Start-up verbas para A. Dickinson de VCU apoiaram este trabalho. Os autores gostariam de agradecer Dan Nacu por seu talento artístico na criação da ilustração esquemática.

<ol>
	<li>Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleft+lip+and+palate.">Cleft lip and palate.</a> Lancet. 374, 1773-1785 (2009).</li><li>Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Median+facial+clefts+in+Xenopus+laevis:+roles+of+retinoic+acid+signaling+and+homeobox+genes.">Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes.</a> Dev Biol. 365, 229-240 (2012).</li><li>Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+Orofacial+Development+and+Median+Clefts+in+Xenopus+Laevis.">Quantitative Analysis of Orofacial Development and Median Clefts in Xenopus Laevis.</a> Anat Rec (Hoboken). , (2014).</li><li>Dickinson, A., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positioning+the+extreme+anterior+in+Xenopus:+cement+gland,+primary+mouth+and+anterior+pituitary.">Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary.</a> Semin Cell Dev Biol. 18, 525-533 (2007).</li><li>Dickinson, A. J., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+primary+mouth+in+Xenopus+laevis.">Development of the primary mouth in Xenopus laevis.</a> Dev Biol. 295, 700-713 (2006).</li><li>Dickinson, A. J., Sive, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt+antagonists+Frzb-1+and+Crescent+locally+regulate+basement+membrane+dissolution+in+the+developing+primary+mouth.">The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth.</a> Development. 136, 1071-1081 (2009).</li><li>Barnett, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syndrome+Transcription+Factor+is+critical+for+neural+crest+cell+function+in+Xenopus+laevis.">Syndrome Transcription Factor is critical for neural crest cell function in Xenopus laevis.</a> Mech Dev. 129, 324-338 (2012).</li><li>Gonzales, B., Yang, H., Henning, D., Valdez, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+characterization+of+the+Xenopus+orthologue+of+the+Treacher+Collins+syndrome+(TCOF1)+gene+product.">Cloning and functional characterization of the Xenopus orthologue of the Treacher Collins syndrome (TCOF1) gene product.</a> Gene. 359, 73-80 (2005).</li><li>Reisoli, E., De Lucchini, S., Nardi, I., Ori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+2B+receptor+signaling+is+required+for+craniofacial+morphogenesis+and+jaw+joint+formation+in+Xenopus.">Serotonin 2B receptor signaling is required for craniofacial morphogenesis and jaw joint formation in Xenopus.</a> Development. 137, 2927-2937 (2010).</li><li>Schuff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxN3+is+required+for+craniofacial+and+eye+development+of+Xenopus+laevis.">FoxN3 is required for craniofacial and eye development of Xenopus laevis.</a> Dev Dyn. 236, 226-239 (2007).</li><li>Slater, B. J., Liu, K. J., Kwan, M. D., Quarto, N., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+osteogenesis+and+suture+morphology+in+Xenopus+laevis:+a+unique+model+system+for+studying+craniofacial+development.">Cranial osteogenesis and suture morphology in Xenopus laevis: a unique model system for studying craniofacial development.</a> PLoS One. 4, (2009).</li><li>Vandenberg, L. N., Adams, D. S., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalized+shape+and+location+of+perturbed+craniofacial+structures+in+the+Xenopus+tadpole+reveal+an+innate+ability+to+achieve+correct+morphology.">Normalized shape and location of perturbed craniofacial structures in the Xenopus tadpole reveal an innate ability to achieve correct morphology.</a> Dev Dyn. 241, 863-878 (2012).</li><li>Bugaighis, I., Mattick, C. R., Tiddeman, B., Hobson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Facial+Morphometry+in+Children+with+Oral+Clefts.">3D Facial Morphometry in Children with Oral Clefts.</a> Cleft Palate Craniofac J. , (2013).</li><li>Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+anatomy+of+the+face+in+Down's+syndrome:+anthropometric+proportion+indices+in+the+craniofacial+regions.">Surface anatomy of the face in Down's syndrome: anthropometric proportion indices in the craniofacial regions.</a> J Craniofac Surg. 12, 519-524 (2001).</li><li>Scheuer, H. A., Holtje, W. J., Hasund, A., Pfeifer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognosis+of+facial+growth+in+patients+with+unilateral+complete+clefts+of+the+lip,+alveolus+and+palate.">Prognosis of facial growth in patients with unilateral complete clefts of the lip, alveolus and palate.</a> J Craniomaxillofac Surg. 29, 198-204 (2001).</li><li>Parsons, K. J., Andreeva, V., James Cooper, W., Yelick, P. C., Craig Albertson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+zebrafish+jaw:+development+beyond+the+embryo.">Morphogenesis of the zebrafish jaw: development beyond the embryo.</a> Methods Cell Biol. 101, 225-248 (2011).</li><li>Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+anatomy+of+the+face+in+Down's+syndrome:+age-related+changes+of+anthropometric+proportion+indices+in+the+craniofacial+regions.">Surface anatomy of the face in Down's syndrome: age-related changes of anthropometric proportion indices in the craniofacial regions.</a> J Craniofac Surg. 13, 368-374 (2002).</li><li>Cooper, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bentho-pelagic+divergence+of+cichlid+feeding+architecture+was+prodigious+and+consistent+during+multiple+adaptive+radiations+within+African+rift-lakes.">Bentho-pelagic divergence of cichlid feeding architecture was prodigious and consistent during multiple adaptive radiations within African rift-lakes.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Klingenberg, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+alcohol+exposure+alters+the+patterns+of+facial+asymmetry.">Prenatal alcohol exposure alters the patterns of facial asymmetry.</a> Alcohol. 44, 649-657 (2010).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+cleft+palate+in+mice+with+a+targeted+mutation+of+the+LIM+homeobox+gene+lhx8.">Isolated cleft palate in mice with a targeted mutation of the LIM homeobox gene lhx8.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 15002-15006 (1999).</li><li>Allam, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spectrum+of+median+craniofacial+dysplasia.">The spectrum of median craniofacial dysplasia.</a> Plast Reconstr Surg. , 812-821 (2011).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R., Harlard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2000).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+eggs+from+Xenopus+laevis+females.">Obtaining eggs from Xenopus laevis females.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , (1967).</li><li>Nieuwkoop, P. D. a. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metamorphosis. , (1994).</li><li>Abdi, H., Williams, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principal+Component+Analysis.">Principal Component Analysis.</a> WIREs Computational Statistics. 2, (2010).</li><li>Hill, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> P. STATISTICS: Methods and Applications. , (2013).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Xenopus laevis tornou-se uma ferramenta útil para dissecar os mecanismos de desenvolvimento de desenvolvimento orofacial subjacente; no entanto, atualmente não há protocolos que descrevem tamanho e forma as mudanças desta região em sapos. O método aqui descrito vai contribuir significativamente para o campo do desenvolvimento orofacial, permitindo a quantificação mais rigorosa dos fenótipos orofaciais em Xenopus e outros vertebrados. O primeiro aspecto, mais crítico de executar corretamente este protocolo é a capacidade de medir dimensões faciais e determinar a colocação marco tanto de forma precisa e reprodutível. Para este fim, é fundamental que os rostos embrionárias ser fotografado no mesmo ângulo, direção e ampliação. Um cuidado especial deve ser tomado para obter medidas precisas do comprimento do focinho, uma vez que é difícil de manipular embriões lateralmente e conseguir a colocação consistente. Ter uma única pessoa realizar todas as medições sobre os sdia de AME minimiza este tipo de erro, enquanto maximiza a reprodutibilidade dos resultados. O segundo aspecto mais crítico de garantir bons resultados é a redução da variabilidade desnecessárias, tais como diferenças de desenvolvimento ou de fundo genético. Isto é especialmente importante quando se avalia a significância estatística entre os defeitos sutis. Embriões, por conseguinte, precisa de estar na mesma fase, quando tratados e fotografados. Além disso, cuidados devem ser tomados para garantir as taxas de desenvolvimento são equivalentes entre e entre os grupos de tratamento. Para diminuir esses problemas com a variabilidade, certifique-se de que todos os embriões são dos mesmos pais e são o estágio combinado no início do experimento. Também reduzir as fontes externas de variabilidade, como fontes diferentes de buffer e volumes, diferentes números de embriões, e distribuições nas placas de cultura (por exemplo, evitar a aglomeração). Um passo fundamental na avaliação das mudanças de forma, através da morfometria geométrica é o alignment de marco coordena via Procusto ajuste. Por aplicação deste algoritmo matemático, qualquer informação sobre o tamanho ou diferenças na rotação da imagem é removida. A matriz de covariância posteriormente gerado determina as correlações não-padronizados de coordenadas de referência entre todos os embriões no conjunto de dados, em que multivariada techniques- estatística como componente principal ou função analyses- discriminante podem ser realizadas. A análise de componentes principais (PCA) reduz uma amostra complexa de um conjunto menor de variáveis ​​chamadas componentes principais 26. O primeiro componente é responsável por mais variância dentro do conjunto de amostras, com cada componente subseqüente representando o resto. Ao traçar os dois primeiros componentes uns contra os outros software de morfometria usando amostras, que são mais semelhantes do cluster juntos. Desta forma, o PCA discrimina grupos dentro de um conjunto de amostras, ao mesmo tempo, determinar a variação dentro deles. No somE casos, os grupos não podem ser claramente distinguidos um do outro e se sobrepõem ao longo de um ou ambos os eixos. Neste caso, é vantajoso para traçar outros componentes (por exemplo, PC3), a fim de revelar as características subtis por grupos que são discriminados. Isto é especialmente relevante quando a variância total é distribuído de forma mais uniforme entre os primeiros diversas variáveis. A análise da função discriminante (DFA) de Procusto dados ajuste determina se as amostras em um conjunto de dados são efetivamente discriminadas em grupos pelas variáveis ​​contínuas que os definem. As amostras são, portanto, classificadas em grupos anteriores à análise, e as variáveis ​​são traduzidos em componentes chamados funções discriminantes para determinar a relação estatística entre os grupos 27. Antes de executar esta análise, é importante para indicar o número de testes de permutação. Estes testes de permutação aleatória dos dados de tal forma que todas as suposições sobre sua distribuição são Eliminated. Mais iterações de teste de permutação aumentar a precisão do valor de p. Quando visualizado como uma grade de transformação, alterações significativas na posição de referência entre os grupos em comparação sejam exibidos. Além disso, o padrão de deformação da grade revela onde as mudanças ocorrem de forma. O inconveniente desta análise é que ela só pode ser utilizada para comparação de dois grupos. Se houver três ou mais grupos em um conjunto de amostras para comparação, é melhor para realizar uma análise de variáveis ​​canônicas. Isto é semelhante a um DFA na medida em que gera um p-valor estatístico; no entanto, ela mostra mudanças que ocorrem ao longo de todo o conjunto de amostra, para além das que ocorrem entre os grupos individuais dentro desse conjunto. A principal limitação deste protocolo de quantificação orofacial é que ela só pode ser aplicado a dados bidimensionais. Nossos objetivos futuros incluem o uso de tomografia computadorizada ou microscopia confocal para desenvolver métodos semelhantes para a análise dos dados tridimensionais. Por outro lado,trabalhar com imagens bidimensionais também é um dos principais pontos fortes deste protocolo. Somente stereoscopes básicos equipados com câmeras são necessárias para capturar imagens do rosto embrionário. O OpenWare utilizado para esta análise de dados também aumenta a acessibilidade deste método, enquanto diminui o custo. Além disso, um conhecimento avançado de imagiologia sophistical, análises estatísticas, ou programação de computador não é necessária para extrair resultados significativos e significativos a partir dos dados. Na verdade, esta técnica está sendo ensinada como parte de um curso de laboratório de graduação no departamento de VCU de biologia. Assim, o protocolo de quantificação orofacial aqui apresentado é fácil de aprender e aplicar num curto período de tempo. Como uma representação de vídeo, passos críticos, como o posicionamento embriões e na navegação do software são destacados para garantir o protocolo pode ser utilizado com sucesso mesmo por estudantes e pesquisadores treinados. Em resumo, este protocolo irá fornecer um recurso valiosopara a comunidade de pesquisa e como ferramenta de ensino.

