VCU A. Dickinson start-up paraları bu çalışmaları destekledi. Yazarlar şematik Çizdikten onun sanatsal yetenek için Dan Nacu kabul etmek istiyoruz.

<ol>
	<li>Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleft+lip+and+palate.">Cleft lip and palate.</a> Lancet. 374, 1773-1785 (2009).</li><li>Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Median+facial+clefts+in+Xenopus+laevis:+roles+of+retinoic+acid+signaling+and+homeobox+genes.">Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes.</a> Dev Biol. 365, 229-240 (2012).</li><li>Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+Orofacial+Development+and+Median+Clefts+in+Xenopus+Laevis.">Quantitative Analysis of Orofacial Development and Median Clefts in Xenopus Laevis.</a> Anat Rec (Hoboken). , (2014).</li><li>Dickinson, A., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positioning+the+extreme+anterior+in+Xenopus:+cement+gland,+primary+mouth+and+anterior+pituitary.">Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary.</a> Semin Cell Dev Biol. 18, 525-533 (2007).</li><li>Dickinson, A. J., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+primary+mouth+in+Xenopus+laevis.">Development of the primary mouth in Xenopus laevis.</a> Dev Biol. 295, 700-713 (2006).</li><li>Dickinson, A. J., Sive, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt+antagonists+Frzb-1+and+Crescent+locally+regulate+basement+membrane+dissolution+in+the+developing+primary+mouth.">The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth.</a> Development. 136, 1071-1081 (2009).</li><li>Barnett, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syndrome+Transcription+Factor+is+critical+for+neural+crest+cell+function+in+Xenopus+laevis.">Syndrome Transcription Factor is critical for neural crest cell function in Xenopus laevis.</a> Mech Dev. 129, 324-338 (2012).</li><li>Gonzales, B., Yang, H., Henning, D., Valdez, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+characterization+of+the+Xenopus+orthologue+of+the+Treacher+Collins+syndrome+(TCOF1)+gene+product.">Cloning and functional characterization of the Xenopus orthologue of the Treacher Collins syndrome (TCOF1) gene product.</a> Gene. 359, 73-80 (2005).</li><li>Reisoli, E., De Lucchini, S., Nardi, I., Ori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+2B+receptor+signaling+is+required+for+craniofacial+morphogenesis+and+jaw+joint+formation+in+Xenopus.">Serotonin 2B receptor signaling is required for craniofacial morphogenesis and jaw joint formation in Xenopus.</a> Development. 137, 2927-2937 (2010).</li><li>Schuff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxN3+is+required+for+craniofacial+and+eye+development+of+Xenopus+laevis.">FoxN3 is required for craniofacial and eye development of Xenopus laevis.</a> Dev Dyn. 236, 226-239 (2007).</li><li>Slater, B. J., Liu, K. J., Kwan, M. D., Quarto, N., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+osteogenesis+and+suture+morphology+in+Xenopus+laevis:+a+unique+model+system+for+studying+craniofacial+development.">Cranial osteogenesis and suture morphology in Xenopus laevis: a unique model system for studying craniofacial development.</a> PLoS One. 4, (2009).</li><li>Vandenberg, L. N., Adams, D. S., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalized+shape+and+location+of+perturbed+craniofacial+structures+in+the+Xenopus+tadpole+reveal+an+innate+ability+to+achieve+correct+morphology.">Normalized shape and location of perturbed craniofacial structures in the Xenopus tadpole reveal an innate ability to achieve correct morphology.</a> Dev Dyn. 241, 863-878 (2012).</li><li>Bugaighis, I., Mattick, C. R., Tiddeman, B., Hobson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Facial+Morphometry+in+Children+with+Oral+Clefts.">3D Facial Morphometry in Children with Oral Clefts.</a> Cleft Palate Craniofac J. , (2013).</li><li>Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+anatomy+of+the+face+in+Down's+syndrome:+anthropometric+proportion+indices+in+the+craniofacial+regions.">Surface anatomy of the face in Down's syndrome: anthropometric proportion indices in the craniofacial regions.</a> J Craniofac Surg. 12, 519-524 (2001).