Fondos para la instalación de A. Dickinson de VCU apoyaron este trabajo. Los autores desean agradecer a Dan Nacu por su talento artístico en la creación de la ilustración esquemática.

<ol>
	<li>Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleft+lip+and+palate.">Cleft lip and palate.</a> Lancet. 374, 1773-1785 (2009).</li><li>Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Median+facial+clefts+in+Xenopus+laevis:+roles+of+retinoic+acid+signaling+and+homeobox+genes.">Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes.</a> Dev Biol. 365, 229-240 (2012).</li><li>Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+Orofacial+Development+and+Median+Clefts+in+Xenopus+Laevis.">Quantitative Analysis of Orofacial Development and Median Clefts in Xenopus Laevis.</a> Anat Rec (Hoboken). , (2014).</li><li>Dickinson, A., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positioning+the+extreme+anterior+in+Xenopus:+cement+gland,+primary+mouth+and+anterior+pituitary.">Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary.</a> Semin Cell Dev Biol. 18, 525-533 (2007).</li><li>Dickinson, A. J., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+primary+mouth+in+Xenopus+laevis.">Development of the primary mouth in Xenopus laevis.</a> Dev Biol. 295, 700-713 (2006).</li><li>Dickinson, A. J., Sive, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt+antagonists+Frzb-1+and+Crescent+locally+regulate+basement+membrane+dissolution+in+the+developing+primary+mouth.">The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth.</a> Development. 136, 1071-1081 (2009).</li><li>Barnett, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syndrome+Transcription+Factor+is+critical+for+neural+crest+cell+function+in+Xenopus+laevis.">Syndrome Transcription Factor is critical for neural crest cell function in Xenopus laevis.</a> Mech Dev. 129, 324-338 (2012).</li><li>Gonzales, B., Yang, H., Henning, D., Valdez, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+characterization+of+the+Xenopus+orthologue+of+the+Treacher+Collins+syndrome+(TCOF1)+gene+product.">Cloning and functional characterization of the Xenopus orthologue of the Treacher Collins syndrome (TCOF1) gene product.</a> Gene. 359, 73-80 (2005).</li><li>Reisoli, E., De Lucchini, S., Nardi, I., Ori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+2B+receptor+signaling+is+required+for+craniofacial+morphogenesis+and+jaw+joint+formation+in+Xenopus.">Serotonin 2B receptor signaling is required for craniofacial morphogenesis and jaw joint formation in Xenopus.</a> Development. 137, 2927-2937 (2010).</li><li>Schuff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxN3+is+required+for+craniofacial+and+eye+development+of+Xenopus+laevis.">FoxN3 is required for craniofacial and eye development of Xenopus laevis.</a> Dev Dyn. 236, 226-239 (2007).</li><li>Slater, B. J., Liu, K. J., Kwan, M. D., Quarto, N., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+osteogenesis+and+suture+morphology+in+Xenopus+laevis:+a+unique+model+system+for+studying+craniofacial+development.">Cranial osteogenesis and suture morphology in Xenopus laevis: a unique model system for studying craniofacial development.</a> PLoS One. 4, (2009).</li><li>Vandenberg, L. N., Adams, D. S., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalized+shape+and+location+of+perturbed+craniofacial+structures+in+the+Xenopus+tadpole+reveal+an+innate+ability+to+achieve+correct+morphology.">Normalized shape and location of perturbed craniofacial structures in the Xenopus tadpole reveal an innate ability to achieve correct morphology.</a> Dev Dyn. 241, 863-878 (2012).</li><li>Bugaighis, I., Mattick, C. R., Tiddeman, B., Hobson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Facial+Morphometry+in+Children+with+Oral+Clefts.">3D Facial Morphometry in Children with Oral Clefts.</a> Cleft Palate Craniofac J. , (2013).</li><li>Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+anatomy+of+the+face+in+Down's+syndrome:+anthropometric+proportion+indices+in+the+craniofacial+regions.">Surface anatomy of the face in Down's syndrome: anthropometric proportion indices in the craniofacial regions.</a> J Craniofac Surg. 12, 519-524 (2001).</li><li>Scheuer, H. A., Holtje, W. J., Hasund, A., Pfeifer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognosis+of+facial+growth+in+patients+with+unilateral+complete+clefts+of+the+lip,+alveolus+and+palate.">Prognosis of facial growth in patients with unilateral complete clefts of the lip, alveolus and palate.</a> J Craniomaxillofac Surg. 29, 198-204 (2001).</li><li>Parsons, K. J., Andreeva, V., James Cooper, W., Yelick, P. C., Craig Albertson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+zebrafish+jaw:+development+beyond+the+embryo.">Morphogenesis of the zebrafish jaw: development beyond the embryo.</a> Methods Cell Biol. 101, 225-248 (2011).</li><li>Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+anatomy+of+the+face+in+Down's+syndrome:+age-related+changes+of+anthropometric+proportion+indices+in+the+craniofacial+regions.">Surface anatomy of the face in Down's syndrome: age-related changes of anthropometric proportion indices in the craniofacial regions.</a> J Craniofac Surg. 13, 368-374 (2002).</li><li>Cooper, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bentho-pelagic+divergence+of+cichlid+feeding+architecture+was+prodigious+and+consistent+during+multiple+adaptive+radiations+within+African+rift-lakes.">Bentho-pelagic divergence of cichlid feeding architecture was prodigious and consistent during multiple adaptive radiations within African rift-lakes.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Klingenberg, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+alcohol+exposure+alters+the+patterns+of+facial+asymmetry.">Prenatal alcohol exposure alters the patterns of facial asymmetry.</a> Alcohol. 44, 649-657 (2010).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+cleft+palate+in+mice+with+a+targeted+mutation+of+the+LIM+homeobox+gene+lhx8.">Isolated cleft palate in mice with a targeted mutation of the LIM homeobox gene lhx8.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 15002-15006 (1999).</li><li>Allam, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spectrum+of+median+craniofacial+dysplasia.">The spectrum of median craniofacial dysplasia.</a> Plast Reconstr Surg. , 812-821 (2011).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R., Harlard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2000).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+eggs+from+Xenopus+laevis+females.">Obtaining eggs from Xenopus laevis females.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , (1967).</li><li>Nieuwkoop, P. D. a. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metamorphosis. , (1994).