私たちは親切に、それぞれ、抗Sox3および抗MYT1抗体を提供するためにコロラド大学ボールダー校教授マイケルKlymkowskyとマンチェスター大学で教授ナンシーPapalopuluに感謝します。私たちは、このプロトコルを開発する上で彼らの洞察に満ちた提案をPapalopuluラボのメンバーに感謝します。この作品は、SZとJLには、2つのヒーリング財団Studentships、そ​​れぞれヒーリング財団からSZ / EAおよびJL / EAへの2つのプロジェクト助成金、EAへのウェルカムトラストから一つのプログラムの助成金（WT082450MA）、および1制度の戦略的支援の助成金によってサポートされていましたウェルカム・トラスト[097820 / Z / 11 / Z]から。

<ol>
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著者らは、開示することは何もありません。

ここでは、 アフリカツメガエル胚における一次神経新生を可視化するための便利で効率的な方法を示しています。この方法は、細胞型特異的マーカーを用いて、神経幹細胞および分化した初代ニューロンを含む神経細胞の異なる種類の評価を可能にします。 プロトコルは、再現性の非常に高いレベルで一般的に堅牢です。前孵化段階にある胚（ すなわち 、最大28のステージに）、これは胚が完全に固定する前に、真っすぐになることができますように、我々は手動で固定前に卵黄膜を除去することをお勧めします。 （孵化する前に）比較的早い段階で胚を収集する際に曲がった胚が装着室内部に所望の向きに配置することが極めて困難であるため、これは特に重要です。 MEMFAまたはPFA固定、したがって、追加の抗原回復ステップは、このプロトコルには必要ありません後に我々は、免疫原性の損失を経験していません。また、この免疫染色の手順は、in situハイブリダイゼーション発色/蛍光からのサンプルで実施することができます。このようなシナリオでは、in situハイブリダイゼーションプロトコルの間にプロテアーゼK処理工程を省略することをお勧めします。蛍光/発色基質反応の後、試料を、TBSで洗浄することができ、MEMFA / PFA固定したサンプルと同様に魚ゼラチン溶液に包埋しました。蛍光in situハイブリダイゼーションは、後免疫蛍光染色と一緒に画像化される場合、サンプルバイアルをアルミホイルでバイアルを包むことによって光から保護することができます。 いくつかのケースでは、胚は、ゼラチン浸透後過度に収縮することができます。これは、おそらくどちらかが不十分な固定または不十分なTBS-トリトン抽出によって引き起こされます。胚は4℃で少なくとも2〜3時間、好ましくは一晩PFA / MEMFAで修正されていることを確認してください。問題が解決しない場合は、1時間、3にTBS-トリトンの洗浄時間を増加させます。 クライオ切断面の間に魚ゼラチンの異なるバッチは、異なる特性を有するように寧、サンプルブロックの剛性が変化してもよいです。この問題は、部分的にミクロトームの温度を調整することによって補償することができます。より低い温度は、サンプルブロックがセクションにくっきりと困難になるしかし、過度の低温下で「硬い」のサンプルブロックになります。各切片の前に（胚なしモックサンプルブロックを使用して）いくつかの微調整や練習は、特に貴重なサンプルを上の使用前に有益であり得ます。 切片中に一般的に遭遇する問題は、時々厚のガラス板上に固執するのではなくスチールステージ上に平らに滞在する傾向が薄い部分です。これは、常に連続的な切削プロセスを中断するので、特に破壊することができます。セクション室と（特に）厚のガラス板が機械およびoに十分な寒さ、または過度の静電気されていない。このような例は、通常、二つの理由のいずれかによって引き起こされます特に乾燥した天候でperator、。前者はセクション室の温度を下げ、余分な時間（おそらく一晩）内のガラス板を残すことによって解決することができます。