</li><li>Scheuer, H. A., Holtje, W. J., Hasund, A., Pfeifer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognosis+of+facial+growth+in+patients+with+unilateral+complete+clefts+of+the+lip,+alveolus+and+palate.">Prognosis of facial growth in patients with unilateral complete clefts of the lip, alveolus and palate.</a> J Craniomaxillofac Surg. 29, 198-204 (2001).</li><li>Parsons, K. J., Andreeva, V., James Cooper, W., Yelick, P. C., Craig Albertson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+zebrafish+jaw:+development+beyond+the+embryo.">Morphogenesis of the zebrafish jaw: development beyond the embryo.</a> Methods Cell Biol. 101, 225-248 (2011).</li><li>Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+anatomy+of+the+face+in+Down's+syndrome:+age-related+changes+of+anthropometric+proportion+indices+in+the+craniofacial+regions.">Surface anatomy of the face in Down's syndrome: age-related changes of anthropometric proportion indices in the craniofacial regions.</a> J Craniofac Surg. 13, 368-374 (2002).</li><li>Cooper, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bentho-pelagic+divergence+of+cichlid+feeding+architecture+was+prodigious+and+consistent+during+multiple+adaptive+radiations+within+African+rift-lakes.">Bentho-pelagic divergence of cichlid feeding architecture was prodigious and consistent during multiple adaptive radiations within African rift-lakes.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Klingenberg, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+alcohol+exposure+alters+the+patterns+of+facial+asymmetry.">Prenatal alcohol exposure alters the patterns of facial asymmetry.</a> Alcohol. 44, 649-657 (2010).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+cleft+palate+in+mice+with+a+targeted+mutation+of+the+LIM+homeobox+gene+lhx8.">Isolated cleft palate in mice with a targeted mutation of the LIM homeobox gene lhx8.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 15002-15006 (1999).</li><li>Allam, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spectrum+of+median+craniofacial+dysplasia.">The spectrum of median craniofacial dysplasia.</a> Plast Reconstr Surg. , 812-821 (2011).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R., Harlard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2000).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+eggs+from+Xenopus+laevis+females.">Obtaining eggs from Xenopus laevis females.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , (1967).</li><li>Nieuwkoop, P. D. a. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metamorphosis. , (1994).</li><li>Abdi, H., Williams, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principal+Component+Analysis.">Principal Component Analysis.</a> WIREs Computational Statistics. 2, (2010).</li><li>Hill, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> P. STATISTICS: Methods and Applications. , (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Xenopus laevis gelişimsel altında yatan mekanizmaları orofasial gelişimini diseksiyon için yararlı bir araç haline gelmiştir; Ancak, kurbağa bu bölgenin büyüklüğü ve şekli değişiklikleri açıklayan hiçbir protokoller vardır şu anda. Burada anlatılan yöntemi Xenopus&#39;ta ve diğer omurgalıların orofasial fenotip daha titiz ölçümü için izin vererek orofasial kalkınma alanında önemli bir katkı sağlayacaktır. Uygun şekilde bu protokolü yürütme ilk ve en önemli yönü, hem kesin ve tekrar üretilebilir bir dönüm noktası yerleştirme yüz boyutları ölçmek ve tespit etmek için yeteneğidir. Bu amaçla, embriyonik yüzler, aynı açı, yön ve büyütme fotoğraflandı olması çok önemlidir. Yanal embriyolar işlemek ve tutarlı bir yerleşim elde etmek zor olduğu gibi, özellikle bakım, burun uzunluğu hassas ölçümler elde etmek için alınmalıdır. Tek bir kişi s tüm ölçümler yapmak sahipSonuçların tekrarlanmasını maksimize ederken ame, günün Bu tür hata en aza indirir. Iyi sonuçlar sağlanması ikinci en kritik yönü bu tür gelişimsel farklılıkların veya genetik arka plan olarak gereksiz değişkenlik, azaltılmasıdır. Ince kusurları arasında istatistiksel olarak anlamlı ölçerken önemlidir. Embriyolar, bu yüzden, muamele edilmiş ve fotoğraflandı sırasında aynı seviyede olması gerekir. Ayrıca bakım gelişim oranları ile tedavi grupları arasında eşit olduğundan emin olmak için dikkat edilmelidir. Değişkenlikle bu gibi sorunları