</li><li>Abdi, H., Williams, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principal+Component+Analysis.">Principal Component Analysis.</a> WIREs Computational Statistics. 2, (2010).</li><li>Hill, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> P. STATISTICS: Methods and Applications. , (2013).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Xenopus laevis se ha convertido en una herramienta útil para la disección de los mecanismos de desarrollo de desarrollo orofacial subyacente; sin embargo, actualmente no existen protocolos que describen los cambios de tamaño y forma de esta región en las ranas. El método aquí descrito contribuirá significativamente a la esfera del desarrollo orofacial al permitir una cuantificación más rigurosa de fenotipos orofaciales en Xenopus y otros vertebrados. El primer aspecto, más crítico de ejecutar correctamente este protocolo es la capacidad para medir las dimensiones faciales y determinar la colocación hito tanto precisa y reproducible. Para ello, es crucial que los rostros embrionarias ser fotografiados en el mismo ángulo, la dirección y la ampliación. Especial cuidado se debe tomar para obtener mediciones precisas de la longitud hocico, ya que es difícil de manipular embriones lateralmente y lograr la colocación consistente. Tener una sola persona realice todas las mediciones en los sdía AME minimiza este tipo de error, al tiempo que maximiza la reproducibilidad de los resultados. El segundo aspecto más crítico de asegurar buenos resultados es la reducción de la variabilidad innecesaria, tales como las diferencias en el desarrollo o antecedentes genéticos. Esto es especialmente importante cuando se evalúa la significación estadística entre los defectos sutiles. Los embriones, por lo tanto, tienen que estar en la misma etapa cuando se les trata y se fotografiaron. Por otra parte, se debe tener cuidado para asegurar tasas de desarrollo son equivalentes entre y entre los grupos de tratamiento. Para reducir este tipo de problemas con la variabilidad, asegúrese de que todos los embriones son de los mismos padres y son etapa emparejado al comienzo del experimento. También reducir las fuentes externas de la variabilidad tales como diferentes fuentes de amortiguamiento y volúmenes, diferentes números de embriones, y distribuciones en las placas de cultivo (por ejemplo, evitar la aglomeración). Un paso clave en la evaluación de los cambios en la forma a través de morfometría geométrica es la alignment de hito coordina a través de ajuste Procusto. Por aplicación de este algoritmo matemático, se elimina cualquier información sobre el tamaño o las diferencias en la rotación de la imagen. La matriz de covarianza posteriormente generada determina las correlaciones no estandarizados de hito coordina entre todos los embriones en el conjunto de datos, en la que multivariado técnicas- estadística como componente principal o la función discriminante análisis- se puede realizar. Un análisis de componentes principales (PCA) reduce una muestra compleja para un conjunto más pequeño de variables llamadas componentes principales 26. El primer componente representa el más varianza dentro del conjunto de la muestra, con cada componente posterior que representa el resto. Trazando los primeros dos componentes uno contra el otro software morfométricos con nuevas muestras que son más similares clúster juntos. De esta manera, PCA discrimina grupos dentro de un conjunto de muestras, mientras se determina simultáneamente la variación dentro de ellos. En some casos, los grupos pueden no distinguirse claramente unos de otros y se superponen a lo largo de uno o ambos ejes. En este caso, es ventajoso para trazar otros componentes (por ejemplo, PC3) a fin de revelar características sutiles por el cual los grupos se discrimina. Esto es especialmente relevante cuando la variación total se distribuye de manera más uniforme entre las primeras de varias variables. El análisis de la función discriminante (DFA) de Procusto ajuste de datos determina si las muestras en un conjunto de datos se discrimina de manera efectiva en grupos por las variables continuas que los definen. Por lo tanto, las muestras se clasifican en grupos antes del análisis, y las variables se traducen en componentes llamados funciones discriminan para determinar la relación estadística entre los grupos 27. Antes de ejecutar este análisis, es importante para indicar el número de pruebas de permutación. Estas pruebas de permutación aleatoriamente los datos de tal manera que ninguna suposición sobre su distribución son Eliminated. Más iteraciones de prueba de permutación aumentar la exactitud de la p-valor. Cuando se visualizó como una rejilla de transformación, los cambios significativos en la situación histórica entre los grupos que se comparan se muestran. Además, el patrón de deformación de la red revela dónde ocurren cambios en la forma. El inconveniente de este análisis es que sólo se puede utilizar para la comparación de dos grupos. Si hay tres o más grupos en un conjunto de muestras para la comparación, es mejor para llevar a cabo un análisis de variación canónica. Esto es similar a un DFA en que se genera un p-valor estadístico; Sin embargo, muestra cambios que se producen en toda la muestra establecida, además de los que se producen entre los grupos individuales dentro de ese conjunto. La principal limitación de este protocolo cuantificación orofacial es que sólo se puede aplicar a los datos de dos dimensiones. Nuestras metas para el futuro incluyen el uso de la tomografía computarizada o la microscopía confocal para desarrollar métodos similares para el análisis de los datos tridimensionales. Por otra parte,trabajar con imágenes bidimensionales es también uno de los principales puntos fuertes de este protocolo. Sólo se necesitan estereoscopios básicos equipados con cámaras para capturar imágenes de la cara embrionario. El Openware utilizado para este análisis de datos también aumenta la accesibilidad de este método, mientras que disminuye el costo. Además, no se requiere un conocimiento avanzado de imágenes sofístico, análisis estadísticos, o la programación de computadoras para extraer resultados significativos e importantes de los datos. De hecho, esta técnica se enseña en la actualidad como parte de un curso de laboratorio de grado en el departamento de biología de la UCV. Por lo tanto, el protocolo de cuantificación orofacial se presenta aquí es fácil de aprender y aplicar en un corto período de tiempo. Como una representación de vídeo, se resaltan los pasos críticos tales como la colocación de los embriones y la navegación por el software para garantizar el protocolo puede ser utilizado con éxito por los estudiantes incluso sin entrenamiento e investigadores. En resumen, este protocolo proporcionará un valioso recursopara la comunidad de investigación y como herramienta de enseñanza.