Entre os tipos mais prevalentes e devastadores de defeitos congênitos humanos são aqueles que afetam a boca e face, tais como fendas orofaciais um. Crianças com estruturas orofaciais malformados passar por várias cirurgias ao longo da sua vida e luta com desfigurações faciais, voz, audição e problemas alimentares. Portanto, facilitando novas pesquisas no desenvolvimento crânio-orofacial e é fundamental para a prevenção e tratamento destes tipos de defeitos congênitos em humanos. Xenopus laevis surgiu como uma nova ferramenta para dissecar os mecanismos que regem o desenvolvimento craniofacial (alguns exemplos incluem 2,3,4 -11). Portanto, um método quantitativo para analisar tamanho e forma as mudanças durante o desenvolvimento da cabeça e do rosto desta espécie poderia ser muito poderosa 3. Aqui, apresentamos um método desse tipo; combinando medidas tradicionais de tamanho, com morfometria geométrica adaptados de um estudo Xenopus 12 </sup&gt; e uma riqueza de estudos que analisam forma facial humana 13-15. O objetivo deste protocolo é permitir que pesquisadores para quantificar o tamanho e formas facial para distinguir entre diferentes fenótipos orofaciais durante o desenvolvimento normal e anormal. Essa análise permitirá uma melhor diferenciação entre defeitos craniofaciais sutis, como os decorrentes de efeitos sinérgicos de genes e / ou fatores ambientais. Além disso, este método de quantificação também poderia revelar até mesmo ligeira melhoria ou resgate de um defeito orofacial. Este, portanto, faz com que seja um guia útil na análise de potenciais terapias. A combinação das medidas faciais e morfometria geométrica que apresentamos aqui permite uma análise estatística mais abrangente, tanto em tamanho e forma da região orofacial do que os protocolos actuais, que utilizam, em grande parte apenas um ou outro 15-18. Além disso, apresentamos uma forma simples de avaliar tanto a medial e planos laterais deo rosto sem a necessidade de equipamentos de imagem tridimensional sofisticado usado em estudos atuais 13,19. Demonstramos esse protocolo em Xenopus laevis embriões tratados com um inibidor do receptor do ácido retinóico que induz o desenvolvimento orofacial anormal e um 2,3 fenda palatina mediana. A quantificação das dimensões e forma da região orofacial nestes embriões revelou mudanças no terço médio da face, que é análogo aos seres humanos com fissuras palatinas semelhantes e modelos de mouse 20,21. No entanto, este protocolo pode ser utilizado para avaliar os efeitos de outros compostos no desenvolvimento orofacial substâncias naturais, tais como, herbicidas, ou proteínas, tais como factores de crescimento. Além disso, o tamanho e forma alterações orofaciais decorrentes de perturbação da expressão génica por via da perda ou ganho de experiências de função (utilizando morpholinos anti-sentido ou Crispers / Talens) pode também ser quantificada usando este protocolo. Por fim, desenvolvemos este método specificalmente para avaliar a morfologia de Xenopus; no entanto, é facilmente modificado para análise de qualquer vertebrado. Outras aplicações também poderia incluir o uso deste protocolo para a comparação de espécies estreitamente relacionadas para estudos evolutivos ou ecológicos. Embora o exemplo que fornecemos aqui utiliza este protocolo para descrever a análise da região orofacial, que poderia ser facilmente modificado para análise de outras regiões, órgãos ou estruturas. Este protocolo quantificação orofacial vai se tornar um recurso valioso para a comunidade de pesquisa, bem como uma excelente ferramenta de ensino para os alunos de graduação como uma demonstração em vídeo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="818">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:304px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:143px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:236px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>fitted with AxioCamICC1 camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 Inox forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile, disposable scalpel</td>
			<td>Sklar</td>
			<td>06-2015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">24-well plate</td>
			<td style="width:143px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">087721</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:304px;">Standard Disposable transfer pipettes</td>
			<td style="width:143px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">13-711-7M</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">150 mm X 15 mm Petri dishes</td>
			<td style="width:143px;">Falcon</td>
			<td style="width:136px;">351058</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Incubators</td>
			<td style="width:143px;">Ectotherm</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:236px;">set to 15C or 20C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:304px;">Modeling Clay</td>
			<td style="width:143px;">Premo, or other non-toxic modeling clay</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:236px;">in black or white</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Straight teasing needle</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">19010</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:304px;">Capillary Tubing (for needles)</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-1</td>
			<td style="width:236px;">Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber, 100 mm each</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:304px;">Needle Puller, Model P-97&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sutter Instrument Co,&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B</td>
			<td style="width:236px;">For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:304px;">Pipettemen</td>
			<td style="width:143px;">Gilson</td>
			<td style="width:136px;">F144802, F123600, F123602</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">BMS-453</td>
			<td style="width:143px;">Tocris</td>
			<td style="width:136px;">3409</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:304px;">DMSO</td>
			<td style="width:143px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:136px;">AB00435-01000</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Cysteine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">52-90-4</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Paraformaldehyde powder</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">158127</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:304px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:143px;">Falcom</td>
			<td style="width:136px;">353003, 351058</td>
			<td style="width:236px;">100 mm diameter and 150 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:143px;">VWR</td>
			<td>89125-170</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of orofacial phenotypes in xenopus