azaltmak için, her embriyolar aynı ebeveynlerden ve deney başında eşleşen aşamada olduğundan emin olun. Ayrıca (kalabalığı engellemek, örneğin) gibi kültür yemekleri farklı tampon kaynakları ve hacimleri, embriyoların farklı sayı ve dağılımları gibi değişkenlik dış kaynaklarını azaltmak. Geometrik morfometrik yoluyla şekil değişiklikleri değerlendirilmesinde önemli bir adım Alignmen olduğunuişaretinin t Procrust uyum aracılığıyla koordine eder. Bu matematiksel bir algoritmanın, bir uygulama ile, boyut veya görüntünün dönme farklar konusunda herhangi bir bilgi çıkarılır. Dönüm yapılabilir gibi ana bileşenin veya diskriminant fonksiyon analyses- gibi istatistiksel TEKNİĞİ çok değişkenli hangi veri kümesindeki tüm embriyolar arasında yer koordinatları sonradan oluşturulan kovaryans matrisi unstandardized korelasyonu belirler. Temel bileşenler analizi (PCA) temel bileşenler 26 olarak adlandırılan değişkenler küçük bir set karmaşık bir örnek azaltır. Birinci bileşen kalanı için hesap, her takip eden bileşen, numune kümesi içinde en fazla değişime oluşturmaktadır. Birbirleri ile morfometrik yazılımlara karşı ilk iki bileşeni, birlikte küme en benzer örnekleri komplo ile. Aynı zamanda bunların içindeki değişikliklerin belirlenmesi sırasında bu şekilde, ana bileşen, bir dizi örnek içindeki grupları ayırt etmektedir. Some olgu, grupları birbirinden açıkça ayırt edilebilen ve ya da her iki eksen boyunca üst üste olmayabilir. Bu durumda, grupların ayrımcılığa tarafından hangi ince özelliklerini ortaya çıkarmak amacıyla (örneğin, PC3 için) diğer bileşenleri çizmek avantajlıdır. Toplam varyans daha eşit ilk birkaç değişkenler arasında dağıtılır Bu özellikle ilgilidir. Procrust uygun verilerin diskriminant fonksiyon analizi (DFA), bir veri kümesindeki örnekler etkili onları tanımlamak Sürekli değişkenler tarafından gruplara ayrımcılık olup olmadığını belirler. Bu nedenle numuneler analiz öncesi grupta sınıflandırılır, ve değişkenler gruplar 27 arasındaki istatistiksel ilişkiyi belirlemek için diskriminant fonksiyonları adı verilen bileşenlerden çevrilmiştir. Bu analizi çalıştırmadan önce, bu permütasyon testlerinin sayısını belirtmek için önemlidir. Bu permütasyon testlerinin dağıtımı konusunda herhangi bir varsayımlar giderilmesini öyle ki verileri rastgeleted. Daha permütasyon testi tekrarlamalar p-değerinin doğruluğunu artırmak. Bir dönüşüm ızgara olarak görünür olduğunda, grup arasında merkezi nokta konumunda önemli değişiklikler görüntülenir kıyaslanmaktadır. Şekil değişiklikleri meydana nerede Dahası, ızgara çözgü desen ortaya koymaktadır. Bu analizin dezavantajı sadece iki grubun karşılaştırılmasında kullanılacak olmasıdır. Karşılaştırma için bir örnek sette üç veya daha fazla gruplar varsa, bu kanonik değişken analizi yapmak daha iyidir. Bu, bir istatistiksel p değeri oluşturur ki bir DFA&#39;ya benzer; Bununla birlikte, bu kümedeki gruplar arasında meydana gelen ek olarak açıklanan bütün numune üzerinde meydana gelen değişiklikleri gösterir. Bu orofasial ölçüm protokolün önemli kısıtlılığı, sadece iki-boyutlu veri uygulanabilir olmasıdır. Bizim gelecek hedefleri üç-boyutlu veri analizi için benzer yöntemler geliştirmek CT tarama veya konfokal mikroskopi kullanılarak içerir. Diğer taraftan,iki boyutlu görüntüleri ile çalışan da bu protokolün önemli güçlerinden biridir. Kameralar ile donatılmış, sadece temel stereoskop embriyonik yüz görüntüleri yakalamak için ihtiyaç vardır. Maliyetlerini düşürürken veri analizi için kullanılan Openware de bu yöntemin erişilebilirliğini artırır. Bundan başka, sofistçe görüntüleme, istatistik analizler veya bilgisayar programlama ileri bir bilgi veri anlamlı ve önemli sonuçlar elde etmek için gerekli değildir. Aslında bu yöntem halen biyoloji VCU bölümünde bir lisans laboratuvar dersinin bir parçası olarak öğretilir ediliyor. Dolayısıyla, burada sunulan orofasial miktar protokol öğrenmek ve kısa bir süre içinde uygulamak kolaydır. Bir video gösterimi olarak, bu tür yazılımları embriyoların yerleştirilmesi ve navigasyon gibi kritik adımlar başarıyla bile eğitimsiz öğrencileri ve araştırmacılar tarafından kullanılabilir protokolü sağlamak için vurgulanır. Özetle, bu protokol değerli bir kaynak sağlayacaktıraraştırma toplum için ve bir öğretim aracı olarak.

