Fondi di start-up di A. Dickinson da VCU sostenuto questo lavoro. Gli autori desiderano ringraziare Dan Nacu per il suo talento artistico nel creare la rappresentazione schematica.

<ol>
	<li>Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleft+lip+and+palate.">Cleft lip and palate.</a> Lancet. 374, 1773-1785 (2009).</li><li>Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Median+facial+clefts+in+Xenopus+laevis:+roles+of+retinoic+acid+signaling+and+homeobox+genes.">Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes.</a> Dev Biol. 365, 229-240 (2012).</li><li>Kennedy, A. E., Dickinson, A. 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J., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+primary+mouth+in+Xenopus+laevis.">Development of the primary mouth in Xenopus laevis.</a> Dev Biol. 295, 700-713 (2006).</li><li>Dickinson, A. J., Sive, H. 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S., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalized+shape+and+location+of+perturbed+craniofacial+structures+in+the+Xenopus+tadpole+reveal+an+innate+ability+to+achieve+correct+morphology.">Normalized shape and location of perturbed craniofacial structures in the Xenopus tadpole reveal an innate ability to achieve correct morphology.</a> Dev Dyn. 241, 863-878 (2012).</li><li>Bugaighis, I., Mattick, C. R., Tiddeman, B., Hobson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Facial+Morphometry+in+Children+with+Oral+Clefts.">3D Facial Morphometry in Children with Oral Clefts.</a> Cleft Palate Craniofac J. , (2013).</li><li>Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+alcohol+exposure+alters+the+patterns+of+facial+asymmetry.">Prenatal alcohol exposure alters the patterns of facial asymmetry.</a> Alcohol. 44, 649-657 (2010).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+cleft+palate+in+mice+with+a+targeted+mutation+of+the+LIM+homeobox+gene+lhx8.">Isolated cleft palate in mice with a targeted mutation of the LIM homeobox gene lhx8.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 15002-15006 (1999).</li><li>Allam, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spectrum+of+median+craniofacial+dysplasia.">The spectrum of median craniofacial dysplasia.</a> Plast Reconstr Surg. , 812-821 (2011).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R., Harlard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2000).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+eggs+from+Xenopus+laevis+females.">Obtaining eggs from Xenopus laevis females.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , (1967).</li><li>Nieuwkoop, P. D. a. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metamorphosis. , (1994).</li><li>Abdi, H., Williams, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principal+Component+Analysis.">Principal Component Analysis.</a> WIREs Computational Statistics. 2, (2010).</li><li>Hill, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> P. STATISTICS: Methods and Applications. , (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Xenopus laevis è diventato uno strumento utile per sezionare i meccanismi di sviluppo di sviluppo oro-facciale sottostante; tuttavia, attualmente non esistono protocolli che descrivono dimensioni e la forma cambiamenti di questa regione in rane. Il metodo qui descritto contribuirà in modo significativo al settore dello sviluppo oro-facciale, consentendo per la più rigorosa quantificazione dei fenotipi orofacciali in Xenopus e altri vertebrati. Il primo aspetto, più critico della corretta esecuzione di questo protocollo è la capacità di misurare le dimensioni del viso e determinare il posizionamento di riferimento sia accurato e riproducibile. A tal fine, è fondamentale che facce embrionali fotografare allo stesso angolo, la direzione e l&#39;ingrandimento. Particolare cura deve essere presa per ottenere misurazioni precise della lunghezza del muso, in quanto è difficile da manipolare embrioni lateralmente e ottenere il posizionamento coerente. Avere una sola persona di eseguire tutte le misurazioni sulle sgiorno ame minimizza questo tipo di errore, massimizzando la riproducibilità dei risultati. Il secondo aspetto più critico di garantire ottimi risultati è la riduzione della variabilità inutili, come le differenze di sviluppo o background genetico. Questo è particolarmente importante quando si valuta la significatività statistica tra i difetti sottili. Embrioni, quindi, devono essere nella stessa fase quando trattati e fotografato. Inoltre, occorre prestare attenzione al fine di garantire i tassi di sviluppo sono equivalenti tra e tra i gruppi di trattamento. Per ridurre questi problemi con la variabilità, assicurarsi che tutti gli embrioni sono dagli stessi genitori e