表面に結合、いくつかの小胞急速にとられる。取り込み時に EVs は、出す規制機能の細胞に彼らの貨物を提供します。
ここでは、細胞膜を通して蛍光デキストランの転送を定量化することで培養内皮細胞のバリア機能を測定するためのプロトコルについて述べる。敏感なトレーサーは放射性標識マーカーなど使用できます。ただし、使用するため特別な安全上の注意が必要です。他のアッセイは、内皮下電気抵抗 (TEER) タイト結合の整合性を測定するなどの in vitroバリア機能を測定する存在します。最終的に蛍光抗体法で ZO-1、タイト結合蛋白を可視化によりよく10としてタイト結合の整合性の評価ができます。EVs は規制の潜在的な特性を持ついくつかの貨物を含む複雑な異種のエンティティであるので、レシピエントの細胞への影響を研究する特定の RNA をノザンに便利です。したがって、利息10の miRNA を表現する安定したセルラインを生成することを目的とするプロトコルを定義するもできます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MINI67-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diluent C</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher - Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin CF594</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#00045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B isothiocyanate&#8211;Dextran</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R9379-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insert with PET membrane transparent Falcon&#160;for plate 24 wells</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth&#160;Medium MV</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-22020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9620-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit</td>
			<td>Biovision</td>
			<td>K300-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hexadimethrine bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107689-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION&#160;Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HLMIR0583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NCLMIR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION&#160;Lenti microRNA, Human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NCLMIR0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4366597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsa-mir-451a&#160;RT/750 PCR rxns</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>001141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6 snRNA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>001973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal Master Mix II, with UNG</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4440038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of extracellular vesicle function during malaria infection

マラリアは、原虫によって引き起こされる生命にかかわる病気、マラリア最もアフリカ大陸で流行しているとほとんどマラリア関連の死の責任世界的に。マラリアに感染した人々 の病気の進化に影響を与える組織、血管不全、および炎症性応答の寄生虫隔離を含むいくつかの要因。マラリアの感染赤血球 (内側) リリース小さな細胞小胞 (Ev) 寄生虫とホスト間の病態と細胞のコミュニケーションを仲介する貨物分子の種類を含みます。EVs は効率的に彼らが彼らの機能を調節する細胞によってとられます。ここで寄生虫ホストの相互作用における Ev の役割に対処するための戦略を議論します。まず、緑細胞リンカー染料を使用してラベリングおよび血管内皮細胞による EV 内面を追跡するために簡単なメソッドを説明します。第二に、蛍光に分類されたデキストランを使用して血管内皮細胞単層膜の透磁率を測定する簡単な方法を報告する.最後に、内皮細胞の機能に小さな非コード RNA 分子の役割を調査する方法を示します。