Xenopus tornou-se uma ferramenta importante para dissecar os mecanismos que regem o desenvolvimento craniofacial e defeitos. Um método para quantificar o desenvolvimento orofacial irá permitir uma análise mais rigorosa dos fenótipos orofaciais mediante revogação com substâncias que podem manipular geneticamente ou molecularmente a expressão do gene ou a função da proteína. Usando imagens bidimensionais dos chefes embrionárias, dimensões, tais como tamanho tradicional orofacial largura, altura e área- são medidos. Além disso, uma medida de arredondamento da abertura da boca embrionária é usada para descrever a forma da boca. Morfometria geométrica destes dois imagens tridimensionais também é executada para fornecer uma visão mais sofisticada de mudanças na forma da região orofacial. Marcos são atribuídos a pontos específicos na região orofacial e coordenadas são criados. A análise de componentes principais é usada para reduzir coordenadas marco para componentes principais que, em seguida, discriminam o tratamentogrupos. Estes resultados são exibidos como um gráfico de dispersão em que os indivíduos com formas orofaciais semelhantes se agrupam. Também é útil para executar uma análise da função discriminante, que compara estatisticamente as posições dos pontos de referência de entre dois grupos de tratamento. Esta análise é apresentada em uma grade transformação, onde mudanças na posição do marco são vistos como vetores. A grade é sobreposto a estes vetores para que um padrão de deformação é exibido para mostrar onde as posições marco significativas mudaram. As mudanças de forma na análise da função discriminante baseiam-se numa medida estatística, e, por conseguinte, pode ser avaliada por um valor de p. Esta análise é simples e acessível, necessitando apenas de um estereoscópio e software freeware, e, portanto, será um recurso valioso de pesquisa e ensino.