Entre los tipos más frecuentes y devastadores de defectos de nacimiento en humanos son los que afectan a la boca y la cara, como hendiduras orofaciales 1. Los niños con estructuras orofaciales malformados se someten a múltiples cirugías durante toda su vida y luchan con desfiguraciones faciales, el habla, la audición y problemas de alimentación. Por lo tanto, lo que facilita una nueva investigación en el desarrollo de craneo y orofacial es de suma importancia para la prevención y el tratamiento de estos tipos de defectos de nacimiento en seres humanos. Xenopus laevis ha surgido como una nueva herramienta para la disección de los mecanismos que rigen el desarrollo craneofacial (algunos ejemplos incluyen 2,3,4 -11). Por lo tanto, un método cuantitativo para analizar los cambios de tamaño y forma durante el desarrollo de la cabeza y la cara de esta especie podría ser muy poderosa 3. A continuación, presentamos un método de este tipo; la combinación de mediciones de tamaño tradicional con morfometría geométrica adaptados de un estudio de Xenopus 12 </sup&gt; y una gran cantidad de estudios que analizan la forma facial humana 13-15. El objetivo de este protocolo es permitir a los investigadores para cuantificar el tamaño de la cara y las formas de distinguir entre los diferentes fenotipos orofaciales durante el desarrollo normal y anormal. Este análisis permitirá una mejor diferenciación entre los defectos craneofaciales sutiles tales como las derivadas de los efectos sinérgicos de los genes y / o factores ambientales. Además, este método de cuantificación también podría revelar incluso leve mejora o rescate de un defecto orofacial. Por lo tanto, esto hace que sea una guía útil en el análisis de productos terapéuticos potenciales. La combinación de medidas faciales y morfometría geométrica que aquí presentamos permite un análisis estadístico más exhaustivo del tamaño y forma de la región orofacial que los protocolos actuales que utilizan en gran medida sólo uno o el otro 15-18. Además, se presenta una forma sencilla de evaluar tanto el medial y planos laterales dela cara sin necesidad de equipos de imagen tridimensional sofisticada utilizada en los estudios actuales 13,19. Demostramos este protocolo en Xenopus laevis embriones tratados con un inhibidor del receptor del ácido retinoico que induce el desarrollo orofacial anormal y una mediana de 2,3 paladar hendido. La cuantificación de las dimensiones y la forma de la región orofacial en estos embriones han revelado cambios en el tercio medio facial que es análogo a los seres humanos con hendiduras palatinas similares y modelos de ratón 20,21. Sin embargo, este protocolo puede utilizarse para evaluar los efectos de otros compuestos sobre el desarrollo orofacial tales como sustancias naturales, herbicidas, o proteínas tales como factores de crecimiento. Además, el tamaño y forma cambia orofaciales derivados de la perturbación de la expresión génica a través de la pérdida o ganancia de experimentos de función (utilizando morfolinos antisentido o Crispers / Talens) también pueden ser cuantificados usando este protocolo. Por último, hemos desarrollado este método specificaLLY para evaluar la morfología de Xenopus; sin embargo, se puede modificar fácilmente para el análisis de cualquier vertebrado. Otras aplicaciones también podrían incluir el uso de este protocolo para la comparación de especies estrechamente relacionadas para los estudios evolutivos o ecológicos. Aunque el ejemplo que ofrecemos aquí utiliza este protocolo para describir el análisis de la región orofacial, que fácilmente podría ser modificado para el análisis de otras regiones, órganos o estructuras. Este protocolo cuantificación orofacial se convertirá en un recurso valioso para la comunidad de investigación, así como una excelente herramienta de enseñanza para los estudiantes de pregrado como una demostración en video.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="818">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:304px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:143px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:236px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>fitted with AxioCamICC1 camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 Inox forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile, disposable scalpel</td>
			<td>Sklar</td>
			<td>06-2015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">24-well plate</td>
			<td style="width:143px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">087721</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:304px;">Standard Disposable transfer pipettes</td>
			<td style="width:143px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">13-711-7M</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">150 mm X 15 mm Petri dishes</td>
			<td style="width:143px;">Falcon</td>
			<td style="width:136px;">351058</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Incubators</td>
			<td style="width:143px;">Ectotherm</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:236px;">set to 15C or 20C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:304px;">Modeling Clay</td>
			<td style="width:143px;">Premo, or other non-toxic modeling clay</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:236px;">in black or white</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Straight teasing needle</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">19010</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:304px;">Capillary Tubing (for needles)</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-1</td>
			<td style="width:236px;">Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber, 100 mm each</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:304px;">Needle Puller, Model P-97&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sutter Instrument Co,&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B</td>
			<td style="width:236px;">For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:304px;">Pipettemen</td>
			<td style="width:143px;">Gilson</td>
			<td style="width:136px;">F144802, F123600, F123602</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">BMS-453</td>
			<td style="width:143px;">Tocris</td>
			<td style="width:136px;">3409</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:304px;">DMSO</td>
			<td style="width:143px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:136px;">AB00435-01000</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Cysteine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">52-90-4</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Paraformaldehyde powder</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">158127</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:304px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:143px;">Falcom</td>
			<td style="width:136px;">353003, 351058</td>
			<td style="width:236px;">100 mm diameter and 150 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:143px;">VWR</td>
			<td>89125-170</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of orofacial phenotypes in xenopus