ここでは、EVs の宿主細胞との相互作用を調査するプロトコルについて述べる.蛍光に分類された EVs の取り込みは、共焦点顕微鏡 (図 1) によって監視されます。取り込みを追跡する EVs とインキュベーション時間を最適化できますが、内皮細胞は効率的に、EVs を取る。細胞内の EVs のより良いローカライズのファロイジンをアクチンを染色します。次に、内皮細胞の単層が育つ上にフィルター膜を使用します。ローダミン B イソチオ シアン酸デキストランはフィルター膜の上部室に適用され、内皮細胞の膜の透磁率監視ボトムチャンバー (図 2 a) に蛍光のデキストランの転送によって測定されます。通常、EVs (図 2 b) の増加量の培養血管内皮細胞の透過性を影響します。単層、そうでなければ染料にすばやく拡散する井戸を形成するかどうかを確認するため数日間セルを育てることが重要です。治療がなくて、デキストラン、細胞膜を通してゆっくりとびまん性に注意することが重要です。
マイクロ Rna は、キーコンポーネントの EVs と受信者の細胞への転送後、彼らは遺伝子発現を調節します。特に Mirna の役割を調査するためには、レシピエントの細胞ラインでそれらをノザンに便利です。ここで我々 は血管内皮細胞への Mirna を変換する方法をについて説明します。安定して導入された細胞 (図 4 a) を選択するために内皮細胞を殺すピューロマイシンの濃度を決定する最初のステップで構成されます。最後に、Mirna の表現のレベルを制御および、qPCR (図 4 b) によって検証できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57067/57067fig1.jpg"> 図 1: 内皮細胞によって取り上げられている EVs 。精製された EVs PKH67、緑と内皮細胞の単層で 4 時間培養でラベル付けされました。未処理の内皮細胞は、陰性対照として使用されます。非連結の EVs を削除する広範な洗浄した後セル ファロイジンをアクチン (赤) を染色するとヘキスト 33342 (青) 核を染色する染色。セルは、共焦点顕微鏡で観察しました。画像は、レーザー共焦点顕微鏡と 63 × 1.3 NA 石油目的を使用して撮影されました。Hoechst 33342 は 405 で興奮している nm と排出量 450 470 nm (青色); 収集PKH67 は 488 で興奮している nm、505 530 nm (緑); 収集の排出量ファロイジン 594 543 で興奮していると nm、620 で収集された排出量 nm。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57067/57067fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57067/57067fig2.jpg"> 図 2: 内皮障壁に及ぼす EV 吸収。ローダミン標識デキストランの拡散 (A) 回路図: 内皮細胞成長フィルター膜上に合流する、蛍光デキストラン上部室に適用され、時間をかけて膜を介して拡散します。EVs の透磁率に及ぼす影響は、下部室にデキストランの拡散の率を測定することにより上部室に EVs の付加の後で評価されます。EVs の (B) 増加量は血管内皮細胞と孵化させます。時間をかけてトランスも膜ローダミン標識デキストランの転送は、透磁率測定が可能です。50 と 100 μ g/ml EVs のインキュベーションの 2 h 後内皮層に透磁率を大幅向上します。データは、3 の実験から平均 (± s.e.m.) を表します。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57067/57067fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57067/57067fig3.jpg"> 図 3: ピューロマイシンの滴定します。ピューロマイシン (10 mg/mL) の原液を希釈して、100 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン ピルビン酸ナトリウム 1 mM, 2 mM グルタミン 10% 熱不活化 (56 ° C, 30 分) 胎仔血清添加 RPMI 1640 年に。10 mL チューブ A 中に合計 15 μ L を追加します。7.5 mL のチューブから溶液をチューブ B. RPMI 2.5 mL に混ぜ最後に、希釈の 100 μ L は、100 μ L のように 7.5 μ L/mL、5.62 μ L/mL の最終的な集中を与えるためにセルに追加されます。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57067/57067fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57067/57067fig4.jpg"> 図 4: miR451a を過剰発現する内皮細胞の生成します。(A) ピューロマイシン内皮細胞の殺害の曲線の決定。線量の増加、ピューロマイシンを添加して血管内皮細胞。72 h MTS 法による生存率を測定しました。データは、1 つの代表的な実験の平均値 (± s.e.m.) を表します。MiR451a を過剰発現する血管内皮細胞由来の Rna (B) または陰性対照が収穫され、miR451a トラン スクリプトのリアルタイム PCR を用いた定量化を行った。qPCR 結果は家政婦遺伝子として U6 を用いた 2 Ct 法による正規化し、意味 (± s.e.m.) として表現(n = 3 の実験)。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57067/57067fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

この作品は、熱帯熱マラリア原虫感染赤血球によるリリース細胞小胞 (Ev) の役割を調査するプロトコルについて述べる.特に、我々 は EVs 血管内皮細胞との相互作用に焦点を当てます。

マラリア感染時の細胞の小胞の機能評価

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

evaluation-of-extracellular-vesicle-function-during-malaria-infection

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.5K ビュー.  University of Fribourg. この作品は、熱帯熱マラリア原虫感染赤血球によるリリース細胞小胞 (Ev) の役割を調査するプロトコルについて述べる.特に、我々 は EVs 血管内皮細胞との相互作用に焦点を当てます。