Aqui, foi demonstrada uma análise quantitativa do tamanho e forma orofacial para comparar os embriões tratados com um inibidor do receptor do ácido retinóico (RAR inibidor) a controlos não tratados. Os embriões foram tratados com uma concentração de 1 uM de inibidor químico esta fase de 24 a 30 anos (26-35 hpf), lavou-se para fora, e fixado em fase 42 (82 hpf). Eles foram, em seguida, processada e analisada como descrito no protocolo. Os resultados são dados originais, mas consistente com as observações em publicações anteriores 2,3. Embriões de controlo foram tratados com o veículo, DMSO, e desenvolvida de forma normal (Figura 7aa, ii). Os embriões tratados com uma concentração de 1 uM do inibidor de RAR mostrou ligeiro estreitamento da face, anomalias do olho, e uma abertura de boca embrionário mal formada que foi dada forma mais triangular (Figura 7Aiii, iv). Em primeiro lugar, as dimensões tradicionais orofaciais foram medidos e estão resumidos na Figura 7B. S<html> Serviço Estatístico significância foi determinada através da realização de um teste t de Student assumindo variância desigual entre os inibidores de embriões tratados e controlos para cada medição. Descobrimos que tanto comprimento do focinho e largura da face foram significativamente menores em inibidores de embriões tratados com RAR em relação aos controles (valores de p = 0,0062 e 0,0058, respectivamente; Figura 7Bi, ii). Enquanto altura da face e da boca redondeza foram significativamente aumentados (valores de p = 3,7772 x 10 -6, 1,4812 x 10 -7), largura da boca foi significativamente reduzida (p = 2,5175 x 10 -10; Figura 7Biii-v) .A resultados mostraram não haver diferença significativa na área orofacial global entre os dois grupos (p = 0,3754; Figura 7Bvi). Estes dados mostram que a perda da sinalização do ácido retinóico em um momento específico em resultados de desenvolvimento em um focinho mais curto, ligeiro estreitamento da região do terço médio da face, e malformação da abertura embrionária boca. nt &quot;&gt; Para fornecer uma visão sofisticada das mudanças no formato da região orofacial embrionário em resposta a sinais de redução de ácido retinóico, que ao lado de morfometria geométrica utilizada análises. Após a identificação e alinhando marcos orofaciais usando software de análises morfométricas, que, em seguida, examinaram a variância dentro de cada grupo através de análise de componentes principais (PCA). Quando os dois primeiros componentes principais foram plotados contra os outros, embriões inibidor RAR tratados eram claramente distinto de controles ao longo do eixo PC1 (Figura 7C). Este teste também mostrou os outliers no set- amostra ilustrada por dois embriões tratados inibidores que não se aglomeram, com o resto do grupo (Figura 7C, setas). Em seguida, as diferenças estatísticas para a forma da região orofacial entre inibidores de embriões tratados e controlos de RAR foram avaliados e visualizados através da realização de uma análise da função discriminante (DFA). O Procusto distância bntre os dois grupos foi significativamente diferente (distância = 0,2665, p &lt;0,0001, Figura 7D), indicando uma mudança na forma orofacial quando a sinalização de ácido retinóico é interrompido. De fato, mudanças dramáticas na posição dos marcos laterais na região orofacial indicam um estreitamento do formato do rosto respectivo à altura em inibidores de embriões tratados (Figura 7D). Além disso, a ligeira mudança para o exterior na posição dos marcos nasais (Figura 7D, setas) revela a anormalidade na posição narina nestes embriões que é consistente com a diminuição da excrescência do focinho. As mudanças nos marcos que definem as bordas da abertura da boca mudanças de posição mostra que refletem a formação de uma boca em forma triangular abertura que é consistente com a fenda mediana relatada em nossos estudos anteriores 2,3. Além de mudanças de vetores, o padrão de deformação da grade de transformação também ilustra mudanças no formato ou noofacial região. A deformação na região da face média é consistente com a hipoplasia maxilar e estreitamento geral facial visto em embriões com sinais de ácido retinóico diminuída (Figura 7D). Os resultados da análise da função discriminante (DFA) mostram mudanças de forma que eram consistentes com a nossa análise qualitativa, bem como revelando algumas mudanças que não foram adequadamente capturados por meio de medições tradicionais tamanho sozinho. Por exemplo, enquanto que a área orofacial não foi significativamente diferente entre os controlos e inibidor de embriões tratados (Figura 7Bvi), a grade de transformação DFA revelou alterações dramáticas na região consistentes com o estreitamento facial visto em embriões tratados com inibidores (Figura 7A, D). Além disso, os padrões de deformação e marco turnos da abertura da boca, juntamente com a mudança significativa que vimos na boca redondeza, ilustram a malformação da boca abrindo em forma inibidor tratado Embryos. Em resumo, uma combinação de medições tradicionais de dimensões faciais e análise de morfometria geométrica ilustra as alterações na forma e tamanho da região orofacial quando os sinais de ácido retinóico são interrompidos. <img