Insan doğum defektleri en sık ve yıkıcı türleri arasında böyle orofasial yarıkların 1 olarak ağız ve yüz etkileyen olanlardır. Malforme orofasiyal yapıları ile çocukların yaşamları boyunca birden fazla ameliyat geçiren ve yüz disfigurements, konuşma, işitme ve yeme sorunları ile mücadele. Bu nedenle, Kranyo- ve orofasyal gelişiminde yeni araştırmalar kolaylaştırmak insanlarda doğum kusurları bu tür önlenmesi ve tedavisi için çok önemlidir. Xenopus laevis kraniofasyal gelişimi yöneten mekanizmalar diseksiyon için yeni bir araç olarak ortaya çıkmıştır (bazı örnekler 2,3,4 dahil -11). Bu nedenle, bu türün baş geliştirme ve yüzü boyunca boyut ve şekil değişiklikleri analiz etmek için bir miktar belirleme yöntemi 3 çok güçlü olabilir. Burada, biz böyle bir yöntem mevcut; Bir Xenopus çalışmada 12 uyarlanmıştır geometrik morfometrik geleneksel boyut ölçümlerinin bir araya getirilmesiyle </İnsan yüz formu 13-15 analiz eden çalışmaların sup&gt; ve bir servet. Bu protokolün amacı, araştırmacılar, normal ve anormal gelişim sırasında farklı orofasial fenotipleri arasında ayrım yüz boyut ve şekil ölçmek için izin vermektir. Bu analiz, genler ve / veya çevresel faktörlerin sinerjistik etkilerinden kaynaklanan bu gibi ince kraniofasyal kusuru arasındaki farkı daha iyi sağlayacaktır. Ayrıca, bu ölçme yöntemi de orofasial kusur bile hafif bir iyileşme veya kurtarma ortaya koyabilir. Bu nedenle muhtemel terapötik analiz etmede yararlı bir rehber yapar. Sunduğumuz yüz ölçümleri ve geometrik morfometrik kombinasyonu genelde sadece bir ya da diğer 15-18 kullanmak büyüklüğü ve mevcut protokoller daha orofasial bölgenin şekli hem daha kapsamlı istatistiksel analiz sağlar. Ayrıca, biz medial ve lateral uçakları hem değerlendirmek için basit bir yol sunmakmevcut çalışmalarda 13,19 kullanılan gelişmiş üç boyutlu görüntüleme ekipmanı gerektirmeden yüzü. Biz Xenopus Bu protokol anormal orofasial geliştirme ve bir orta yarık damak 2,3 oluşturan bir retinoik asit reseptörü inhibitörü ile işlemden geçirildi embriyolar laevis göstermektedir. Bu embriyolar oral bölgede boyutları ve şekli Niceleme içindeki damak yarıkları ve fare modellerinde 20,21 insanlarda benzer olan orta yüz değişiklikler açığa çıkarmıştır. Bununla birlikte, bu protokol, örneğin büyüme faktörleri gibi doğal maddeler, herbisitler, veya proteinler gibi orofasyal geliştirilmesi için diğer bileşiklerin etkisini değerlendirmek için kullanılabilir. Bundan başka, kayıp ya da fonksiyon deneylerinin kazancı ile gen ekspresyonunun pertürbasyon kaynaklanan orofasial boyut ve şekil değişiklikleri, (antisens morpholinos veya Crispers kullanarak / Talens) da bu protokol kullanılarak tayin edilebilir. Son olarak, bu yöntem, karakteristiklerin geliştirilenLly Xenopus morfolojisi değerlendirilmesi; Bununla birlikte, kolaylıkla bir omurgalının analizi için modifiye edilir. Diğer uygulamalar da evrimsel ve ekolojik çalışmalar için yakından ilişkili türlerin karşılaştırıldığı için bu protokolü kullanarak içerebilir. Burada temin örneğin oral bölgede analizini tarif etmek için bu protokolü kullanır iken, kolaylıkla diğer bölgelerde, organlarda ya da yapıların analizi için modifiye edilebilir. Bu orofasial ölçümü protokol araştırma toplum için değerli bir kaynak, hem de bir video gösterisi olarak lisans öğrencileri için mükemmel bir eğitim aracı olacaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="818">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:304px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:143px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:236px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>fitted with AxioCamICC1 camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 Inox forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile, disposable scalpel</td>
			<td>Sklar</td>
			<td>06-2015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">24-well plate</td>
			<td style="width:143px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">087721</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:304px;">Standard Disposable transfer pipettes</td>
			<td style="width:143px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">13-711-7M</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">150 mm X 15 mm Petri dishes</td>