sono abbinati palco all&#39;inizio dell&#39;esperimento. Anche ridurre fonti esterne di variabilità quali diverse fonti di buffer e volumi, diverso numero di embrioni, e distribuzioni nelle piastre di coltura (per esempio, evitare affollamento). Un passo fondamentale nella valutazione delle variazioni di forma mediante morfometria geometrica è il alignment di punto di riferimento le coordinate via Procuste in forma. Con l&#39;applicazione di questo algoritmo matematico, alcuna informazione circa la dimensione o differenze di rotazione dell&#39;immagine viene rimossa. La matrice di covarianza successivamente generato determina le correlazioni non standardizzati di riferimento coordina tra tutti gli embrioni nel set di dati, su cui multivariata tecniche-statistica, come componente principale o una funzione discriminante analyses- possono essere eseguite. Una analisi delle componenti principali (PCA) riduce di un campione complesso per un insieme ridotto di variabili chiamate componenti principali 26. Rappresenta il primo componente per la maggior varianza all&#39;interno del set di prova, con ogni successiva componenti che rappresentano il resto. Tracciando le prime due componenti uno contro l&#39;altro software morfometrica utilizzando campioni, che sono del cluster più simili tra loro. In questo modo, PCA discrimina gruppi all&#39;interno di un insieme di esempio, e contemporaneamente determinare la variazione al loro interno. In some casi, i gruppi non possono essere chiaramente distinti l&#39;uno dall&#39;altro e si sovrappongono lungo uno o entrambi gli assi. In questo caso, è vantaggioso per tracciare altri componenti (per esempio, PC3) per rivelare caratteristiche sottili attraverso cui i gruppi sono discriminati. Questo è particolarmente rilevante quando la varianza totale è più uniformemente distribuito tra le prime variabili. La funzione discriminante analisi (DFA) di Procuste dati in forma determina se i campioni in un insieme di dati siano effettivamente discriminate in gruppi per le variabili continue che li definiscono. I campioni sono quindi classificati in gruppi prima dell&#39;analisi, e le variabili sono tradotti in componenti chiamati funzioni discriminanti per determinare la relazione statistica tra i gruppi 27. Prima di eseguire questa analisi, è importante indicare il numero di test di permutazione. Questi test di permutazione casuale di dati in modo tale che qualsiasi ipotesi circa la sua distribuzione sono ELIMINAted. Più iterazioni di test di permutazione aumentare la precisione del p-value. Quando visualizzate come una griglia di trasformazione, cambiamenti significativi nella posizione di riferimento tra i gruppi comparati sono visualizzati. Inoltre, il modello di deformazione della griglia rivela dove si verificano cambiamenti di forma. Lo svantaggio di questa analisi è che può essere utilizzato solo per il confronto dei due gruppi. Se ci sono tre o più gruppi in un fascicolo di prova per il confronto, è meglio eseguire un&#39;analisi variata canonica. Questo è simile a un DFA dal fatto di generare un valore p statistica; tuttavia, mostra cambiamenti che si verificano nel corso dell&#39;intero campione impostato in aggiunta a quelle che si verificano tra i singoli gruppi all&#39;interno di tale insieme. Il principale limite di questo protocollo quantificazione oro-facciale è che può essere applicato solo a dati bidimensionali. I nostri obiettivi futuri includono l&#39;utilizzo di TC o la microscopia confocale a sviluppare metodi simili per l&#39;analisi dei dati tridimensionali. D&#39;altronde,lavorare con le immagini bidimensionali è anche uno dei principali punti di forza di questo protocollo. Solo stereoscopes essenziali dotate di telecamere sono necessari per catturare le immagini del viso embrionale. Il OpenWare utilizzato per questa analisi di dati aumenta anche l&#39;accessibilità di questo metodo, riducendo il costo. Inoltre, una conoscenza avanzata delle immagini sofistica, analisi statistiche, o programmazione di computer non è necessario per estrarre risultati significativi e significativi dai dati. In realtà, questa tecnica è attualmente in fase insegnata come parte di un corso di laboratorio di laurea nel reparto VCU della biologia. In tal modo, il protocollo di quantificazione oro-facciale presentato qui è facile da imparare ed applicare in un breve periodo di tempo. Come una rappresentazione video, punti critici, come il posizionamento degli embrioni e la navigazione del software sono evidenziati al fine di garantire il protocollo può essere utilizzato con successo da anche gli studenti inesperti e ricercatori. In sintesi, questo protocollo fornirà una risorsa preziosaper la comunità di ricerca e come strumento didattico.