alt="A Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52062/52062fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. materiais necessários. (A) Ferramentas para análise de dados. (I) 24 poços, (ii) padrão pipeta de transferência descartável, (iii) Dumont # 5 fórceps Inox, (iv) revestido de argila placa de Petri, (v) agulha provocação reta, (vi) ferramenta pipeta de vidro, (vii ) bisturi estéril, descartável. (B) Preparação do prato alinhado com argila. (I) Uma agulha provocação reta é usada para desenhar linhas horizontais no barro. (Ii) Uma ferramenta pipeta de vidro é usado para fazer depressões circulares ao longo de cada linha. (Iii) O prato é preenchido com PBT para imagiologia. page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="A Figura 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52062/52062fig2highres.jpg" width="300" /> Figura 2. A fertilização in vitro e cultura de ovos de Xenopus. (A) A seguir à injecção HCG, fêmeas adultos de Xenopus laevis são induzidas a pôr ovos. (B) Os ovos são recolhidos em MBS elevadas de sal, fertilizado com testículos extraídos a partir de um macho, e cultivadas utilizando métodos padrão. (C) Os embriões são transferidos para uma 24 poços contendo prato MBS 0,1x utilizando um padrão, descartável pipeta de transferência (D). Uma pipeta calibrada-homem é usado para medir a 1 ml em um poço vazio, e um marcador é utilizado para demarcar este nível no lado de fora de todos os poços contendo embriões (no detalhe). 0,1x MBS é então adicionado ou retirado para que ele esteja nivelado com esta marca. &quot;width =&quot; 500 highres.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Preparação de cabeças de embrião para a imagem latente. (A) Diagrama das duas incisões necessárias para remover as cabeças, as linhas pretas cheias. Barra de escala = 400 pm. (B) A primeira incisão é feita na extremidade posterior do intestino para remover a cauda e de libertação de pressão a partir do bisturi. Barra de escala = 400 pm. (C) A segunda incisão é feita na extremidade anterior do intestino, perto do coração, para separar completamente a cabeça. Barra de escala = 400 mm. (D) vista frontal da linha de cabeças de embriões colocados em argila. Barra de escala = 650 mm. (E) vista lateral de linha de posição cabeças de embriões em argila. Scale bar = 500 mm cg: glândula de cimento. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52062/52062fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. medidas de tamanho tradicionais de dimensões orofaciais. (A) </strong&gt; largura Face. As setas indicam os pontos em que a parte ventral do olho encontra a periferia da face. Linha vermelha é a largura da face, medida como a distância entre esses pontos. Linhas de barra de escala = 210 M. (B) Altura Face. Brancas são guias desenhadas antes da medição na margem dorsal dos olhos e da borda dorsal da glândula de cimento. A linha vermelha representa a altura da face, medida como a distância entre estas duas guias na linha média da face. Barra de escala = 210 M. (C) área Orofacial. As linhas brancas são guias desenhadas antes da medição. (A) O ponto em que a guia inferior encontra a borda ventral do olho esquerdo. Linha vermelha mostra o traçado ao redor do olho esquerdo. (B) O ponto em que o bordo dorsal do olho satisfaz o guia de topo. A linha azul indica a fronteira dorsal da área orofacial, traçada ao longo da guia de topo na extremidade dorsal dos olhos. (C) O ponto onde o guia top atende a periferia facial direita. Mostra linha verdeo traçado em torno do olho direito. (D) o ponto em que o bordo ventral do olho direito se encontra com o guia inferior. Linha amarela mostra limite ventral da área orofacial, traçou ao longo da guia inferior na borda dorsal da glândula de cimento. Barra de escala = 210 M. (D) comprimento do focinho. Linha branca é a borda anterior do olho e é desenhado como um guia antes da medição. A linha vermelha é focinho comprimento, medido a partir desta linha até ao ponto em que o bordo dorsal da glândula cimento preenche a periferia lateral da face. Barra de escala = 300 M. Largura (E) Boca. Arrows são os pontos onde a lábios dorsal e ventral se encontram. A linha vermelha representa a largura da boca, medida como a distância entre estes dois pontos. Barra de escala = 200 M. (F) Boca redondeza. O perímetro da abertura da boca é traçada e mostrada em vermelho. CG: glândula de cimento. Barra de escala = 200 M. <img alt = &quot;Figura 5&quot; fo: content-width = src &quot;5 polegadas&quot; = &quot;/ files / ftp_upload / 52062 / 52062fig5highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 5. Captura de marcos e preliminares para análises de morfometria geométrica. (A) Usando o software de edição de fotos e um programa de planilha para colocar marcos e coordenadas de captura. (I) cruzes coloridos são os marcos colocados na imagem usando a ferramenta de adicionar pontos em ImageJ para representar a forma da região orofacial. (Ii) os dados Landmark é exibido usando a ferramenta Exibir resultados. (Iii) dados Landmark é copiado e colado em uma planilha. Acima da segunda coluna é um cabeçalho que identifica o número de pontos de referência e indicado por &quot;LM = 24&quot; (caixa