			<td style="width:143px;">Falcon</td>
			<td style="width:136px;">351058</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Incubators</td>
			<td style="width:143px;">Ectotherm</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:236px;">set to 15C or 20C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:304px;">Modeling Clay</td>
			<td style="width:143px;">Premo, or other non-toxic modeling clay</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:236px;">in black or white</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Straight teasing needle</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">19010</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:304px;">Capillary Tubing (for needles)</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-1</td>
			<td style="width:236px;">Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber, 100 mm each</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:304px;">Needle Puller, Model P-97&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sutter Instrument Co,&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B</td>
			<td style="width:236px;">For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:304px;">Pipettemen</td>
			<td style="width:143px;">Gilson</td>
			<td style="width:136px;">F144802, F123600, F123602</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">BMS-453</td>
			<td style="width:143px;">Tocris</td>
			<td style="width:136px;">3409</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:304px;">DMSO</td>
			<td style="width:143px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:136px;">AB00435-01000</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Cysteine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">52-90-4</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Paraformaldehyde powder</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">158127</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:304px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:143px;">Falcom</td>
			<td style="width:136px;">353003, 351058</td>
			<td style="width:236px;">100 mm diameter and 150 mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:143px;">VWR</td>
			<td>89125-170</td>
			<td style="width:236px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of orofacial phenotypes in xenopus

Xenopus kraniyofasiyal gelişimi ve kusurları yöneten mekanizmaların diseksiyon için önemli bir araç haline gelmiştir. Orofasyal gelişimini ölçmek için bir yöntem olup, genetik veya moleküler gen ekspresyonunu ve protein işlevini değiştirmek mümkün olan maddeler ile kaldırılması üzerine orofasial fenotipleri daha titiz analizi için izin verir. Embriyonik başkanlarının iki boyutlu görüntülerini kullanarak, geleneksel boyutların-gibi orofasyal genişlik, yükseklik ve alan-ölçülür. Buna ek olarak, embriyonik ağız açıklığı bir yuvarlaklık ölçü ağız şeklini tarif etmek için kullanılır. Bu iki boyutlu görüntü Geometrik Morfometri da oral bölgede şeklindeki değişiklikler arasında daha sofistike bir görünüm temin etmek üzere gerçekleştirilir. Merkezi orofasial bölgedeki belirli noktalara atanan ve koordinatlar oluşturulur. Bir ilke bileşen analizi, daha sonra tedavi ayrımcılık ilkesi bileşenleri dönüm koordinatları azaltmak için kullanılırgrupları. Bu sonuçlar benzer orofasiyal şekilleri ile bireylerin birlikte küme hangi bir dağılım grafiği olarak gösterilir. Ayrıca istatistiksel olarak iki tedavi grubu arasındaki yerlerinden pozisyonlarını karşılaştıran bir diskriminant fonksiyon analizi yapmak için yararlıdır. Bu analiz, dönüm pozisyonda değişiklikler vektörler olarak görülen bir transformasyon ızgara üzerinde gösterilir. Bir ızgara, bir eğirme düzeni önemli bir merkezi nokta pozisyonları değişti yeri göstermek için görüntülenen ve böylece bu vektörlerin bindirilir. Ayırt edici fonksiyon analizinde, şekil değiştiren bir istatistiksel ölçüme dayanmaktadır ve bu nedenle, bir p-değeri ile değerlendirilebilir. Bu analizi sadece bir Stereoskop ve ücretsiz bir yazılım gerektirmeden, basit ve erişilebilir ve böylece değerli bir araştırma ve öğretim bir kaynak olacaktır.