Xenopus se ha convertido en una herramienta importante para la disección de los mecanismos que rigen el desarrollo y defectos craneofaciales. Un método para cuantificar el desarrollo orofacial permitirá análisis más riguroso de fenotipos orofaciales en derogación con sustancias que genéticamente o molecularmente pueden manipular la expresión génica o la función de proteínas. El uso de dos imágenes dimensionales de las cabezas de embriones, se miden las dimensiones tradicionales de tamaño-tales como orofacial anchura, altura y zona-. Además, una medida de la redondez de la abertura de la boca embrionario se utiliza para describir la forma de la boca. Morfometría geométrica de estas dos imágenes dimensionales también se realiza para proporcionar una visión más sofisticada de los cambios en la forma de la región orofacial. Puntos de referencia se asignan a puntos específicos en la región orofacial y coordenadas se crean. Un análisis de componentes principio se utiliza para reducir coordenadas señal a los componentes principales que discriminan entonces el tratamientogrupos. Estos resultados se muestran como un gráfico de dispersión en el que los individuos con formas orofaciales similares se agrupan. También es útil para llevar a cabo un análisis de función discriminante, que compara estadísticamente las posiciones de los puntos de referencia entre dos grupos de tratamiento. Este análisis se muestra en una rejilla de transformación donde los cambios en la posición de punto de interés se consideran como vectores. Una rejilla se superpone a estos vectores a fin de que se muestra un patrón de deformación para mostrar dónde posiciones hitos significativos han cambiado. Cambios en la forma en el análisis de la función discriminante se basan en una medida estadística, y por lo tanto pueden ser evaluados por un valor de p. Este análisis es sencillo y accesible, que sólo requiere un estereoscopio y software freeware, y por lo tanto será una investigación y la enseñanza valiosa de recursos.