かつ適切クライオスタットを接地することにより、後者。金属タップまたは金属製の同様の水配管システムにクライオスタットの金属面に接続すると、静電気を放出するための代替方法することができます。各使用後、厚いガラス板は、（そのような食器用洗剤など）、非腐食性の洗剤でよく洗浄しなければならない超純水によりリンスし、純粋なエタノールを噴霧し、損傷から表面及びエッジを保護するためにタオル紙に包まれました。 プロトコルに記載された抗体は、一般的に特異的であり、我々はほとんど非特異的吸着または高いバックグラウンドシグナルが発生しません。すべき（血清中のふわふわ沈殿の形成により可視化）、ブロッキング剤としての過度の熱不活性化を熱不活性化ヤギ/子羊血清を使用している場合、ことに留意すべきですこの沈殿剤は、二次抗体に非常に魅力的であり、高いバックグラウンドのソースに貢献するかもしれないとして避けるこ​​と。 ことが可能であり、時には同時に神経細胞の異なる集団を可視化するために二重染色を行うために、所望します。このような二重染色が可能であり、一般的に以下の組み合わせで満足のいく結果が得られます。Sox3 / N-浴槽またはMYT1 / N-浴槽。しかし、Sox3およびMYT1の二重染色は、2つの抗体がウサギの起源からの両方であるという事実によって複雑になります。私たちは、おそらく二次抗体からの信号増幅の不足のために、しかし、満足な結果が観察されなかったいくつかの抗体の直接標識キットを、（低信号対雑音レベル）を試験しています。この問題を回避する1つの可能なアプローチは、以下に説明するように、 アフリカツメガエルにおけるトランスジェニック系統を上げることです。 このプロトコルの主な制限の一つは、このプロトコルは十分にディできるが、ということです神経細胞のstinguish二つの主なプールは、すなわち、Sox3を発現する神経幹細胞プール及びMYT1発現する分化した神経細胞は、分化した神経細胞の異なる亜集団を明らかにする能力を欠きます。含む、しかし、一次運動ニューロン、介在ニューロン、及び感覚ニューロンに限定されるものではなく、そのようなサブ集団は、通常、それらの差次的に発現マーカー遺伝子28-30によって特徴付けられます。上記のように、 アフリカツメガエル胚における抗体ベースの免疫蛍光検出方法と組み合わせてin situハイブリダイゼーション多色の開発における最近の進歩は、潜在的な調査31分化したニューロンのこれらのサブ集団を明らかにするためにギャップを埋めることができます。あるいは、マウスモデルで実証されているように、また、アフリカツメガエルにおいて、異なる細胞集団を区別するために細胞型特異的抗体のより包括的なセットを高めることが望ましいであろう。 それはこのメソッドへの追加として、そのような多光子顕微鏡、3D再構成、およびセグメンテーションなどの光学イメージングおよび画像解析の最近の進歩は、また、 アフリカツメガエル卵母細胞のより包括的な観測を実現するだけでなく、ために初期評価の後に適用することができる、ことを言及も価値があります特に32,33を設定するライブ下の初期胚、。したがって、増殖、分化、および生きた動物における神経細胞の移動を追跡するためには、初期のアフリカツメガエルにおけるこのような細胞集団の生の観察を可能にするために細胞型特異的プロモーターによって駆動される蛍光タンパク質を保有一つ以上のトランスジェニック系統を確立することが望まれるであろう胚。 X.の確立tauGFPとそのアプリケーションを駆動する神経特異的βチューブリンプロモーターとツメガエルのラインが良い例23,34を提供してきました。脊椎動物35-37を特徴sox3とMYT1の両方の完全なプロモーター配列と、それはshのですアフリカツメガエルのコミュニティと一次神経形成研究のより一般的なフィールドの両方に広く貢献すべきであるアフリカツメガエルにおける追加のトランスジェニック系統を確立することは比較的容易であることウルド。