Burada, orofasyal boyut ve şekilde olan bir miktarsal analizi, tedavi edilmeyen kontroller için retinoik asit reseptörü inhibitörü (RAR inhibitörü) ile işlemden geçirildi embriyolar karşılaştırma gösterilmiştir. Embriyolar, 30 (26-35 HPF) için aşamasında 24 bu kimyasal inhibitörünün 1 uM konsantrasyon ile muamele yıkanmış ve aşama 42 (82 HPF) sabitlenmiştir. Daha sonra işlenmiş ve protokolde tarif edildiği gibi analiz edildi. Sonuçlar, orijinal veri, ancak önceki yayınlarda 2,3 gözlemleri ile tutarlıdır. Kontrol embriyoları araç, DMSO ile muamele edilmiş ve (Şekil 7ai ii) normal olarak geliştirilmiştir. (Şekil 7Aiii, iv) ile daha fazla üçgen şekilli ve RAR inhibitörünün 1 uM konsantrasyon ile muamele Embriyolar yüz, göz anomalilerinin küçük bir daralma gösterdi ve bu açma bozuk bir embriyonik ağzı. İlk olarak, geleneksel bir hastanın ağız boyutları ölçülmüştür ve Şekil 7B &#39;de özetlenmiştir. S<html> tatistical önemi her ölçüm için inhibitör tedavi embriyo ve kontroller arasındaki eşitsiz varyans varsayılarak bir Student t-testi ile belirlendi. Biz burun uzunluğu ve yüz genişliği her iki grupta anlamlı derecede RAR inhibitör tedavi embriyolarda azaldığı bulundu (sırasıyla p değerleri = 0.0062 ve 0.0058; Şekil 7Bi, ii). Yüz yüksekliği ve ağız yuvarlaklık anlamlı artarken (p-değerleri = x 10 -6 3,7772, 1,4812 x 10 -7), ağız genişliği önemli ölçüde azalmıştır (p-değeri = 2,5175 x 10 -10; Şekil 7Biii-v) .The (Şekil 7Bvi p değeri = 0,3754) sonuçları iki grup arasında genel orofasial alanda önemli bir farklılık göstermedi. Bu veriler embriyonik ağız açıklığının bir kısa burnu kalkınma sonuçlarında belirli bir zamanda retinoik asit sinyal kaybı, orta yüz bölgesi hafif daralma ve malformasyon göstermektedir. nt &quot;&gt; azaltılmış retinoik asit sinyallere yanıt olarak embriyonik oral bölgede şekil değişiklikleri sofistike bir görünüm sağlamak için, biz sonraki geometrik morfometrik. belirlenmesi ve morfometrik analiz yazılımı kullanılarak orofasial işaretlerini hizalayarak, biz sonra her içindeki değişimini incelendiğinde analizleri kullanılmıştır İlk iki temel bileşenlerin birbirleri, RAR inhibitör tedavi embriyoların karşı çizilen edildiğinde temel bileşen analizi (PCA) aracılığıyla grup. PY1 ekseni (Şekil 7C) boyunca kontrollerden açıkça ayırt edildi. Bu test aynı zamanda örnek düşümünden değerlendirmeye alınması gösterdi grubundan (Şekil 7C, oklar) geri kalanı ile küme olmayan iki inhibitörü uygulanmış embriyolarda açıklanacaktır. Sonraki, RAR inhibitör tedavi embriyo ve kontroller arasında oral bölgede şeklinde istatistiksel fark değerlendirildi ve ayırt edici bir fonksiyon analizi (DFA) yapılarak görüntülendi. Procrust mesafesi, between iki grup arasında farklı değildi (mesafe = 0,2665, p-değeri &lt;0.0001, Şekil 7D), retinoik asit sinyal bozulur orofasial şekli bir değişiklik göstermektedir. Gerçekten de, hastanın ağız bölgesinde yanal yerlerinden pozisyonda önemli değişimlerin inhibitör muamele edilmiş embriyolar (Şekil 7D) &#39;de yüksekliğine karşılık gelen yüz şekli bir daralma gösterir. Buna ek olarak, nazal noktalarına (Şekil 7D, oklar) konumunda hafif dışarıya doğru burun azalmış büyümesinin ile tutarlıdır Bu embriyolar burun deliği pozisyonda anormallik ortaya koymaktadır. Bu açma üçgen şekilli bir ağız formasyonunu yansıttığı ağız açıklığı göstermek konumu değişir kenarlarını oluşturan işaretlerindeki değişimler önceki çalışmalarda 2,3 bildirilen medyan yarık ile tutarlıdır. Vektör değişikliklere ek olarak, dönüşüm ızgara desenli örgü Ayrıca şekil değişikliklerini göstermektedir ya daofacial bölgesi. Orta yüz bölgesinde Çözgü azalma retinoik asit sinyalleri (Şekil 7D) embriyo görülen orta yüzde hipoplazi ve genel olarak yüz daralma ile tutarlıdır. Diskriminant fonksiyon analizi sonuçları (DFA) yeterince yalnız geleneksel ölçülerinin tarafından yakalanan değildir bazı değişiklikler ortaya şekli bizim nitel analizler ile uyumlu idi değişiklikleri yanı sıra gösterir. Orofasial alan kontrol grubu arasında anlamlı farklılık yoktu ve embriyolar (Şekil 7Bvi) tedavi inhibitörü iken Örneğin, DFA dönüşüm ızgara inhibitör tedavi embriyoların (Şekil 7A, D) görülen yüz daralması ile tutarlı bu bölgede dramatik değişiklikler saptandı. Ayrıca, biz ağız yuvarlaklık gördüğümüz önemli bir değişiklik ile birleştiğinde