Aquí, se demostró un análisis cuantitativo de tamaño y forma orofacial para comparar los embriones tratados con un inhibidor de receptor de ácido retinoico (RAR inhibidor) a los controles no tratados. Los embriones se trataron con una concentración 1 M de este inhibidor químico de la etapa 24 a 30 (26-35 HPF), eliminado, y se fijaron en la etapa 42 (82 HPF). Luego fueron procesados ​​y analizados como se describe en el protocolo. Los resultados son los datos originales, pero consistente con las observaciones en las publicaciones anteriores 2,3. Embriones de control se trataron con el vehículo, DMSO, y se desarrollaron normalmente (Figura 7Ai, ii). Los embriones tratados con una concentración de 1 mM del inhibidor RAR mostraron leve estrechamiento de la cara, anomalías oculares y una malformación embrionaria que la apertura de la boca tenía la forma más triangular (Figura 7Aiii, iv). En primer lugar, se midieron las dimensiones tradicionales orofaciales y se resumen en la Figura 7B. S<html> importancia tatistical se determinó mediante la realización de la prueba t de Student suponiendo una varianza desigual entre inhibidores de embriones tratados y los controles para cada medición. Se encontró que tanto la longitud del hocico y la anchura de la cara se redujo significativamente en RAR inhibidores de embriones tratados en comparación con los controles (p-values ​​= 0,0062 y 0,0058, respectivamente; Figura 7Bi, ii). Mientras altura de la cara y la boca redondez aumentaron significativamente (p-valores = 3.7772 x 10 -6, 1,4812 x 10 -7), ancho de la boca se redujo significativamente (p-valor = 2.5175 x 10 -10; Figura 7Biii-v) .El los resultados no mostraron diferencias significativas en el área orofacial general entre los dos grupos (p-valor = 0,3754; Figura 7Bvi). Estos datos muestran que la pérdida de la señalización del ácido retinoico en un momento específico en los resultados de desarrollo en un hocico más corto, ligero estrechamiento de la región media de la cara, y la malformación de la apertura de la boca embrionario. nt &quot;&gt; Proporcionar una visión sofisticada de los cambios en la forma de la región orofacial embrionario en respuesta a las señales del ácido retinoico reducidos, el próximo utilizamos morfométrico geométrico análisis. Después de identificar y alinear hitos orofaciales utilizando software de análisis morfométricos, que examinó a continuación la variación dentro de cada grupo a través de un análisis de componentes principales (ACP). Cuando los dos primeros componentes principales se trazan unos contra otros embriones, inhibidor RAR tratados fueron distinguirse claramente de los controles a lo largo del eje PC1 (Figura 7C). Esta prueba también mostró los valores atípicos en el ajuste de la muestra ilustrado por dos embriones tratados con inhibidores de la que no se agrupan con el resto del grupo (Figura 7C, flechas). A continuación, las diferencias estadísticas en la forma de la región orofacial entre RAR inhibidores de embriones tratados y controles fueron evaluados y se visualizaron mediante la realización de un análisis de función discriminante (DFA). El Procusto distancia bntre los dos grupos fue significativamente diferente (distancia = 0,2665, valor p &lt;0,0001, Figura 7D), lo que indica un cambio en la forma orofacial cuando se altera la señalización del ácido retinoico. De hecho, los cambios dramáticos en la posición de las señales laterales en la región orofacial indican un estrechamiento de la forma de la cara correspondiente a la altura de inhibidores de embriones tratados (Figura 7D). Además, el ligero desplazamiento hacia afuera en la posición de los puntos de referencia nasales (Figura 7D, flechas) revela la anomalía en la posición de ventana de la nariz en estos embriones que es consistente con la disminución consecuencia del hocico. Los cambios en los puntos de referencia que definen los bordes de la abertura de boca cambios mostrar la posición que reflejan la formación de una boca en forma triangular abertura que es consistente con la hendidura mediana informada en nuestros estudios anteriores 2,3. Además de los cambios de vectores, el patrón de deformación de la rejilla de transformación también ilustra los cambios de forma en la oofacial región. De urdido en la región media de la cara es consistente con la hipoplasia mediofacial y estrechamiento general del rostro visto en embriones con señales de ácido retinoico disminuidas (Figura 7D). Los resultados del análisis de la función discriminante (DFA) muestran cambios en la forma en que eran compatibles con nuestro análisis cualitativo, así como revelan algunos cambios que no fueron capturados adecuadamente por medidas del tamaño tradicionales por sí solos. Por ejemplo, mientras que el área orofacial no fue significativamente diferente entre los controles y el inhibidor de embriones tratados (Figura 7Bvi), la rejilla de transformación DFA reveló cambios dramáticos en esta región de conformidad con el estrechamiento facial visto en inhibidores de embriones tratados (Figura 7A, D). Además, el patrón y la señal de deformación turnos de la apertura de la boca, junto con el cambio significativo que vimos en la boca redondez, ilustran la malformación de la boca abrir en forma inhibidor tratado Embryos. En resumen, una combinación de mediciones tradicionales de dimensiones faciales y análisis morfométrico geométrico ilustra los cambios en la forma y tamaño de la región orofacial cuando se interrumpen las señales de ácido retinoico. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52062/52062fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Material necesario. (A) Herramientas para el análisis de datos. (I) la placa de 24 pocillos, (ii) pipeta de transferencia desechable estándar, (iii) Dumont # 5 pinzas Inox, (iv) Petri plato de barro forradas, (v) la aguja burlas recta, (vi) herramienta pipeta de vidrio, (vii ) escalpelo estéril, desechable. (B) Preparación de la cazuela de barro forradas. (I) Una aguja burlas recta se utiliza para dibujar líneas horizontales en la arcilla. (Ii) Una herramienta pipeta de vidrio se utiliza para hacer depresiones circulares a lo largo de cada fila. (Iii) El plato está lleno de PBT para formación de imágenes. page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52062/52062fig2highres.jpg" width="300" /> Figura 2. En la fecundación in vitro y la cultura de los huevos de Xenopus. (A) Después de la inyección de HCG, adultos hembras de Xenopus laevis son inducidos a desovar. (B) Los huevos se recogieron en MBS elevadas de sal, fertilizados con testículos extraídos de un macho, y se cultivan utilizando métodos estándar. (C), los embriones se transfieren a una placa de 24 pocillos que contenía 0,1X MBS utilizando un estándar, pipeta de transferencia desechable. (D) Una pipeta calibrada-man se utiliza para medir 1 ml en un pocillo vacío, y un marcador se utiliza para delimitar este nivel en el exterior de todos los pocillos embriones que contienen (recuadro). 0,1x MBS luego se agrega o quita para que esté a nivel con esta marca. highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura 3. Preparación de los jefes de embriones para la obtención de imágenes. (A) Diagrama de las dos incisiones requeridas para eliminar las cabezas, las líneas negras. Barra de escala = 400 m. (B) La primera incisión se hace en el extremo posterior de la tripa para eliminar la presión de la cola y la liberación desde el bisturí. Barra de escala = 400 m. (C) La segunda incisión se hace en el extremo anterior del intestino, cerca del corazón, para cortar completamente la cabeza. Barra de escala = 400 m. (D) vistas frontales de la fila de cabezas de embriones colocados en arcilla. Barra de escala = 650 m. (E) Vistas laterales de la fila de la posición de las cabezas de embriones en arcilla. Barra de escala = 500 micras cg: glándula de cemento. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52062/52062fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. mediciones del tamaño de las dimensiones tradicionales de orofaciales. (A) </strong&gt; la anchura de la cara. Las flechas indican los puntos donde la porción ventral del ojo se encuentra con la periferia de la cara. La línea roja es la anchura de la cara, medida como la distancia entre estos puntos. Líneas de barra de escala = 210 M. (B) Altura de la cara. Blancos son guías extraídas antes de la medición en el borde dorsal de los ojos y el borde dorsal de la glándula de cemento. La línea roja es la altura de la cara, medida como la distancia entre estas dos guías en la línea media de la cara. Barra de escala = 210 M. (C) área orofacial. Las líneas blancas son guías elaboradas antes de la medición. (A) el punto donde el guía inferior y el borde ventral del ojo izquierdo. La línea roja muestra el trazado alrededor del ojo izquierdo. (B) En el punto donde el borde dorsal del ojo se encuentra con la guía superior. La línea azul muestra el límite dorsal del área orofacial, trazada a lo largo de la guía superior en el borde dorsal de los ojos. (C) El punto donde la guía superior se encuentra con la periferia de la cara derecha. Espectáculos línea verdeel trazado alrededor del ojo derecho. (D) El punto donde el borde ventral del ojo derecho se encuentra con la guía inferior. Línea amarilla muestra límite ventral del área orofacial, trazada a lo largo de la guía inferior en el borde dorsal de la glándula de cemento. Barra de escala = 210 M. (D) la longitud del hocico. La línea blanca es el borde anterior del ojo y se dibuja como una guía antes de la medición. La línea roja es la longitud del hocico, medida a partir de esta línea hasta el punto donde el borde dorsal de la glándula de cemento cumple con la periferia lateral de la cara. Barra de escala = 300 M. De ancho (E) de la boca. Las flechas son los puntos donde se unen los dorsales y ventrales labios. La línea roja es el ancho de la boca, medida como la distancia entre estos dos puntos. Barra de escala = 200 M. (F) Boca redondez. El perímetro de la abertura de la boca se traza y se muestra en rojo. CG: glándula de cemento. Barra de escala = 200 mM. <img alt = &quot;Figura 5&quot; fo: contenido-width = src &quot;5in&quot; = &quot;/ files / ftp_upload / 52062 / 52062fig5highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 5. La captura de puntos de referencia y los preliminares para el análisis morfométrico geométrico. (A) El uso de software de edición de fotos y un programa de hoja de cálculo para colocar puntos de referencia y las coordenadas de captura. (I) los cruces multicolores son los hitos colocados en la imagen con la herramienta añadir puntos en ImageJ para representar la forma de la región orofacial. (Ii) los datos de punto de interés se muestra mediante el uso de la herramienta Mostrar resultados. (Iii) los datos de Landmark