脊椎動物では、中枢神経系の開発は、いくつかの独特まだ連続した段階を含みます。最初のステップは、ナイーブ外胚葉細胞は、神経運命ではなく、表皮の運命に向かって指定されている神経誘導、です。いくつかの相互接続さ調節機構は、 アフリカツメガエルおよび他のモデル系1,2のこの段階の間に関与しています。このプロセスは、主に、コーディン、ノギンおよびフォリスタチン3-7として基本となる中胚葉によって産生される分泌因子によって調整されています。神経誘導した後、神経前駆細胞のサブセットは、細胞周期を終了し、一次神経新生と呼ばれるプロセスで分化し始めます。すべての神経前駆体は、この時点では区別されません。残りの神経前駆細胞は、それによって開発を通して、および成人期に中枢神経系の継続的な成長のために必要な幹細胞のプールを維持し、増殖し続けます。 これらの広報神経前駆細胞をoliferatingはSRY（性決定領域Y）-box 3（sox3）遺伝子8-11の発現によって特徴付けられます。細胞の他の集団、出口細胞周期および分化した運命にコミットするには、分化の遺伝子マーカー、 チューブリン、ベータ2BクラスのIIb（tubb2b、N- 浴槽 ）とミエリン転写因子1（MYT1）の発現により同定されます12-14。このような分化した神経細胞は、最終的には神経管15-17内の異なる領域に位置し、モーター、間、および感覚ニューロンを含むがこれらに限定され、ではないが、ニューロンの異なるカテゴリを生じます。 かなりの努力が前方神経外胚葉でイベントを決定するパターニングと運命を支配する調節機構を解明することに専念してきたが、あまり注目は、以下の発生神経性のイベントを調査してなされたものです初期のパターニング段階。実際に、シグナル伝達、転写の規制だけでなく、翻訳後修飾は、すべての神経新生18-20中の両方のタイミングおよび系統仕様を制御し、この後の段階に関与しています。これらのメカニズムへのさらなる調査が簡単に視覚化し、神経細胞の異なる集団を区別するために信頼性の高い方法を必要とします。 、Sox3、MYT1、及びN-タブを含む上記神経マーカーは、従って、神経分化21-23の基礎となるメカニズムを明らかにするために必要な基礎を提供し、これらの異なる細胞集団を同定するための手段を提供することができます。 神経細胞集団の特異的標識は、他のモデル生物で実証されているが、比較的少数の研究は、この点において最大限にアフリカツメガエル系を利用しています。これは主に、確実に、様々なneurを識別互換性のある抗体の不足に起因しています神経管でonal細胞集団。ここでは、 アフリカツメガエルにおける一次神経発生を調査するための堅牢かつ便利な手法を提供する免疫染色を介して初期のアフリカツメガエル胚で神経分化を可視化する方法について説明します。このプロトコルは、ステージ26とステージ45との間にアフリカツメガエルの中枢神経系の早期開発に興味を持って研究者のための十分な指針を与える必要があります。