ağız açıklığının çözgü desen ve dönüm noktası vardiya, inhibitör tedavi Embry şekil açılış ağız malformasyon göstermektediros. Retinoik asit sinyalleri disrupsiyon Özet olarak, yüz boyutları ve geometrik morfometrik analizi geleneksel ölçümlerinin bir birleşimi şeklinde ve oral bölgede boyutundaki değişiklikleri göstermektedir. <img alt="Şekil 1," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52062/52062fig1highres.jpg" width="500" /> 1. Gerekli malzemeler Şekil. Veri analizi için (A) Araçlar. (I) 24 oyuklu plaka, (ii), standart tek transfer pipeti, (iii) Dumont 5. Inox forseps, (iv) bir kil kaplı Petri kabı, (h) düz alay iğne, (vi) bir cam pipet aracı, (vii ) steril, tek neşter. kil kaplı tabak (B) hazırlanışı. (I) bir doğrudan takılma iğne kil yatay çizgi çizmek için kullanılır. (Ii) bir cam pipet aracı, her bir yay sırası boyunca dairesel girintiler yapmak için kullanılır. (Iii) yemek görüntüleme için PBT ile doldurulur. sayfa = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Şekil 2," fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52062/52062fig2highres.jpg" width="300" /> Xenopus yumurta vitro fertilizasyon ve kültürde Şekil 2.. HCG enjeksiyonundan (a) yetişkin Xenopus dişiler yumurtalarını için indüklenir laevis. (B), yumurta, standart yöntemler kullanılarak, yüksek tuz MBS toplanan bir erkeğe ekstre testis ile gübrelenmiş ve kültürlenir. (C), embriyolar, bir transfer edilir bir standart tek transfer pipeti kullanarak 0.1 x MBS ihtiva eden 24 oyuklu bir çanak. (D) kalibre edilmiş bir pipet kişilik bir boş kuyuya 1 mi ölçmek için kullanılan ve bir belirteci olan tüm oyuklara dış tarafı üzerinde bu seviyede ayırmak için kullanılır içeren embriyolar (ek). 0.1x MBS sonra eklenir veya bu işareti seviyede olacak şekilde elinden alınır. highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Görüntüleme için embriyo kafaları 3. hazırlanması Şekil. Kafaları, düz siyah çizgileri kaldırmak için gereken iki insizyon (A) Diyagram. Ölçek bar = 400 mikron. (B) ilk kesi neşter gelen kuyruk ve bırakma basıncı kaldırmak için bağırsak arka sonunda yapılır. Ölçü bar = 400 um. (C) ikinci bir kesik tamamen baş ayırmak için, kalbe yakın bağırsak, anterior ucunda yapılır. Ölçek bar = 400 mikron. (D) kil yerleştirilmiş embriyo başkanları satır önden manzarası. Ölçek bar = 650 mikron. (E) kil embriyo başkanları pozisyon satır Yanal manzarası. Ölçek bar = 500 mikron cg: çimento bezi. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52062/52062fig4highres.jpg" width="500" /> Orofasial boyutları 4. Geleneksel boyutu ölçümleri Şekil. (A), </strong&gt; Yüz genişliği. Oklar göz ventral kısmı yüzün çevresi uygun noktalarını belirtir. Kırmızı çizgi bu noktalar arasındaki mesafe olarak ölçülen yüz genişliği vardır. Ölçek bar = 210 iM. (B) Yüz yüksekliği. Beyaz çizgiler gözlerin dorsal kenarında ve çimento bezin dorsal kenarında ölçümden önce çizilmiş kılavuzları bulunmaktadır. Kırmızı çizgi yüz orta hatta bu iki kılavuz arasındaki mesafe olarak ölçülen yüz yüksekliği vardır. Ölçek bar = 210 iM. (C) Orofasial alanı. Beyaz çizgiler ölçümden önce çizilmiş kılavuzları bulunmaktadır. Alt kılavuz sol göz ventral kenarına buluştuğu (a) yöneltin. Kırmızı çizgi, sol göz çevresinde izlemeyi gösterir. Gözün dorsal kenar üst kılavuzunu buluştuğu (b) yöneltin. Mavi çizgi gözlerin dorsal kenarında üst kılavuz boyunca takip orofasial alan dorsal sınırını gösterir. Üst kılavuz sağ yüz çevresini karşılar (c) Nokta. Yeşil çizgi gösterileriGöz çevresine doğru izleme. Sağ gözün ventral kenar alt kılavuzunu karşılar (d) Nokta. Sarı çizgi çimento bezinin dorsal kenarında alt kılavuz boyunca takip orofasial alan ventral sınırı gösterir. Ölçü bar = 210 uM. (D) Vücut boyu. Beyaz hattı gözün ön kenarı ve ölçümden önce bir kılavuz şeklinde çizilir. Kırmızı çizgi çimento bezi dorsal kenar yüzün yanal çevresini birleştiği noktada bu çizgisine göre ölçüldüğünde, burun uzunluğu vardır. Ölçek bar = 300 iM. (E) Ağız genişliği. Oklar noktaları nerede dorsal ve ventral dudaklar buluşuyor. Kırmızı çizgi, bu iki nokta arasındaki mesafe olarak ölçülen ağız genişliği vardır. Ölçek bar = 200 iM. (F) Ağız yuvarlaklık. Ağız açıklığı çevre takip ve kırmızı gösterilir. cg: çimento bezi. Ölçek