Tra i tipi più diffusi e devastanti di difetti alla nascita dell&#39;uomo sono quelli che riguardano la bocca e la faccia, come la schisi orofacciali 1. I bambini con strutture orofacciali malformati sottoposti a interventi chirurgici multipli per tutta la vita e lottano con malformazioni del viso, discorso, dell&#39;udito e problemi alimentari. Pertanto, facilitando nuove ricerche nello sviluppo cranio-oro-facciale ed è fondamentale per la prevenzione e il trattamento di questi tipi di difetti alla nascita negli esseri umani. Xenopus laevis è emerso come un nuovo strumento per sezionare i meccanismi che regolano lo sviluppo cranio-facciale (alcuni esempi includono 2,3,4 -11). Pertanto, un metodo quantitativo per analizzare dimensione e forma cambia durante lo sviluppo della testa e del viso di questa specie potrebbe essere molto potente 3. Qui vi presentiamo un tale metodo; Combinando le misurazioni tradizionali dimensioni con morfometria geometrica adattati da uno studio di Xenopus 12 </sup&gt; e un gran numero di studi che hanno analizzato forma del viso umano 13-15. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di permettere ai ricercatori di quantificare le dimensioni e le forme del viso per distinguere tra diversi fenotipi orofacciali durante lo sviluppo normale e anormale. Questa analisi consentirà una migliore differenziazione tra i difetti cranio-facciali sottili, come quelli derivanti da effetti sinergici di geni e / o fattori ambientali. Inoltre, questo metodo di quantificazione potrebbe anche rivelare anche lieve miglioramento o al salvataggio di un difetto oro-facciale. Questo rende quindi una guida utile per analizzare potenziali terapie. La combinazione di misurazioni facciali e morfometria geometrica che qui presentiamo consente un&#39;analisi statistica più completa di dimensioni e la forma della regione orofacciale di protocolli attuali che in gran parte utilizzano solo uno o l&#39;altro 15-18. Inoltre, presentiamo un modo semplice per valutare sia mediale e piani lateraliil volto senza bisogno di sofisticate apparecchiature di imaging tridimensionale utilizzata in studi attuali 13,19. Dimostriamo questo protocollo su Xenopus laevis embrioni trattati con un inibitore del recettore dell&#39;acido retinoico che induce lo sviluppo oro-facciale anormale e una mediana palatoschisi 2,3. La quantificazione delle dimensioni e la forma della regione oro-facciale in questi embrioni ha rivelato cambiamenti nella midface che è analogo per l&#39;uomo con crepacci palatali simili e modelli murini 20,21. Tuttavia, questo protocollo può essere utilizzato per valutare gli effetti di altri composti sullo sviluppo oro-facciale, quali sostanze naturali, erbicidi, o proteine ​​come i fattori di crescita. Inoltre, le dimensioni e la forma cambia orofacciali derivanti dalla perturbazione di espressione genica tramite la perdita o il guadagno di esperimenti di funzione (utilizzando Morpholinos antisenso o Crispers / Talens) possono essere quantificati con questo protocollo. Infine, abbiamo sviluppato questo metodo SPECIFICHElly per valutare la morfologia Xenopus; tuttavia, è facilmente modificato per l&#39;analisi di qualsiasi vertebrato. Altre applicazioni potrebbero anche includere l&#39;uso di questo protocollo per il confronto di specie strettamente collegate agli studi evolutivi o ecologici. Mentre l&#39;esempio forniamo qui utilizza questo protocollo per descrivere l&#39;analisi della regione oro-facciale, potrebbe facilmente essere modificato per l&#39;analisi di altre regioni, organi o strutture. Questo protocollo quantificazione oro-facciale diventerà una risorsa preziosa per la comunità di ricerca, così come un eccellente strumento didattico per gli studenti universitari come un video dimostrativo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="818">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:304px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:143px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:236px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>fitted with AxioCamICC1 camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 Inox forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile, disposable scalpel</td>
			<td>Sklar</td>
			<td>06-2015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">24-well plate</td>
			<td style="width:143px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">087721</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:304px;">Standard Disposable transfer pipettes</td>
			<td style="width:143px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">13-711-7M</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">150 mm X 15 mm Petri dishes</td>
			<td style="width:143px;">Falcon</td>
			<td style="width:136px;">351058</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Incubators</td>
			<td style="width:143px;">Ectotherm</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:236px;">set to 15C or 20C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:304px;">Modeling Clay</td>
			<td style="width:143px;">Premo, or other non-toxic modeling clay</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:236px;">in black or white</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Straight teasing needle</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">19010</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:304px;">Capillary Tubing (for needles)</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-1</td>
			<td style="width:236px;">Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber, 100 mm each</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:304px;">Needle Puller, Model P-97&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sutter Instrument Co,&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B</td>
			<td style="width:236px;">For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:304px;">Pipettemen</td>
			<td style="width:143px;">Gilson</td>
			<td style="width:136px;">F144802, F123600, F123602</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">BMS-453</td>
			<td style="width:143px;">Tocris</td>
			<td style="width:136px;">3409</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:304px;">DMSO</td>
			<td style="width:143px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:136px;">AB00435-01000</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Cysteine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">52-90-4</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Paraformaldehyde powder</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">158127</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:304px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:143px;">Falcom</td>
			<td style="width:136px;">353003, 351058</td>
			<td style="width:236px;">100 mm diameter and 150 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:143px;">VWR</td>
			<td>89125-170</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of orofacial phenotypes in xenopus