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Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

好中球細胞外トラップ：それらを生成して可視化する方法

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

免疫・感染学

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

からのDNA抽出のためのシンプルなChelexプロトコル<em&gt;ハマダラカ</em&gt;属。

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting chromosomal rearrangements, and studying three-dimensional (3D) organization of chromosomes in the cell nucleus. The advent of laser capture microdissection (LCM) and whole genome amplification (WGA) allows obtaining large quantities of DNA from single cells. The increased sensitivity of WGA kits prompted us to develop chromosome paints and to use them for exploring chromosome organization and evolution in non-model organisms. Here, we present a simple method for isolating and amplifying the euchromatic segments of single polytene chromosome arms from ovarian nurse cells of the African malaria mosquito Anopheles gambiae. This procedure provides an efficient platform for obtaining chromosome paints, while reducing the overall risk of introducing foreign DNA to the sample. The use of WGA allows for several rounds of re-amplification, resulting in high quantities of DNA that can be utilized for multiple experiments, including 2D and 3D FISH. We demonstrated that the developed chromosome paints can be successfully used to establish the correspondence between euchromatic portions of polytene and mitotic chromosome arms in An. gambiae. Overall, the union of LCM and single-chromosome WGA provides an efficient tool for creating significant amounts of target DNA for future cytogenetic and genomic studies.

Chromosome painting is a useful method for studying organization of the cell nucleus and evolution of the karyotype. Here, we demonstrate an approach to isolate and amplify specific regions of interest from single polytene chromosomes that are subsequently used for two- and three-dimensional fluorescent in situ hybridization (FISH).

マラリア蚊の2Dと3D染色体絵画

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

ハイスループット定量的リアルタイムRT-PCRアッセイのタイプIおよびIIIインターフェロンサブタイプの発現プロファイルを決定するための

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Evaluation of Blood Lactate and Plasma Insulin During High-intensity Exercise by Antecubital Vein Catheterization

The measurement of metabolic and endocrinal markers during physical activity is of relevance to understanding the physiological implications of different exercise modalities. During some exercise modalities (e.g., high-intensity interval exercise), blood metabolites and hormonal levels change in short periods of time. In the present study, we describe a method to catheterize the antecubital vein, which allows the collection of several blood samples during exercise. Insulin and venous lactate concentrations were measured during high-intensity exercise by the application of the described method. The exercise consisted of three 30 s bouts of high-intensity exercise separated by 4 min of recovery. After the last recovery period, a Wingate test was performed. Blood samples from the antecubital vein were obtained before and after each 30 s bout and before and after the Wingate test. As a result, it was possible to evaluate the plasma insulin and venous blood lactate variations during the exercise.

Here we present a protocol to obtain several blood samples from the antecubital vein during high-intensity interval training. This protocol may be useful for the measurement of blood metabolites and endocrinal markers during exercise.

肘静脈カテーテル法による高強度運動時の血中乳酸および血漿インスリンの評価

The measurement of metabolic and endocrinal markers during physical activity is of relevance to understanding the physiological implications of different ...

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ cytosolic concentrations, linked to release from internal stores or an influx through plasma membrane channels, regulate cortical cell processes. Pathogens that adhere to or invade host cells trigger a reorganization of the actin cytoskeleton underlying the host plasma membrane, which likely affects both global and local Ca2+ signaling. Because these events may occur at low frequencies in a pseudo-stochastic manner over extended kinetics, the analysis of Ca2+ signals induced by pathogens raises major technical challenges that need to be addressed.
Here, we report protocols for the detection of global and local Ca2+ signals upon a Shigella infection of epithelial cells. In these protocols, artefacts linked to a prolonged exposure and photodamage associated with the excitation of Ca2+ fluorescent probes are troubleshot by stringently controlling the acquisition parameters over defined time periods during a Shigella invasion. Procedures are implemented to rigorously analyze the amplitude and frequency of global cytosolic Ca2+ signals during extended infection kinetics using the chemical probe Fluo-4.