vermelha). Abaixo a segunda coluna de dados, a amostra é dado um nome único e denotado por &quot;ID = CON1&quot; (seta vermelha). Isto é repetido para todas as imagens em um conjunto de amostras e os dados são salvos como um arquivo de texto. (B) a análise dos dados preliminares em um softw morfometria geométricasão programa. (I) O arquivo de texto criado a partir do software de edição de fotos é importado para o programa de morfometria, MorphoJ, como um arquivo de TPS. Arquivo é indicado pela seta vermelha. (Ii) Landmark dados de coordenadas está alinhado por Procusto ajuste por eixos principais. A seta vermelha indica a execução do alinhamento. (Iii) A matriz de covariância de Procusto ajuste marcos é gerado no menu Preliminares. (Iv) Um arquivo classificador é criado em uma planilha. Coluna A e B são dadas cabeçalhos &quot;ID&quot; e &quot;tratamento&quot;, respectivamente. Dada a cada amostra na coleta de dados são marco de entrada da ID na coluna A, eo grupo de tratamento a que cada amostra pertence é a entrada na coluna B. (v) O arquivo classificador é importado para o programa de morfometria como um conjunto de variáveis ​​classificador e Matched por identificador para o conjunto de dados escolhido. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52062/52062fig5highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior</a>esta figura. <img alt="A Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52062/52062fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. A análise estatística em software de morfometria. (A) Análise de Componentes Principais (PCA) (i) PCA é seleccionado a partir do separador Variação. (Ii) Os dois primeiros componentes principais marcos Procusto são exibidos como um gráfico de dispersão na guia pontuações PC. (Iii) Um menu pop-up é levantada no espaço trama. Este menu é usado para mudar os componentes principais são plotados contra os outros (seta vermelha) e para colorir os pontos de dados (destacado em azul). (Iv) Os pontos de dados são coloridas de acordo com as variáveis ​​classificador no menu pop-up. (V) Porcentagem de variância capturada por cada componente principal é visto na guia Resultados. (B) Função Análise Discriminante (DFA) (i) DFA é selecionado a partir da guia de comparação. (ii) O conjunto de Procusto dados coordenadas for selecionado para DFA, e os classificadores anteriormente enviados são escolhidos para o agrupamento. Os grupos desejados a serem comparadas são escolhidos e testes de permutação são executados. (Iii) os resultados do DFA são exibidos como um mapa do vetor no guia Forma diferença. Um menu pop-up no espaço gráfico pode ser usado para orientar corretamente a imagem. (Iv) Ao selecionar a guia Set Fator de Escala no menu pop-up, o sinal do fator de escala pode ser alterada. (V) O mapa do vetor é alterada para uma grade de transformação com o número desejado de linhas de grade, escolhendo Alterar o tipo de gráfico no menu pop-up do mapa vetor. (Vi) A distâncias de Mahalanobis e Procrustes e p-valores correspondentes são vistos sob a guia Resultados. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52062/52062fig6highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <imgalt = &quot;Figura 7&quot; fo: content-width = src &quot;5 polegadas&quot; = &quot;/ files / ftp_upload / 52062 / 52062fig7highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 7. Análise Orofacial de controle e RAR inibido embriões tratados. (A) (i, ii) Imagens representativas de controlos. Barras de escala = 270 pm. (Iii, iv) Os embriões tratados com uma concentração de 1 uM do inibidor de RAR, BMS-453. Barras de escala = 260 pm. (I, iii) frontal vista. Abertura da boca é delineada em pontos vermelhos. (II, IV) vista lateral. CG:. glândula de cimento (B) dimensões orofaciais tradicionais de controle (preto) e inibidor tratado (azul) embriões. (I) comprimento do focinho, em mm (ii) largura de face, em mm (iii) altura da face, em mm (iv) a largura da boca, em mm (v) circularidade boca, um número menor de unidades determinada em ImageJ usando a equação: (4 &#8197; × &#8197; [Área]) / (π &#8197; × &#8197; [Eixo principal] 2). (Vi) área Orofacial, em mm <sup&gt; 2. Os asteriscos indicam significância, tal como determinado pelo teste t de Student assumindo uma variância desigual. α &lt;0,05. (C) Análise de Componentes Principais. Os controles são em inibidores de embriões tratados preto e RAR estão em azul. Setas pretas indicam os outliers. PC1 = 73,63%, PC2 = 9,56%. (D) Análise de função discriminante exibindo a distância Procusto e p-valor, para além de uma grade de transformação. Fechado final do círculo de vetor é a posição do marco em inibidor RAR embriões tratados. O final da linha do vector de referência é a posição em controlos. Setas pretas indicam mudança de marcos nasais. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52062/52062fig7highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Um método para quantificar o tamanho e forma orofacial de embriões de Xenopus laevis foi desenvolvido. Neste protocolo, as medições de tamanho tradicional são combinados com morfometria geométrica para permitir análises mais sofisticadas de desenvolvimento orofacial e defeitos.