Xenopus è diventato uno strumento importante per sezionare i meccanismi che regolano lo sviluppo cranio-facciale e difetti. Un metodo per quantificare lo sviluppo oro-facciale consentirà un&#39;analisi più rigorosa dei fenotipi orofacciali su abrogazione con sostanze che possono geneticamente o molecolarmente manipolare l&#39;espressione genica e la funzione delle proteine. Utilizzando due immagini tridimensionali delle teste embrionali, si misurano le dimensioni-come tradizionali dimensioni come larghezza oro-facciale, altezza e Area-. Inoltre, una misura rotondità della apertura della bocca embrionale è usato per descrivere la forma della bocca. Morfometria geometrica di queste due immagini tridimensionali viene eseguita anche per fornire una visione più sofisticata di cambiamenti nella forma della regione oro-facciale. Luoghi di interesse sono assegnati a punti specifici della regione oro-facciale e le coordinate vengono creati. Una analisi delle componenti principio viene utilizzato per ridurre le coordinate punto di riferimento ai componenti principali che poi discriminano il trattamentogruppi. Questi risultati sono visualizzati sotto forma di un diagramma a dispersione in cui gli individui con forme oro-facciali simili si raggruppano. E &#39;utile anche per eseguire un&#39;analisi funzione discriminante, che mette a confronto statisticamente le posizioni dei punti di riferimento tra i due gruppi di trattamento. Questa analisi viene visualizzato su una griglia di trasformazione in cui i cambiamenti della posizione di riferimento sono visti come vettori. Una griglia viene sovrapposta questi vettori in modo che un modello di deformazione viene visualizzato per mostrare dove posizioni significative punto di riferimento sono cambiati. Cambia forma per l&#39;analisi della funzione discriminante si basano su una misura statistica, e quindi possono essere valutati da un p-value. Questa analisi è semplice e accessibile, che richiede solo uno stereoscopio e software freeware, e quindi sarà una risorsa per la ricerca e l&#39;insegnamento prezioso.