se copia y se pega en una hoja de cálculo. Por encima de la segunda columna es un encabezado que identifica el número de puntos de referencia y denotado por &quot;LM = 24&quot; (caja roja). Debajo de la segunda columna de datos, la muestra se le da un nombre único y denota por &quot;ID = CON1&quot; (flecha roja). Esto se repite para todas las imágenes en un conjunto de muestras y los datos se guardan como un archivo de texto. (B) El análisis preliminar de datos en un softw morfométricos geométricason programa. (I) El archivo de texto creado desde el software de edición de fotos se importa en el programa morfométrico, MorphoJ, como un archivo de TPS. Archivo está indicado por la flecha roja. (Ii) Punto de referencia los datos de coordenadas se alinea por ajuste Procusto por ejes principales. La flecha roja indica la ejecución de la alineación. (Iii) una matriz de covarianza de Procusto ajuste de puntos de referencia se genera en el menú Preliminares. (Iv) Un archivo clasificador se crea en una hoja de cálculo. Columna A y B se dan los encabezados &quot;ID&quot; y &quot;tratamiento&quot;, respectivamente. Dado a cada muestra en la recopilación de datos histórica son de entrada del ID en la columna A, y el grupo de tratamiento al que pertenece cada muestra se introduce en la columna B. (v) El archivo clasificador se importa en el programa morfométrico como un conjunto variable de clasificador y acertaron por Identificador del conjunto de datos elegido. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52062/52062fig5highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de</a>esta cifra. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52062/52062fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. Análisis estadístico en el software morfométrico. Análisis de los componentes (A) Principales (PCA) (i) PCA se ha seleccionado en la ficha Variación. (Ii) Los dos primeros componentes principales hitos de Procusto se muestran como un diagrama de dispersión en la pestaña de calificaciones de PC. (Iii) Un menú emergente se crió en el espacio de parcela. Este menú se utiliza para cambiar los componentes principales se representa frente a la otra (flecha roja) y para colorear los puntos de datos (resaltados en azul). (Iv) Los puntos de datos son de color de acuerdo a las variables del clasificador en el menú emergente. (V) Porcentaje de varianza capturada por cada componente principal es vista en la pestaña Resultados. (B) Función discriminante Análisis (DFA) (i) de DFA se ha seleccionado en la ficha Comparación. (ii) las coordenadas Se selecciona el conjunto de datos de Procusto de DFA, y los clasificadores previamente subidos son elegidos por la agrupación. Los grupos deseados para ser comparados son elegidos y se ejecutan pruebas de permutación. (Iii) los resultados de DFA se muestran como un mapa del vector en la ficha Diferencia Forma. Un menú emergente en el espacio de parcela se puede utilizar para orientar correctamente la imagen. (Iv) Al seleccionar la pestaña Set Factor de Escala en el menú emergente, el signo del factor de escala se puede cambiar. (V) El mapa vectorial se cambia a una rejilla de transformación con el número deseado de líneas de la cuadrícula seleccionando Cambiar el tipo de gráfico en el menú emergente del mapa vectorial. (Vi) El Mahalanobis y Procusto distancias y los correspondientes valores de p son vistos en la pestaña Resultados. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52062/52062fig6highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> <imgalt = &quot;Figura 7&quot; fo: contenido-width = src &quot;5in&quot; = &quot;/ files / ftp_upload / 52062 / 52062fig7highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 7. Análisis Orofacial de control y RAR inhibió tratado embriones. (A) (i, ii) Imágenes representativas de los controles. Las barras de escala = 270 m. (Iii, iv) los embriones tratados con una concentración de 1 mM del inhibidor de RAR, BMS-453. Las barras de escala = 260 m. (I, iii) frontales vistas. Apertura de la boca se describe en los puntos rojos. (II, IV) Vistas laterales. CG:. glándula de cemento (B) orofaciales dimensiones tradicionales de control (negro) y el inhibidor (Azules) embriones tratados. (I) la longitud del hocico, en mm (ii) ancho de la cara, en mm (iii) altura de la cara, en mm (iv) ancho de la boca, en mm (v) la boca redondez, un número de unidad de menos determinada en ImageJ usando la ecuación: (4 &#8197; × &#8197; [Área]) / (π &#8197; × &#8197; [Eje Mayor] 2). (Vi) área orofacial, en mm <sup&gt; 2. Los asteriscos indican la significación según se determina mediante la prueba t de Student suponiendo una varianza desigual. Análisis de los componentes α &lt;0,05. (C) Principal. Los controles son en embriones tratados con inhibidores de negros y RAR están en azul. Las flechas negras indican los valores atípicos. PC1 = 73,63%, PC2 = 9,56%. (D) Análisis de función discriminante presentan la distancia Procrustes y p-valor, además de una rejilla de transformación. Final del círculo cerrado de vector es la posición de referencia en los embriones tratados inhibidores de RAR. El final de la línea del vector es la posición de punto de interés en los controles. Las flechas negras indican cambio de puntos de referencia nasales. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52062/52062fig7highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a>