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Here, we present protocols to visualize calcium (Ca2+) responses elicited by HeLa cells infected by Shigella. By optimizing the parameters of bacterial infection and imaging with Ca2+ fluorescent probes, atypical global and local Ca2+ signals induced by bacteria over a large range of infection kinetics are characterized.

上皮細胞の赤痢菌の感染時に Ca2 +応答をイメージング

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

Mouse Body Temperature Measurement Using Infrared Thermometer During Passive Systemic Anaphylaxis and Food Allergy Evaluation

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature readings is common, and they have been proven to be accurate and invaluable in this regard. However, this method of temperature measurement requires the mice to be anesthetized in order to insert the probe without injury to the animal. This limits the ability to observe other phenotypes of the mouse simultaneously. In order to investigate other phenotypes while measuring temperatures, rectal probes are not ideal, and another method is desired. Here, we introduce a noninvasive method of temperature measurement that foregoes the requirement for mouse anesthesia while maintaining equal reliability to rectal probes in measuring body temperature. We use an infrared thermometer that detects body surface temperatures at ranges between 2 and 150 mm. This method of body temperature measurement is successful in reliably replicating temperature change trends during passive system anaphylaxis experiments in mice. We show that body surface temperatures are about 2.0 &#176;C lower than rectal probe measurements, but the degree of temperature drop follows the same trend. Furthermore, we use the same technique to observe mice in a food allergy model to evaluate temperature and activity levels simultaneously.

Here we present a new method to accurately measure body temperature differences in passive systemic anaphylaxis (PSA) and food allergy mouse models using an infrared thermometer. This procedure has been accurately duplicated in previous PSA results.

パッシブ全身性アナフィラキシーと食品アレルギーの評価中に赤外線放射温度計を使用してマウスの体温測定

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. Immunofluorescence microscopy and image-based quantification methods remain important tools to quantitate neutrophil extracellular trap formation. However, there are key limitations to the immunofluorescence-based methods that are currently available for quantifying NETs. Manual methods of image-based NET quantification are often subjective, prone to error and tedious for users, especially non-experienced users. Also, presently available software options for quantification are either semi-automatic or require training prior to operation. Here, we demonstrate the implementation of an automated immunofluorescence-based image quantification method to evaluate NET formation called NETQUANT. The software is easy to use and has a user-friendly graphical user interface (GUI). It considers biologically relevant parameters such as an increase in the surface area and DNA:NET marker protein ratio, and nuclear deformation to define NET formation. Furthermore, this tool is built as a freely available app, and allows for single-cell resolution quantification and analysis.

Here, we present a protocol for generating neutrophil extracellular traps (NETs) and operating NETQUANT, a fully automatic software option for quantification of NETs in immunofluorescence images.

NETQUANTを用いた好中球細胞トラップの自動画像ベース定量

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

宿主-病原体応答とマウスでワクチンの有効性の評価

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection setting. The presented method is meant to isolate EVs away from virions (i.e., HIV-1), allowing for a higher efficiency and yield compared to conventional ultracentrifugation methods. Our protocol contains three steps: EV precipitation, density gradient separation, and particle capture. Downstream assays (i.e., Western blot, and PCR) can be run directly following particle capture. This method is advantageous over other isolation methods (i.e., ultracentrifugation) as it allows for the use of minimal starting volumes. Furthermore, it is more user friendly than alternative EV isolation methods requiring multiple ultracentrifugation steps. However, the presented method is limited in its scope of functional EV assays as it is difficult to elute intact EVs from our particles. Furthermore, this method is tailored towards a strictly research-based setting and would not be commercially viable.

This protocol isolates extracellular vesicles (EVs) away from virions with high efficiency and yield by incorporating EV precipitation, density gradient ultracentrifugation, and particle capture to allow for a streamlined workflow and a reduction of starting volume requirements, resulting in reproducible preparations for use in all EV research.

ウイルスから離れた高収率細胞外小胞製剤の精製

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...