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		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">gentamicin&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G1397</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tris-HCl&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tris-base</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NaCl&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">MgSO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">746452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">CaCl2</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">793639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MOPS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">RDD003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EGTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">37% formaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sucrose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Base Mould Disposable 15Mm X 15Mm X 5Mm Simport</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td>EMB-200-015A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Base Mould Disposable 7Mm X 7Mm X 5Mm Simport</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td>EMB-200-010K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost Plus slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Freezing Medium (OCT)</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td align="right">14020108926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:71px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:119px;">CM3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gloves</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dry Ice</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;85-90&#176;C Heat block</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PAP pen</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetone, analytical grade</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Staining jar with slide racks</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;">Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">anti-acetylated tubulin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-mouse IgG (H+L), F(ab&#39;)2&#160;Fragment (Alexa Fluor&#174;&#160;488 Conjugate)</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signaling</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab&#39;)2&#160;Fragment (Alexa Fluor&#174;&#160;555 Conjugate)</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signaling</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor&#174; 647 Phalloidin</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signaling</td>
			<td align="right" style="width:119px;">8940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signaling</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing primary neurogenesis in xenopus embryos using immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

代表的な結果は、異なる抗体（ 図4）で染色し、異なるレベル、すなわち前脳、中脳、後脳、脊髄、でステージ30 アフリカツメガエル胚の断面を示しています。前述したように、分化した初代神経細胞が外側に移動して、神経管の限界層（基底層）の近くに見つけMYT1標識ながら、神経前駆細胞集団は、神経管の内腔の近くに位置しSox3標識。抗アセチル - チューブリンは、全体の神経管の中に観察することができる分化したニューロンにおける軸索を、ラベルを付けます。 側特異的遺伝子のノックダウンまたは過剰発現は、特定の遺伝子の発現を調節する神経細胞の成長および分化を妨害するかどうかを評価するための神経生物学で広く使用される方法です。このような場合には、モルホリノ（MOS）またはDNA構築物（単数または複数）のいずれかのプロ搬送します<html> moter駆動型遺伝子は、2細胞期23における2つの割球の中に注入されます。あるいは、それらは、ノックダウンまたは過剰発現所望の遺伝子（単数または複数）27の結果となる電気穿孔に続く脳室に注入することができます。どちらの場合も、効果は、未処理の内部コントロールとして、胚の反対側を作り、胚の片側に制限さ​​れます。 固定、切片、および免疫染色した後、遺伝子ノックダウン/過剰発現の影響をカウントし、胚の両側に異なる集団の細胞数を比較することによって定量化されます。いくつかの胚からこれらのデータを蓄積し、統計分析を行うことができます。当社の代表的な結果では、何の摂動は、胚では行いませんでした。遺伝子摂動と異なる神経細胞集団に対する効果の例は、参考文献20,23に記載されています。 トン &quot;FO：キープtogether.withinページ=&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig1.jpg" /> 図1：セクションの金型における胚の配置及び向き （A）取り付けアセンブリを示す漫画の描写は、トレイは、日付、ステージ、および胚の向きで標識されています注意してください。 （B）取り付けアセンブリの自然な外観を示すイメージ。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53949/53949fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig2.jpg" /> 図2：サンプルの保持ディスク上のゼラチンブロックの向きや位置 （A）節ブロックアセンブリを示す漫画の描写、胚は「ヘッドアップ」位置とゼラチンブロックがしっかりと固定されているOであることに注意してください。ベースで組織凍結培地による試料保持ディスクNTO（図2B参照）。 （B）節ブロックアセンブリの自然な外観を示す画像は、ゼラチンブロックと試料保持ディスクとの間の組織凍結培地の蓄積に注意してください。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53949/53949fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig3.jpg" /> 図3：セクション室の連続切片 （A）のモデル。サンプル保持ディスクは、胚側が上を向いている位置に回転し、固定してください。数（6-10）のセクションの後、連続するセクションのタイルの長いストリップを穏やかに細かいブラシを使用してブレード（青）から分離され、その後、保持板上に90°回転しました。その後、室内温度正に帯電したスライドですしっかりと下に向けセクションストリップに押し付け、すぐに集め、完成ストリップまで上昇。 （b）に示すように、通常は、各スライドは、ストリップの2本の平行線を収容することができます。鉛筆を使用して、スライドラベルに詳細な記録を作成することを忘れないでください。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53949/53949fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig4.jpg" /> 図4：ステージ30 X のクロスセクション 神経組織、20Xにオタマジャクシと染色を ツメガエル 。 アフリカツメガエルのオタマジャクシのセクション平面の相対的な位置（前脳、中脳、後脳、脊髄）を示す（A）回路図。 （B）抗Sox3（赤）で染色した断面を対応する、抗アセチル化チューブリン（グリーn）とDAPI（青）、相対的な神経幹細胞プールの位置ならびに神経管内ニューロフィラメントを示します。神経管中で分化した初代ニューロンの相対的な位置を示す抗MYT1（赤）およびDAPI（青）で染色した断面を、対応する（C）。スケールバー=20μmである。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53949/53949fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

この記事では、切片で免疫蛍光染色を用いて、 アフリカツメガエル胚の中枢神経系における異なる神経細胞集団を可視化するための便利で迅速な方法を提示します。

でプライマリ神経発生を評価します<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚用いた免疫染色

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

9.5K ビュー.  University of Manchester. この記事では、切片で免疫蛍光染色を用いて、 アフリカツメガエル胚の中枢神経系における異なる神経細胞集団を可視化するための便利で迅速な方法を提示します。 

ビデオ: Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

からの神経外植文化<em&gt;アフリカツメガエル</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

神経科学

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

神経変性表現型を評価する<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;クライミングアッセイによりドーパミン作動性ニューロンと脳全体の免疫染色

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

焦点放射線阻害と大人の視床下部ニューロン新生の機能的な尋問

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response is a vision-based, reflexive behavior that has been observed in all vertebrates tested. Tadpole eyes are small so the tail flip response was used as alternative measure, which requires a trained technician to record the subtle response. We developed an alternative behavior assay based on the fact that tadpoles prefer to swim on the white side of a tank when placed in a tank with both black and white sides. The assay presented here is an inexpensive, simple alternative that creates a response that is easily measured. The setup consists of a tripod, webcam and nested testing tanks, readily available in most Xenopus laboratories. This article includes a movie showing the behavior of tadpoles, before and after severing the optic nerve. In order to test the function of one eye, we also include representative results of a tadpole in which each eye underwent retinal axotomy on consecutive days. Future studies could develop an automated version of this assay for testing the vision of many tadpoles at once.