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Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Un método para cuantificar el tamaño orofacial y la forma de los embriones de Xenopus laevis ha sido desarrollado. En este protocolo, las mediciones de tamaño tradicionales se combinan con morfometría geométrica para permitir análisis más sofisticados de desarrollo y defectos orofacial.

La cuantificación de fenotipos en Orofacial<em&gt; Xenopus</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

9.7K vistas.  Virginia Commonwealth University.  Un método para cuantificar el tamaño orofacial y la forma de los embriones de Xenopus laevis ha sido desarrollado. En este protocolo, las mediciones de tamaño tradicionales se combinan con morfometría geométrica para permitir análisis más sofisticados de desarrollo y defectos orofacial. 

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In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

En la Asamblea Vitro nucleares utilizando fraccionado extractos de huevo Xenopus

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Investigación

Biología

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Parche de grabación Clamp de canales iónicos expresados ​​en ovocitos de Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinyección de oocitos de Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualizar la localización del ARN en Xenopus Los ovocitos

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

La cuantificación de γH2AX focos en respuesta a la radiación ionizante

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic development 1, 2. One of the signaling pathways involved in this regulation is the Wnt pathway, which is used many times during embryogenesis and critical for human disease3, 4, 5. Multiple molecular components of this pathway coordinately regulate signaling in a spatially-restricted manner, but the underlying mechanisms are not fully understood. Xenopus embryonic epithelial cells is an excellent system to study subcellular localization of various signaling proteins. Fluorescent fusion proteins are expressed in Xenopus embryos by RNA microinjection, ectodermal explants are prepared and protein localization is evaluated by epifluorescence. In this experimental protocol we describe how subcellular localization of Diversin, a cytoplasmic protein that has been implicated in signaling and cell polarity determination6, 7 is visualized in Xenopus ectodermal cells to study Wnt signal transduction8. Coexpression of a Wnt ligand or a Frizzled receptor alters the distribution of Diversin fused with red fluorescent protein, RFP, and recruits it to the cell membrane in a polarized fashion 8, 9. This ex vivo protocol should be a useful addition to in vitro studies of cultured mammalian cells, in which spatial control of signaling differs from that of the intact tissue and is much more difficult to analyze.

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Xenopus embryonic ectoderm has become an attractive model for studies of cell polarity. An assay is described, in which subcellular distribution of fluorescent proteins is assessed in ectoderm cells. This protocol will help address questions related to spatial control of signaling.

Translocación polarizado de proteínas fluorescentes en Xenopus Ectodermo en respuesta a la señalización de Wnt

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi de detección para identificar fenotipos postembrionarios en C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Los trasplantes faciales en<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Los embriones

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

La<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovocitos-Cut abierta vaselina Gap Técnica Voltage-clamp Con Fluorometría

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...