VCUからA·ディキンソンのスタートアップ資金がこの作品を支持した。 著者は、概略図を作成する際に、彼の芸術的才能のためのダンNacuを認識したい。

<ol>
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著者らは、開示することは何もない。

アフリカツメガエルは、発達のメカニズム基礎口腔顔面開発を解剖するための有用なツールとなっています。しかし、カエルは、この領域の大きさや形状変化を記述するないプロトコルは現在ありません。ここで説明する方法では、アフリカツメガエルや他の脊椎動物における口腔顔面の表現型のより厳密な定量化を可能にすることによって口腔顔面開発の分野に大きく貢献していきます。 適切にこのプロトコルを実行する最初の、最も重要な側面は、顔の寸法を測定し、両方を正確かつ再現ランドマークの配置を決定する能力である。このためには、胚性面が同じ角度、方向の倍率で撮影されることが重要である。それが横方向に胚を操作し、一貫性のある配置を達成することは困難であるように、特に注意が、鼻の長さの正確な測定値を得るように注意しなければならない。一人の人間がS上のすべての測定を実行持つ結果の再現性を最大化しながら、AME日は、この種のエラーを最小限に抑えます。良好な結果を確保する二番目に重要な側面は、そのような発達の違いや遺伝的背景として、不必要な変動性の減少である。微妙な欠陥との間の統計的有意性を評価する際に特に重要である。胚は、従って、処理され、撮影時と同じステージである必要がある。また、ケアは発達率は治療群間との間で同等であることを確認するために注意する必要があります。変動性でこのような問題を減少させるために、すべての胚は同じ親からであり、実験開始時に一致した段階であることを確認してください。また、（例えば、混雑を防止するため）培養皿に、異なるバッファ源とボリューム、胚の異なる数、及び分布などの変動の外部ソースを減らす。 幾何学的形態計測を通して形状変化の評価における重要なステップはalignmenですランドマークのtはプロクラステスフィットを経由して調整します。この数学的アルゴリズムを適用することによって、サイズや画像の回転の違いに関する情報が削除される。その後生成された共分散行列は、ランドマークの標準化されていないような相関が主成分や判別関数analyses-などの統計techniques-を行うことができる多変量するデータセット内のすべての胚のうち、座標を決定する。 主成分分析（PCA）は、主成分26と呼ばれる変数の小さい集合に複雑なサンプルを低減します。第一成分が残りを占める各後続のコンポーネントに、サンプルセット内の最も差異を占める。使用して互いに形態計測ソフトウェアに対する最初の二つの成分、一緒にクラスタ最も類似したサンプルをプロットすることによって。同時にその中の変化を判定しながらこのように、PCAは、サンプルセット内のグループを識別する。ソム中電子ケースは、グループは、互いに明確に区別することのいずれかまたは両方の軸に沿って重ならない。この場合には、グループが判別されることにより、微細な特徴を明らかにするために、他の成分（例えば、PC3）をプロットすることが有利である。総分散がより均等に最初のいくつかの変数の間に分散​​される場合に特に適切である。 プロクラステスフィットデータの判別分析（DFA）は、データセット内のサンプルは、それらを効果的に定義する連続変数によってグループに区別されるかどうかを決定します。サンプルは、したがって、分析前のグループに分類され、変数はグループ27間の統計的関係を決定する差別関数と呼ばコンポーネントに換算されている。この分析を実行する前に、順列検定の数を示すために重要である。これらの順列テストは、その分布についての仮定がeliminaであるように、データをランダム化テッド。以上の並べ替え検定の反復は、p値の精度を高める。変態グリッドとして視覚化した場合、グループ間のランドマーク位置の大幅な変更が表示され、比較される。形状変化が発生する場所、さらに、グリッドの反りパターンが明らかになった。この分析の欠点は、それが2つのグループの比較のために利用できることである。比較のためのサンプルセットに3つ以上のグループがある場合には、正準変量分析を実行した方がよい。これは、統計的なp値を生成するという点でDFAに類似している。しかし、それは、そのセット内の個々のグループの間で発生するものに加えて設定され、サンプル全体にわたって起こる変化を示している。 この顔面定量プロトコルの主な制限は、それが唯一の二次元データに適用することができることである。今後の目標は、三次元データの分析のための同様の方法を開発するためにCTスキャンまたは共焦点顕微鏡を使用することを含む。一方、二次元画像を扱うことも、このプロトコルの主な強みの一つです。カメラを装備し、基本的なステレオスコープは、胚の顔の画像を取り込むために必要とされる。コストを低減しつつ、このデータ分析に利用Openwareはまた、この方法のアクセシビリティを増大させる。さらに、sophisticalイメージング、統計分析、またはコンピュータプログラミングの高度な知識は、データから意味のある、重要な結果を抽出するために必要とされていません。実際に、この技術は、現在、生物学VCU部門の学部の実験室コースの一部として教えられている。したがって、ここに提示顔面定量化プロトコルが学習し、短時間に適用することは容易である。映像表現として、そのようなソフトウェアを胚を配置し、ナビゲートするなどの重要なステップが成功しても、訓練を受けていない学生や研究者が利用可能なプロトコルを確実にするために強調されている。要約すると、このプロトコルは、貴重な資源を提供する研究コミュニティのためにと教育ツールとして。