Qui, un&#39;analisi quantitativa di dimensioni oro-facciale e la forma è stata dimostrata per confrontare embrioni trattati con un inibitore del recettore dell&#39;acido retinoico (RAR inibitore) per controlli non trattati. Gli embrioni sono stati trattati con una concentrazione 1 mM di questo inibitore della sostanza chimica da fase 24 a 30 (26-35 HPF), sbiaditi, e fissati allo stadio 42 (82 HPF). Sono stati poi elaborati ed analizzati come descritto nel protocollo. I risultati sono dati originali, ma in linea con le osservazioni in precedenti pubblicazioni 2,3. Embrioni controllo sono stati trattati con il veicolo, DMSO, e sviluppati normalmente (Figura 7Ai, ii). Gli embrioni trattati con una concentrazione 1 mM di inibitore RAR hanno mostrato lieve restringimento del viso, anomalie degli occhi, e una bocca embrionale malformato apertura che aveva la forma più triangolare (Figura 7Aiii, iv). In primo luogo, le dimensioni tradizionali orofacciali sono stati misurati e sono riassunte nella Figura 7B. S<html> significato tatistical è stata determinata eseguendo test t di Student assumendo varianza disuguale tra inibitori embrioni trattati e controlli per ogni misurazione. Abbiamo scoperto che sia la lunghezza del muso e larghezza del dente erano significativamente diminuiti in RAR inibitori embrioni trattati rispetto ai controlli (p-value = 0,0062 e 0,0058, rispettivamente; Figura 7Bi, ii). Mentre altezza viso e la bocca rotondità sono state aumentate in modo significativo (p-value = 3,7772 x 10 -6, 1,4812 x 10 -7), larghezza della bocca era significativamente diminuito (p-value = 2,5175 x 10 -10; Figura 7Biii-v) .La risultati hanno mostrato alcuna differenza significativa nella zona oro-facciale globale tra i due gruppi (p = 0,3754 a valore; Figura 7Bvi). Questi dati mostrano che la perdita di segnale acido retinoico in un momento specifico in risultati di sviluppo in un muso più corto, leggero restringimento della regione midface, e malformazioni della apertura della bocca embrionale. nt &quot;&gt; Per fornire una visione sofisticata dei cambiamenti di forma della regione oro-facciale embrionale in risposta a segnali di riduzione dell&#39;acido retinoico, abbiamo prossima utilizzammo morfometrica geometrica analisi. Dopo l&#39;identificazione e l&#39;allineamento monumenti orofacciali utilizzando il software di analisi morfometrica, ci ha poi esaminato la varianza all&#39;interno di ogni gruppo tramite analisi delle componenti principali (PCA). Quando le prime due componenti principali sono state tracciate uno contro l&#39;altro, embrioni inibitore RAR trattati erano chiaramente distinti dai controlli lungo l&#39;asse PC1 (Figura 7c). Questo test ha anche mostrato i valori anomali in l&#39;impostazione del campione illustrato da due embrioni inibitori trattato che non cluster con il resto del gruppo (Figura 7C, frecce). Quindi, le differenze statistiche nella forma della regione oro-facciale tra RAR inibitori trattati gli embrioni ei controlli sono stati valutati e visualizzati eseguendo una funzione discriminante analisi (DFA). Il Procuste distanza bra i due gruppi era significativamente differente (distanza = 0,2665, p-value &lt;0,0001, Figura 7D), che indica un cambiamento di forma oro-facciale, quando la segnalazione acido retinoico è interrotto. Infatti, drammatici cambiamenti nella posizione dei punti di riferimento laterali della regione orofacciale indicano un restringimento della forma del viso corrispondente all&#39;altezza di inibitori embrioni trattati (Figura 7D). Inoltre, il leggero spostamento verso l&#39;esterno in posizione dei punti di riferimento nasali (Figura 7D, frecce) rivela l&#39;anomalia in posizione narice in questi embrioni che è coerente con la diminuzione conseguenza del muso. I cambiamenti di punti di riferimento che definiscono i bordi dell&#39;apertura della bocca cambiamenti di posizione mostrano che riflettono la formazione di una bocca a forma triangolare di apertura che è coerente con la fessura mediana riportato nei nostri precedenti studi 2,3. Oltre a turni vettore, il pattern deformazione della griglia trasformazione illustra anche cambiamenti di forma della oregione ofacial. Orditura nella regione midface è coerente con l&#39;ipoplasia midface e restringimento del viso globale visto in embrioni con segnali dell&#39;acido retinoico sono diminuiti (Figura 7D). I risultati dell&#39;analisi funzione discriminante (DFA) mostrano cambiamenti di forma che sono stati in linea con la nostra analisi qualitativa, così come rivelano alcune modifiche che non sono stati adeguatamente rilevati dalle sole misure tradizionali dimensioni. Ad esempio, mentre la zona oro-facciale non era significativamente differente tra controlli e inibitore trattata embrioni (Figura 7Bvi), la griglia trasformazione DFA rivelato cambiamenti drammatici in questa regione coerenti con il restringimento facciale visto in inibitori embrioni trattati (Figura 7A, D). Inoltre, la deformazione del modello e punto di riferimento turni di apertura della bocca, insieme con il cambiamento significativo che abbiamo visto in bocca rotondità, illustrano la malformazione della bocca di apertura in forma inibitore trattati Embryos. In sintesi, una combinazione di misurazioni tradizionali di dimensioni facciali e analisi morfometrica geometrica illustra i cambiamenti di forma e dimensioni della regione oro-facciale quando i segnali acido retinoico sono interrotti. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52062/52062fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Materiali richiesti. (A) Strumenti per l&#39;analisi dei dati. (I) 24-pozzetti, (ii) di serie pipetta usa e getta, (iii) Dumont # 5 pinze Inox, (iv) l&#39;argilla-foderato capsula di Petri, (v) prendere in giro dritto ago, (vi) strumento pipetta di vetro, (vii ) sterili, bisturi monouso. B) Preparazione del recipiente di terracotta rivestita (. (I) Un ago di presa in giro dritto viene utilizzata per tracciare linee orizzontali nella creta. (Ii) Uno strumento pipetta di vetro è usato per fare depressioni circolari lungo ogni riga. (Iii) Il piatto è pieno di PBT per l&#39;imaging. page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52062/52062fig2highres.jpg" width="300" /> Figura 2. Fecondazione in vitro e la cultura di uova di Xenopus. (A) A seguito di iniezione di HCG, adulto Xenopus laevis femmine sono indotte a deporre le uova. (B) Le uova sono raccolte in MBS alto sale, fecondati con testicoli estratti da un maschio, e colto con metodi standard. (C) Gli embrioni vengono trasferiti in un piatto da 24 pozzetti contenenti 0.1x MBS utilizzando uno standard, monouso pipetta di trasferimento. (D) una pipetta calibrata artificiale viene utilizzato per misurare 1 ml in un pozzo vuoto, e un marcatore viene utilizzato per delimitare questo livello all&#39;esterno di tutti i pozzetti contenenti embrioni (nel riquadro). 0.1x MBS viene aggiunto o tolto in modo che sia a livello con questo marchio. highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura 3. Preparazione di teste di embrioni per l&#39;imaging. (A) Diagramma delle due incisioni necessari per rimuovere le teste, linee nere continue. Barra della scala = 400 micron. (B) La prima incisione è fatta alla fine posteriore dell&#39;intestino per rimuovere la coda e rilascio della pressione dal bisturi. Scala bar = 400 micron. (C) La seconda incisione è fatta alla fine anteriore del budello, vicino al cuore, di tagliare completamente la testa. Barra della scala = 400 micron. (D) viste frontali di fila di teste di embrioni posizionati in argilla. Barra della scala = 650 micron. (E) vista laterale fila di posizione teste embrionali in argilla. Scala bar = 500 micron CG: ghiandola del cemento. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52062/52062fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Le misure di formato tradizionale di dimensioni orofacciali. (A) </strong&gt; larghezza Viso. Le frecce indicano i punti in cui la parte ventrale dell&#39;occhio incontra la periferia della faccia. La linea rossa è la larghezza del dente, misurata come la distanza tra questi punti. Linee Barra di scala = 210 micron. (B) Altezza faccia. Bianchi sono guide disegnate prima della misura sul bordo dorsale degli occhi e il bordo dorsale della ghiandola del cemento. Linea rossa è l&#39;altezza faccia, misurata come la distanza tra questi due guide sulla linea mediana della faccia. Barra di scala = 210 micron. (C) zona orofacciale. Righe bianche sono guide disegnati prima della misura. (A) il punto dove la guida inferiore incontra il bordo ventrale dell&#39;occhio sinistro. La linea rossa indica il tracciato intorno all&#39;occhio sinistro. (B) Il punto in cui il bordo dorsale dell&#39;occhio incontra la guida superiore. Linea blu mostra il confine dorsale zona oro-facciale, tracciata lungo la guida superiore al bordo dorsale degli occhi. (C) il punto dove la guida superiore incontra destra periferia facciale. GREEN LINE spettacoliil tracciato attorno l&#39;occhio destro. (D) Il punto in cui il bordo ventrale dell&#39;occhio destro incontra la guida inferiore. Linea gialla mostra di confine ventrale zona oro-facciale, tracciata lungo la guida in basso sul bordo dorsale della ghiandola del cemento. Barra di scala = 210 micron. (D) Lunghezza del muso. La linea bianca è il bordo anteriore dell&#39;occhio e viene disegnato come una guida prima della misura. La linea rossa è la lunghezza muso, misurata da questa linea al punto in cui il bordo dorsale della ghiandola cemento incontra la periferia laterale del volto. Barra di scala = 300 micron. Larghezza (E) Bocca. Le frecce sono i punti in cui si incontrano dorsale e ventrale labbra. La linea rossa è la larghezza della bocca, misurata come la distanza tra questi due punti. Barra di scala = 200 micron. (F) Bocca rotondità. Il perimetro dell&#39;apertura della bocca è tracciata e visualizzata in rosso. CG: ghiandola del cemento. Barra di scala = 200 micron. <img alt = &quot;Figura 5&quot; fo: content-width = src &quot;5in&quot; = &quot;/ files / ftp_upload / 52062 / 52062fig5highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 5. Acquisizione di punti di riferimento e preliminari per l&#39;analisi morfometrica geometrica. (A) Utilizzo di software di fotoritocco e di un foglio di calcolo di inserire punti di riferimento e le coordinate di cattura. (I) croci multicolori sono i punti di riferimento posti sulla immagine utilizzando lo strumento Aggiungi punti in ImageJ per rappresentare la forma della regione oro-facciale. (Ii) dati di interesse viene visualizzato utilizzando lo strumento di visualizzazione dei risultati. (Iii) dati Landmark viene copiato e incollato