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Xenopus laevis tadpoles prefer swimming on the white side of a black/white tank. This behavior is guided by their vision. Based on this behavior, we present a simple assay to test the visual function of tadpoles.

テスト視機能のための簡単​​な行動アッセイ<em&gt;アフリカツメガエル</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

神経細胞死とマウス プライマリ小脳顆粒ニューロンの変性をモデリング

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Thy1を用いた一次体性感覚野における神経活動のイメージング-GCaMP6s トランスジェニック マウス

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral tissues. The hypothalamus in the central nervous system (CNS) is the control center for energy and insulin signal response regulation. Chronic inflammation in peripheral tissues and imbalances of certain chemokines (such as CCL5, TNF&#945;, and IL-6) contribute to diabetes and obesity. However, the functional mechanism(s) connecting chemokines and hypothalamic insulin signal regulation still remain unclear.
In vitro primary neuron culture models are convenient and simple models which can be used to investigate insulin signal regulation in hypothalamic neurons. In this study, we introduced exogeneous GLUT4 protein conjugated with GFP (GFP-GLUT4) into primary hypothalamic neurons to track GLUT4 membrane translocation upon insulin stimulation. Time-lapse images of GFP-GLUT4 protein trafficking were recorded by deconvolution microscopy, which allowed users to generate high-speed, high-resolution images without damaging the neurons significantly while conducting the experiment. The contribution of CCR5 in insulin regulated GLUT4 translocation was observed in CCR5 deficient hypothalamic neurons, which were isolated and cultured from CCR5 knockout mice. Our results demonstrated that the GLUT4 membrane translocation efficiency was reduced in CCR5 deficient hypothalamic neurons after insulin stimulation.

This protocol describes a technique for observation of real-time Green Fluorescence Protein (GFP) tagged Glucose Transporter 4 (GLUT4) protein trafficking upon insulin stimulation and characterization of the biological role of CCR5 in the insulin&#8211;GLUT4 signaling pathway with Deconvolution Microscopy.

GLUT4 タンパク質デコンボリューション顕微鏡を用いたマウス一次視床下部ニューロンにおける人身売買のライブ映像

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded forebrain neuroepithelium is not amenable to wholemount analysis to examine organ-wide neurogenesis patterns. Moreover, defining the mechanisms of forebrain neurogenesis is not necessarily predictive of neurogenesis in other parts of the brain; for example, due to the presence of forebrain-specific progenitor subtypes. The mouse hindbrain provides an alternative model for studying embryonic neurogenesis that is amenable to wholemount analysis, as well as tissue sections to observe the spatiotemporal distribution and behavior of neural progenitors. Moreover, it is easily dissected for other downstream applications, such as cell isolation or molecular biology analysis. As the mouse hindbrain can be readily analyzed in the vast number of cell lineage reporter and mutant mouse strains that have become available, it offers a powerful model for studying the cellular and molecular mechanisms of developmental neurogenesis in a mammalian organism. Here, we present a simple and quick method to use the mouse embryo hindbrain for analyzing mammalian neural progenitor cell (NPC) behavior in wholemount preparations and tissue sections.

This article demonstrates how the mouse embryonic hindbrain can be used as a model for studying developmental neurogenesis in both whole organ and tissue section preparations.

萌芽期の神経を研究するためのモデルとしてのマウス脳

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

準備やアフリカツメガエルの視蓋ニューロンの全体セル パッチ ・ クランプ記録のためのプロトコル

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of oligodendroglia as well as the biology of demyelinating diseases such as multiple sclerosis and Pelizaeus-Merzbacher-like disease (PMLD). Here, we present a simple and efficient selection method for the immunomagnetic isolation of stage three O4+ preoligodendrocytes cells from neonatal mice pups. Since immature OL constitute more than 80% of the rodent-brain white matter at postnatal day 7 (P7) this isolation method not only ensures high cellular yield, but also the specific isolation of OLs already committed to the oligodendroglial lineage, decreasing the possibility of isolating contaminating cells such as astrocytes and other cells from the mouse brain. This method is a modification of the techniques reported previously, and provides oligodendrocyte preparation purity above 80% in about 4 h.

We describe the immunomagnetic isolation of primary mouse oligodendrocytes, which allows the rapid and specific isolation of the cells for in vitro culture.