人間の先天性欠損症の最も一般的かつ破壊的な種類の中には、口腔顔面裂1として、口や顔に影響を与えるものである。不正な形式の口腔顔面構造を持つ子どもたちが生涯にわたって、複数の手術を受け、顔面disfigurements、スピーチ、聴力や食の問題に苦労しています。したがって、cranio-および口腔顔面開発に新たな研究を促進することは、ヒトにおける先天性欠損、これらのタイプの予防と治療に最も重要である。 アフリカツメガエル頭蓋顔面の開発を支配するメカニズムを解剖するための新しいツールとして浮上している（いくつかの例は、2,3,4を含む-11）。したがって、この種の頭部の発達と顔の間に大きさや形状変化を分析するための定量的な方法は3非常に強力である可能性があります。 ここでは、そのような方法を提示する。 アフリカツメガエルの研究12から適応幾何学的形態計測を持つ伝統的なサイズ測定を組み合わせる</人間の顔の形13-15を分析する研究のSUP&gt;と富。このプロトコルの目的は、研究者は、正常および異常な発達の間の異なる顔面表現型を区別するために、顔の大きさや形状を定量化できるようにすることである。この分析は、遺伝子および/または環境要因の相乗効果に起因するもののような微妙な顔面頭蓋の欠陥との間のより良好な区別を可能にする。さらに、この定量方法は、また口腔顔面欠陥の場合でもわずかな改善や救助を明らかにできた。したがって、これはそれの潜在的治療薬の分析に有用な指針になります。 ここで提示する顔の測定値と幾何形態計測の組み合わせは、大部分が1つまたは他の15-18を利用し 、現在のプロトコルよりも口腔顔面領域の大きさと形状の両方のより総合的な統計分析を可能にする。さらに、我々はの内側および外側面の両方を評価するための簡単​​な方法を提示現在の研究13,19で使用される洗練された三次元画像装置を必要とせずに、顔。 私たちは、 アフリカツメガエルでこのプロトコルは、異常な口腔顔面開発および中央値口蓋裂2,3を誘導するレチノイン酸受容体阻害剤で処理された胚をツメガエル実証する。これらの胚における口腔顔面領域の寸法及び形状の定量化は、類似の口蓋裂およびマウスモデル20,21を有するヒトに類似している顔面の変化を明らかにした。しかしながら、このプロトコルは、成長因子などの天然物質、除草剤、またはタンパク質などの口腔顔面開発に関する他の化合物の効果を評価するために利用することができる。さらに、損失または機能実験のゲインを介して遺伝子発現の摂動から生じる口腔顔面の大きさ及び形状の変化（アンチセンスまたはモルホリノCrispersを使用するには、/ Talens）もまた、このプロトコルを使用して定量することができる。最後に、我々は、このメソッド書または仕様書を開発LLY アフリカツメガエルの形態を評価する。しかしながら、容易に任意の脊椎動物の分析のために修正される。他のアプリケーションも、進化や生態の研究のために密接に関連した種を比較するため、このプロトコルを使用して含めることができます。ここで提供する例は、口腔顔面領域の分析を記述するためにこのプロトコルを利用するが、それは容易に他の領域、臓器または構造の分析のために修正することができる。 この口腔顔面定量化プロトコルは、研究コミュニティのための貴重な資源だけでなく、ビデオのデモンストレーションとして学部学生のための優れた教育ツールとなります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="818">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:304px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:143px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:236px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>fitted with AxioCamICC1 camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 Inox forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile, disposable scalpel</td>
			<td>Sklar</td>
			<td>06-2015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">24-well plate</td>
			<td style="width:143px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">087721</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:304px;">Standard Disposable transfer pipettes</td>
			<td style="width:143px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">13-711-7M</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">150 mm X 15 mm Petri dishes</td>
			<td style="width:143px;">Falcon</td>
			<td style="width:136px;">351058</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Incubators</td>
			<td style="width:143px;">Ectotherm</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:236px;">set to 15C or 20C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:304px;">Modeling Clay</td>
			<td style="width:143px;">Premo, or other non-toxic modeling clay</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:236px;">in black or white</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Straight teasing needle</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">19010</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:304px;">Capillary Tubing (for needles)</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-1</td>
			<td style="width:236px;">Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber, 100 mm each</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:304px;">Needle Puller, Model P-97&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sutter Instrument Co,&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B</td>
			<td style="width:236px;">For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:304px;">Pipettemen</td>
			<td style="width:143px;">Gilson</td>
			<td style="width:136px;">F144802, F123600, F123602</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">BMS-453</td>
			<td style="width:143px;">Tocris</td>
			<td style="width:136px;">3409</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:304px;">DMSO</td>
			<td style="width:143px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:136px;">AB00435-01000</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Cysteine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">52-90-4</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Paraformaldehyde powder</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">158127</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:304px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:143px;">Falcom</td>
			<td style="width:136px;">353003, 351058</td>
			<td style="width:236px;">100 mm diameter and 150 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:143px;">VWR</td>
			<td>89125-170</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of orofacial phenotypes in xenopus