in un foglio di calcolo. Sopra la seconda colonna è un&#39;intestazione che identifica il numero di punti di riferimento e indicata con &quot;LM = 24&quot; (riquadro rosso). Sotto la seconda colonna di dati, il campione viene assegnato un nome univoco e indicata con &quot;ID = CON1&quot; (freccia rossa). Questo si ripete per tutte le immagini in un fascicolo di prova ed i dati vengono salvati come file di testo. (B) l&#39;analisi dei dati preliminari in un morfometrica softw geometricasono programma. (I) Il file di testo creato dal software di fotoritocco è importata nel programma morfometriche, MorphoJ, come un file TPS. File è indicato dalla freccia rossa. (Ii) Landmark quote di coordinate si allineato Procuste in forma con gli assi principali. Freccia rossa indica l&#39;esecuzione di allineamento. (Iii) Una matrice di covarianza di Procuste in forma punti di riferimento viene generato nel menu Preliminari. (Iv) Un file di classificatore viene creato in un foglio di calcolo. Colonna A e B sono date intestazioni &quot;ID&quot; e &quot;trattamento&quot;, rispettivamente. Dato a ogni campione nella raccolta dei dati di riferimento sono di ingresso del ID nella colonna A, e il gruppo di trattamento a cui appartiene ogni campione viene inserito nella colonna B. (v) Il file di classificatore viene importato nel programma morfometrica come un insieme variabile di classificatore e Matched dal Identificazione per il set di dati selezionato. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52062/52062fig5highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande</a>questa figura. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52062/52062fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. Analisi statistica nel software morfometrica. (A) Analisi delle Componenti Principali (PCA) (i) PCA è selezionata dalla scheda Variation. (Ii) Le prime due componenti principali punti di riferimento di Procuste vengono visualizzati come un grafico a dispersione nella scheda punteggi PC. (Iii) un menu pop-up viene portato nello spazio grafico. Questo menu viene utilizzato per modificare i componenti principali vengono riportati contro l&#39;altro (freccia rossa) e per colorare i punti dati (evidenziati in blu). (Iv) I punti dati sono colorati a seconda delle variabili classificatore nel menu di scelta rapida. (V) Percentuale della varianza catturata da ciascun componente principale viene visualizzato nella scheda Risultati. (B) Funzione Analisi discriminante (DFA) (i) DFA viene selezionato dalla scheda di confronto. (ii) Il set di dati di Procuste coordinate è selezionato per DFA, e classificatori precedentemente caricati vengono scelti per il raggruppamento. I gruppi desiderati da confrontare sono scelti e vengono eseguiti test di permutazione. (Iii) i risultati DFA vengono visualizzati come una mappa vettoriale nella scheda Forma differenza. Un menu a comparsa nello spazio di trama può essere utilizzato per orientare correttamente l&#39;immagine. (Iv) Selezionando la scheda Set Fattore di scala nel menu di scelta rapida, il segno del fattore di scala può essere cambiata. (V) La mappa vettoriale viene modificato in una griglia di trasformazione con il numero desiderato di linee della griglia scegliendo Cambiare il tipo di grafico nel menu di scelta rapida della mappa vettoriale. (Vi) Il Mahalanobis e Procuste distanze e relativi p-value vengono visualizzati nella scheda Risultati. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52062/52062fig6highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <imgalt = &quot;Figura 7&quot; fo: content-width = src &quot;5in&quot; = &quot;/ files / ftp_upload / 52062 / 52062fig7highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 7. Analisi Orofacial di controllo e RAR inibito trattati embrioni. (A) (I, II) Immagini rappresentative dei controlli. Bar scale = 270 micron. (Iii, iv) embrioni trattati con una concentrazione 1 mM di inibitore RAR, BMS-453. Bar scale = 260 micron. (I, iii) FRONTALE vista. Apertura della bocca è descritto nella puntini rossi. (ii, iv) delle viste laterali. cg:. ghiandola cemento (B) dimensioni orofacciali tradizionali di controllo (nero) e l&#39;inibitore trattati (blu) gli embrioni. (I) la lunghezza del muso, in mm (ii) larghezza del dente, in mm (iii) l&#39;altezza faccia, in mm (iv) larghezza della bocca, in mm (v) la bocca morbidezza, un numero di unità-meno determinata ImageJ usando l&#39;equazione: (4 &#8197; × &#8197; [Area]) / (π &#8197; × &#8197; [Asse principale] 2). (Vi) zona Orofacial, in mm <sup&gt; 2. Gli asterischi indicano significatività come determinato da T-test di Student assumendo varianza disuguale. α &lt;0.05. (C) Analisi delle Componenti Principali. I controlli sono in trattamento con inibitori embrioni in bianco e RAR sono in blu. Frecce nere indicano valori anomali. PC1 = 73.63%, PC2 = 9,56%. (D) Analisi discriminante visualizzando la distanza Procuste e p-value, oltre a una griglia trasformazione. Fine ristretta cerchia di vettore è posizione di punto di riferimento a inibitori RAR embrioni trattati. L&#39;estremità della linea del vettore è la posizione di riferimento nei controlli. Frecce nere indicano cambiamento di punti di riferimento nasali. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52062/52062fig7highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