Quantificação de Orofacial nos fenótipos<em&gt; Xenopus</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

9.7K visualizações.  Virginia Commonwealth University.  Um método para quantificar o tamanho e forma orofacial de embriões de Xenopus laevis foi desenvolvido. Neste protocolo, as medições de tamanho tradicional são combinados com morfometria geométrica para permitir análises mais sofisticadas de desenvolvimento orofacial e defeitos. 

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In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

In Vitro Assembléia Nuclear Usando Extractos Egg fracionado Xenopus

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Biologia

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Gravação de patch-clamp de canais iônicos Expresso em Oócitos Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjeção de Oócitos Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualizando Localização RNA em Xenopus Oócitos

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Quantificação de γH2AX Focos em resposta à radiação ionizante

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Grampo patch e Técnicas de Perfusão para estudar canais iônicos Expresso em Xenopus Oócitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic development 1, 2. One of the signaling pathways involved in this regulation is the Wnt pathway, which is used many times during embryogenesis and critical for human disease3, 4, 5. Multiple molecular components of this pathway coordinately regulate signaling in a spatially-restricted manner, but the underlying mechanisms are not fully understood. Xenopus embryonic epithelial cells is an excellent system to study subcellular localization of various signaling proteins. Fluorescent fusion proteins are expressed in Xenopus embryos by RNA microinjection, ectodermal explants are prepared and protein localization is evaluated by epifluorescence. In this experimental protocol we describe how subcellular localization of Diversin, a cytoplasmic protein that has been implicated in signaling and cell polarity determination6, 7 is visualized in Xenopus ectodermal cells to study Wnt signal transduction8. Coexpression of a Wnt ligand or a Frizzled receptor alters the distribution of Diversin fused with red fluorescent protein, RFP, and recruits it to the cell membrane in a polarized fashion 8, 9. This ex vivo protocol should be a useful addition to in vitro studies of cultured mammalian cells, in which spatial control of signaling differs from that of the intact tissue and is much more difficult to analyze.

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Xenopus embryonic ectoderm has become an attractive model for studies of cell polarity. An assay is described, in which subcellular distribution of fluorescent proteins is assessed in ectoderm cells. This protocol will help address questions related to spatial control of signaling.

Translocação polarizada de proteínas fluorescentes em Xenopus Ectodérmicas em resposta à sinalização Wnt

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi de triagem para identificar fenótipos pós-embrionário em C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Transplantes faciais em<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Os embriões

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

O<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyte Cut-aberto vaselina Gap Técnica Voltage-clamp Com Fluorometria

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...