アフリカツメガエルは、頭蓋顔面の開発や欠陥を支配するメカニズムを解剖するための重要なツールとなっています。口腔顔面開発を定量化する方法は、遺伝的または分子的遺伝子発現またはタンパク質機能を操作することができる物質と廃止時顔面表現のより厳密な分析を可能にする。胚の頭部の二次元画像を用いて、従来のサイズの寸法を、そのような口顔の幅、高さ及び面積 - を計測する。また、胚口開口部の真円度測定は、口の形状を説明するために使用される。これらの二次元画像の幾何学的形態計測はまた、口腔顔面領域の形状の変化をより洗練されたビューを提供するために行われる。ランドマークは、口腔顔面領域内の特定のポイントに割り当てられ、座標が作成されます。主成分分析は、その後の処置を判別主成分にランドマークの座標を低減するために使用されるグループ。これらの結果は、類似した口腔顔面形状の個人が一緒にクラスター化した散布図として表示されます。これは、統計的に両群間のランドマークの位置を比較し、判別関数分析を実行することも有用である。この分析は、ランドマークの位置の変化は、ベクトルとして見られる変換グリッドに表示される。グリッドはワーピングパターンがかなりのランドマークの位置が変更されている場所を示すために表示されるように、これらのベクターに重畳される。判別関数分析における形状の変化は、統計的尺度に基づいており、したがって、p値によって評価することができる。この分析は、唯一のステレオスコープやフリーウェアのソフトウェアを必要とし、シンプルかつアクセス可能であるため、貴重な研究と教育のリソースとなります。