È stato sviluppato un metodo per quantificare l&#39;entità oro-facciale e la forma di Xenopus laevis embrioni. In questo protocollo, misurazioni tradizionali sono unite a morfometria geometrica per consentire analisi più sofisticate di sviluppo oro-facciale e difetti.

Quantificazione di orofacciale fenotipi in<em&gt; Xenopus</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

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Nanyang Technological University

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Biology

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

9.7K Views.  Virginia Commonwealth University.  È stato sviluppato un metodo per quantificare l'entità oro-facciale e la forma di Xenopus laevis embrioni. In questo protocollo, misurazioni tradizionali sono unite a morfometria geometrica per consentire analisi più sofisticate di sviluppo oro-facciale e difetti. 

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In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

In Assemblea in vitro Nucleari Utilizzando frazionato Estratti Egg Xenopus

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Ricerca

Biologia

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Patch di registrazione pinza dei canali ionici Espressa in ovociti di Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microiniezione degli ovociti di Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualizzazione RNA localizzazione in Xenopus Gli oociti

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Quantificazione dei γH2AX Foci in risposta alle radiazioni ionizzanti

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic development 1, 2. One of the signaling pathways involved in this regulation is the Wnt pathway, which is used many times during embryogenesis and critical for human disease3, 4, 5. Multiple molecular components of this pathway coordinately regulate signaling in a spatially-restricted manner, but the underlying mechanisms are not fully understood. Xenopus embryonic epithelial cells is an excellent system to study subcellular localization of various signaling proteins. Fluorescent fusion proteins are expressed in Xenopus embryos by RNA microinjection, ectodermal explants are prepared and protein localization is evaluated by epifluorescence. In this experimental protocol we describe how subcellular localization of Diversin, a cytoplasmic protein that has been implicated in signaling and cell polarity determination6, 7 is visualized in Xenopus ectodermal cells to study Wnt signal transduction8. Coexpression of a Wnt ligand or a Frizzled receptor alters the distribution of Diversin fused with red fluorescent protein, RFP, and recruits it to the cell membrane in a polarized fashion 8, 9. This ex vivo protocol should be a useful addition to in vitro studies of cultured mammalian cells, in which spatial control of signaling differs from that of the intact tissue and is much more difficult to analyze.

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Xenopus embryonic ectoderm has become an attractive model for studies of cell polarity. An assay is described, in which subcellular distribution of fluorescent proteins is assessed in ectoderm cells. This protocol will help address questions related to spatial control of signaling.

Traslocazione polarizzato di proteine ​​fluorescenti in Xenopus</emEctoderma> in risposta alla segnalazione Wnt

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi di screening per identificare fenotipi postembrionale in C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Trapianti viso a<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embrioni

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

Il<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovociti Cut-open vaselina Gap Tecnica Voltage-clamp Con fluorometria

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...