ここでは、口顔の大きさおよび形状の定量分析は、未処理対照とレチノイン酸受容体阻害剤（RAR阻害剤）で処理された胚を比較することが実証された。胚をステージ24から30までこの化学阻害剤の1μM濃度（26-35 HPF）で処理し、洗い流され、ステージ42（82 HPF）で固定した。次いで、それらを処理し、プロトコルに記載のように分析した。結果は、元のデータが、以前の出版物2,3の観測と一致している。対照胚は、ビヒクル、DMSOで処理した（ 図7AIと、ii）通常、開発された。 （ 図7Aiii、ⅳ）より三角形をRAR阻害剤の1μMの濃度で処理された胚は、顔、目の異常のわずかな狭小化を示し、それを開いて不正な形式の胚口があった。 まず、従来の顔面寸法を測定し、 図7Bに要約されている。 S<html> tatistical有意性は、各測定のための阻害剤で処置した胚と対照との間で不等分散を仮定しスチューデントt検定を行うことによって決定した。私たちは、鼻の長さと顔の幅の両方が大幅にコントロールと比較したRAR阻害剤治療胚で減少したことを見出した（それぞれp値= 0.0062及び0.0058; 図7BI、ⅱ）。顔の高さと口の真円度が有意に増加したが（p値を=×10 -6 3.7772は、1.4812×10 -7）は 、口の幅が大幅に減少した（p値= 2.5175×10 -10; 図7Biii-v）の .theの結果は、2つのグループ間の全体的な口腔顔面領域（; 図7Bvi p値= 0.3754）に有意差を示さなかった。これらのデータは、短い口吻で開発成果の特定の時点におけるレチノイン酸シグナル伝達の喪失、中顔面領域のわずかな狭小化、および胚口の開口部の奇形を示した。 塩基 &quot;&gt;縮小レチノイン酸シグナルに応答して、胚の口腔顔面領域の形状変化の洗練されたビューを提供するために、次の利用の幾何学的形態計測分析。形態計測分析ソフトウェアを使用して口腔顔面ランドマークを識別し、位置合わせした後、我々は、各内の分散を調べた最初の2つの構成要素が互いに、RAR阻害剤で処理した胚に対してプロットしたときに、主成分分析（PCA）を介してグループは。PC1軸（ 図7C）に沿った対照から明確に区別された。この試験は、サンプル設における異常値を示したグループ（ 図7C、矢印）の残りの部分とクラスタリングしなかった2阻害剤治療の胚で図示。 次に、RAR阻害剤で処理された胚と対照との間口腔顔面領域の形状における統計的差異を評価し、判別関数分析（DFA）を行うことにより可視化した。プロクラステス距離betweenつのグループは、有意に異なった（距離= 0.2665、p値&lt;0.0001、 図7D）、レチノイン酸シグナル伝達が中断されたときに口顔形状の変化を示す。実際、口腔顔面領域での横方向のランドマークの位置での劇的なシフトは、阻害剤処理された胚（ 図7D）での高さにそれぞれの顔の形の狭窄を示している。また、鼻のランドマーク（ 図7D、矢印）の位置のわずか外側へのシフトは、鼻の減少伸長と一致しているこれらの胚における鼻孔位置の異常を明らかにする。それが私たちの以前の研究で報告された2,3の中央値裂と一致している開いた三角形の口の形成を反映した口のオープニングショー位置が変化のエッジを定義するランドマークのずれ。ベクトルシフトに加えて、変換グリッドの反りのパターンはまた、形状変化を示し、またはofacial地域。中顔面領域における反りは、中顔面形成不全と減少したレチノイン酸シグナルと胚で見られ、全体的な顔の狭小化（ 図7D）と一致している。 判別分析（DFA）の結果は、我々の定性分析と一致した形状変化を示しているだけでなく、適切に単独の伝統的なサイズ測定によって捕獲されなかったいくつかの変更を明らかに。口腔顔面領域が対照の間に有意差はなかったし、治療胚（ 図7Bvi）を阻害しながら、たとえば、DFA変換グリッドは、阻害剤処理された胚（ 図7A、D）に見られる顔の狭小化と矛盾し、この領域での劇的な変化を明らかにした。さらに、我々は口の丸みで見た重要な変化と相まって口の開口部の反りパターンとランドマークのシフト、阻害剤処理したエンブリー形状を開け口の奇形を説明OS。レチノイン酸シグナルが中断された場合要約すると、顔の寸法および幾何学形態計測分析の従来の測定値の組み合わせは、口腔顔面領域の形状及び大きさの変化を示している。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52062/52062fig1highres.jpg" width="500" /> 1.必要な材料図。データ分析のために、（A）ツール。 （i）の24ウェルプレート、（ii）は、標準的な使い捨てのトランスファーピペット、（iii）のデュモン＃5イノックス鉗子、（iv）は、粘土で裏打ちされたペトリ皿、（v）はストレートいじめ針、（vi）のガラスピペットツール、（ト粘土で裏打ちされた料理の）滅菌、使い捨ての外科用メス（B）の準備。 （i）の直いじめ針は、粘土の水平線を描画するために使用される。 （ii）のガラスピペットツールは、各列に沿って円形の窪みを作るために使用される。 （iii）の皿は、イメージングのためにPBTが充填されている。 ページ= &quot;常に&quot;&gt; <img alt="図2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52062/52062fig2highres.jpg" width="300" /> アフリカツメガエルの卵の体外受精や文化で図2。 HCGの注射後（A）は 、成体アフリカツメガエルは、メスが産卵するように誘導されるツメガエル （B）卵を標準的な方法を用いて、高塩MBS収集男性から抽出された精巣で受精し、培養する。（C）胚に転送される標準的な使い捨てトランスファーピペットを用いて0.1×MBSを含む24ウェルディッシュ（D）Aに較正ピペットマン空ウェルに1ミリリットルを測定するために使用され、マーカーはすべてのウェルの外側にこのレベルを画定するために使用されを含む胚（挿入図）。 0.1×MBSは、その後追加されたり、それがこのマークと同じ高さになるように離れて撮影されている。 highres.jpg &quot;幅=&quot; 500 &quot;/&gt; イメージングのための胚の頭部の調製図。ヘッドを取り外すために必要な2つの切開の（A）図、黒い実線。スケールバー=400μmである。（B）最初の切開を外科用メスの尾放出圧力を除去するために消化管の後端に形成されている。スケールバー=400μmである。（C）は第2切開部が完全に頭を切断するために、心臓の近くに腸の前端に形成されている。スケールバー=400μmである。（D）粘土に位置する胚ヘッドの列の正面図である。スケールバー=650μmの。（E）の粘土で胚ヘッド位置の行の横方向の景色。スケールバー= 500μmのCG：セメント腺。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52062/52062fig4highres.jpg" width="500" /> 口腔顔面寸法4.伝統サイズ測定図。 （A） </強い&gt; フェイス幅 。矢印は、眼の腹の部分が顔の周囲を満たすポイントを示す。赤い線は、これらの点の間の距離として測定歯幅、である。スケールバー=210μmの。（B）の 顔の高さ。白いラインが目の背側エッジとセメント腺の背側縁部で測定前に描かれたガイドです。赤い線は顔の正中線でのこれら2ガイドの間の距離として測定された顔の高さ、である。スケールバー=210μmの。（C） 口腔顔面領域です。白の線は測定前に描かれたガイドです。 （a）は、下部ガイドは、左眼の腹端を満たすポイント。赤い線は、左眼の周りのトレースを示しています。目の背側縁が上部ガイドを満たしている場合に（b）のポイント。青い線は、目の背側縁部でトップガイドに沿ってトレースされた口腔顔面領域の背側の境界を示している。トップガイドは右の顔の周囲を満たす（c）のポイント。緑色のラインショー右目の周りにトレース。右眼の腹側縁が下部ガイドを満たしている場合（d）は、ポイント。黄色の線は、セメント腺の背側縁部における下部ガイドに沿ってトレースし、口腔顔面領域の腹側の境界を示している。スケールバー=210μmの。（D） スナウトの長さ。白い線が眼の前縁で、測定前にガイドとして描かれている。赤い線はこのラインからセメント腺の背側縁が顔の横方向の周囲を満たす点まで測定された、鼻の長さです。 =300μMのスケールバー。（E） 口幅。矢印は、背側と腹側の唇が会うポイントです。赤い線は、これらの2点間の距離として測定さ口幅である。スケールバー=200μmである。（F） 口の丸み 。口の開口部の周囲をトレースし、赤色で示されている。 CG：セメント腺。スケールバー=200μmである。 <img aLT =「図5「FO：コンテンツ幅= &quot;5インチ&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 52062 / 52062fig5highres.jpg&quot;幅= &quot;500&quot; /&gt; 図5.幾何学的形態計測分析のためのランドマークと予選をキャプチャする。 （A）のランドマークを配置し、座標を捕捉する写真編集ソフトウェアや表計算プログラムを使用する。 （i）の多色十字は口腔顔面領域の形状を表現するためにはImageJにおける追加ポイントツールを使用して、画像上に配置目印である。 （ⅱ）ランドマークデータが表示結果ツールを使用して表示されます。 （ⅲ）ランドマークデータをコピーしてスプレッドシートに貼り付けられます。第二列の上にランドマークの数を特定し、「LM = 24 &quot;（赤いボックス）で示されるヘッダがある。データの2番目の列の下には、サンプルは、固有の名前を与えられ、「ID = CON1 &quot;（赤い矢印）で示される。これは、サンプルセット内のすべての画像に対して繰り返され、データはテキストファイルとして保存されている。幾何学的形態計測SOFTWにおける（B）予備的なデータ分析プログラムです。 （ⅰ）写真編集ソフトウェアから作成したテキストフ​​ァイルは、TPSファイルとして、形態計測プログラム、MorphoJにインポートされます。ファイルは、赤い矢印で示されている。 （ⅱ）ランドマーク座標データが主軸によってクラステス嵌めによって整列されている。赤い矢印は、アラインメントの実行を示す。 （ⅲ）プロクラステスフィットランドマークの共分散行列は前置きメニューに生成されます。 （iv）の分類子ファイルは、スプレッドシート内に作成される。列AとBは、それぞれ、ヘッダ「ID」と「TREATMENT」を与えられている。 IDのランドマークデータコレクション内の各試料に与えられ、列Aの下に入力され、各サンプルが属する治療群は、列Bの入力分類子変数が設定され、 マッチしたように（v）の分類子ファイルは、形態計測プログラムにインポートされている識別子によって選択されたデータセットのために。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52062/52062fig5highres.jpg" target="_blank">の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください</a>この図。 <img alt="図6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52062/52062fig6highres.jpg" width="500" /> 形態計測ソフトウェア6.統計解析図。 （A）の主成分分析（PCA）は、（i）PCAはバリエーションタブから選択される。 （ⅱ）プロクラステスのランドマークの最初の二つの主成分は、PCのスコア ] タブで散布として表示されます。 （ⅲ）ポップアップメニューがプロットスペースで育てている。このメニューは、互いに（赤矢印）に対してプロットされている主要なコンポーネントを変更し、（青色で強調）のデータ点を色付けするために使用される。 （iv）のデータ点は、ポップアップメニューの分類子の変数に応じて着色される。各主成分によって捕獲分散の（v）の割合は、[結果 ] タブで表示されている。（B）の判別関数分析（DFA）（ⅰ）DFAは ​​、 比較タブから選択される。 （ii）のプロクラステス座標のデータセットは、DFAのために選択され、以前にアップロードされた分類器は、グループのために選択される。比較されるべき所望のグループが選択され、順列試験を実行している。 （ⅲ）DFA結果は、 形状差異タブにおけるベクトルマップとして表示されます。プロット空間内のポップアップメニューは画像を正しく配向するために使用することができる。 （iv）は、ポップアップメニューの設定スケールファクタタブを選択することによって、スケール係数の符号を変化させることができる。 （v）は、ベクトルマップは、ベクトルマップのポップアップメニューで、 グラフの種類を変更して選択して、グリッド線の所望の数の変換グリッドに変更される。 （vi）のマハラノビスとプロクラステス距離と対応するp値は、[結果 ] タブの下で見ている。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52062/52062fig6highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <imgALT = &quot;図7&quot; FO：コンテンツ幅= &quot;5インチ&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 52062 / 52062fig7highres.jpg&quot;幅= &quot;500&quot; /&gt; コントロールの7.口腔顔面分析図およびRARは、処理された胚を阻害した。 （A）は、（i、ii）は、コントロールの代表的な画像。スケールバー=270μmで。 （III、IV）胚は、RAR阻害剤、BMS-453の1μMの濃度で処理した。スケールバー=260μmで。 （I、III）の景色を正面。口の開口部は赤い点に概説されている。 （II、IV）サイドビュー。 CG：セメント腺コントロールの（B）従来の口腔顔面寸法（黒）と処理剤（青）の胚。 mm単位ミリメートル（ii）の歯幅（i）において、鼻の長さ、（iii）の顔の高さ、mm単位（iv）の口の幅、mm単位（v）の口の真円度、方程式を用いたImageJにおいて決定無単位数： （4 &#8197; × &#8197; [エリア]）/（π &#8197; × &#8197; [長径] 2）。mm単位（VI）口腔顔面領域に、 <sup&gt; 2。不等分散を仮定しスチューデントのT検定によって決定されるアスタリスクは有意性を示す。 α&lt;0.05。（C）主成分分析。コントロールは、黒およびRAR阻害剤治療胚である青色である。黒い矢印は、異常値を示している。 PC1 = 73.63パーセント、PC2 = 9.56パーセント（D）変換グリッドに加えて、プロクラステス距離およびp値を表示する判別分析。ベクトルのクローズドサークルエンドは、RAR阻害剤治療胚におけるランドマークの位置である。ベクトルの行の終わりには、コントロールにおけるランドマークの位置です。黒い矢印は、鼻のランドマークのシフトを示している。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52062/52062fig7highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

アフリカツメガエル胚の顔面サイズおよび形状を定量化する方法が開発されている。このプロトコルでは、従来の大きさの測定は、口腔顔面開発や欠陥のより高度な分析を可能にするために、幾何学的形態計測と組み合わされる。

口腔顔面表現型の定量化で<em&gt;アフリカツメガエル</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

quantification-of-orofacial-phenotypes-in-xenopus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

9.7K ビュー.  Virginia Commonwealth University.  アフリカツメガエル胚の顔面サイズおよび形状を定量化する方法が開発されている。このプロトコルでは、従来の大きさの測定は、口腔顔面開発や欠陥のより高度な分析を可能にするために、幾何学的形態計測と組み合わされる。 

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In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

分別アフリカツメガエルの卵抽出を用いたin vitro核アセンブリで

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

生物学

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

アフリカツメガエルの卵母細胞で発現イオンチャネルのパッチクランプ記録

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

アフリカツメガエル卵母細胞のマイクロインジェクション

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

可視化RNAの局在にアフリカツメガエル卵母細胞

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

電離放射線への応答でγH2AX病巣の定量化

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic development 1, 2. One of the signaling pathways involved in this regulation is the Wnt pathway, which is used many times during embryogenesis and critical for human disease3, 4, 5. Multiple molecular components of this pathway coordinately regulate signaling in a spatially-restricted manner, but the underlying mechanisms are not fully understood. Xenopus embryonic epithelial cells is an excellent system to study subcellular localization of various signaling proteins. Fluorescent fusion proteins are expressed in Xenopus embryos by RNA microinjection, ectodermal explants are prepared and protein localization is evaluated by epifluorescence. In this experimental protocol we describe how subcellular localization of Diversin, a cytoplasmic protein that has been implicated in signaling and cell polarity determination6, 7 is visualized in Xenopus ectodermal cells to study Wnt signal transduction8. Coexpression of a Wnt ligand or a Frizzled receptor alters the distribution of Diversin fused with red fluorescent protein, RFP, and recruits it to the cell membrane in a polarized fashion 8, 9. This ex vivo protocol should be a useful addition to in vitro studies of cultured mammalian cells, in which spatial control of signaling differs from that of the intact tissue and is much more difficult to analyze.

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Xenopus embryonic ectoderm has become an attractive model for studies of cell polarity. An assay is described, in which subcellular distribution of fluorescent proteins is assessed in ectoderm cells. This protocol will help address questions related to spatial control of signaling.

の蛍光タンパク質の偏転アフリカツメガエルWntシグナルへの対応に>外胚葉

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

の後胚表現型を識別するためのRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

顔面移植<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

ザ·<em&gt;アフリカツメガエル</em蛍光測定で&gt;卵母細胞のカットオープンワセリンギャップ電圧クランプ法

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...