bar = 200 mcM. <img alt = &quot;Şekil 5&quot; fo: içerik-width = &quot;5in&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52062 / 52062fig5highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Şekil 5. geometrik morfometrik analiz için işaretlerini ve preliminaries yakalama. (A) işaretlerini ve yakalama koordinatlarını yerleştirmek için fotoğraf düzenleme yazılımı ve bir elektronik tablo programı kullanarak. (I) Çok Renkli haçlar orofasial bölgenin şeklini temsil ImageJ Ekle puan aracını kullanarak resmin üzerine yerleştirilen yerler vardır. (Ii) Landmark veri Sonuçları Göster Aracı&#39;nı kullanarak görüntülenir. (Iii) Landmark veriler kopyalanacak ve bir elektronik yapıştırılır. İkinci sütunda yukarıda yerlerinden sayısını belirleme ve &quot;LM = 24&quot; (kırmızı kutu) tarafından gösterilen bir başlığıdır. Verilerin ikinci sütununda Aşağıda, örnek bir benzersiz bir ad verilir ve &quot;ID = CON1&quot; (kırmızı ok) ile gösterilir. Bu bir örnek kümesindeki tüm görüntüler için tekrarlanır ve veri bir metin dosyası olarak kaydedilir. Geometrik morfometrik ğ i (B) Ön veri analiziprogram vardır. (I) fotoğraf düzenleme yazılımlarının oluşturulan metin dosyası, bir TPS dosyası olarak, morfometrik programa, MorphoJ alınır. Dosya kırmızı ok ile gösterilir. (Ii) Landmark koordinat verileri temel eksenleri Procrust oturması ile hizalanır. Kırmızı ok uyum yürütülmesini gösterir. (Iii) Procrust uygun yerlerinden bir kovaryans matrisi Ön Elemeleri menüsünde oluşturulur. (Iv) Bir sınıflandırıcı dosya bir elektronik oluşturulur. Sütun A ve B, sırasıyla başlıkları &quot;İD&quot; ve &quot;tedavi&quot;, verilir. Her bir numune ait kimliklerinin dönüm veri toplama her bir örnek için vardır verilen A sütununda altında girdi, ve tedavi grubu B sütununda (v) sınıflandırıcı dosya sınıflandırıcı değişken seti olarak morfometrik programına aktarılır ve Sıralar olduğu girilir Tanımlayıcı tarafından seçilen veri seti için. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52062/52062fig5highres.jpg" target="_blank">daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız</a>Bu rakam. <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52062/52062fig6highres.jpg" width="500" /> Morfometrik yazılım 6. İstatistiksel analiz Şekil. (A) Temel Bileşen Analizi (PCA) (i) PCA Çeşitleme sekmesinden seçilir. (Ii) Procrust yerlerinden ilk iki temel bileşenleri bilgisayar puanları sekmesinde bir ScatterPlot olarak görüntülenir. (Iii) bir pop-up menü arsa alana kadar getirdi. Bu menü birbirlerine (kırmızı ok) karşı grafiğe temel hangi bileşenleri değiştirmek için ve (mavi vurgulanan) veri noktalarını renklendirmek için kullanılır. (Iv) veri noktaları açılır menüden sınıflandırıcı değişkenlere göre renklidir. Her ana bileşeni tarafından yakalanan varyans (v) Yüzde Sonuçlar sekmesinde görülüyor. (B) Diskriminant Fonksiyon Analizi (DFA) (i) DFA Karşılaştırma sekmesinden seçilir. (ii) Procrust veri seti DFA için seçilen koordinatları ve önceden yüklenen sınıflayıcıları gruplandırmak için tercih edilmektedir. Karşılaştırılacak olan grupları seçilir ve permütasyon testler çalıştırılır. (Iii) DFA sonuçları Şekil Fark sekmesinde bir vektör haritası olarak gösterilir. Arsa uzayda bir pop-up menü doğru görüntüyü yönlendirmek için kullanılabilir. (Iv) açılır menüsünden Set Ölçek Faktörü sekmesini seçerek, ölçek faktörünün işareti değiştirilebilir. (V) vektörü haritası vektör haritanın açılır menüsünde Graph Tipini Değiştirmek seçerek çizgilerin istenilen sayıda bir dönüşüm ızgara değiştirilir. (Vi) Mahalonobis ve Procrust mesafeleri ve ilgili p-değerleri Sonuçları sekmesi altında incelendi. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52062/52062fig6highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <imgalt = &quot;Şekil 7&quot; fo: içerik-width = &quot;5in&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52062 / 52062fig7highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Kontrol ve RAR Şekil 7. Orofasial analizi embriyolar tedavi önledi. (A), (I, II) kontrol Örnek görüntüler. Ölçek çubukları 270 mikron =. (III, IV) Embriyolar ve RAR inhibitörü, BMS-453, 1 uM konsantrasyonu ile muamele edilmiştir. Ölçek çubukları 260 mikron =. (I, iii) görüşlerini Frontal. Ağız açıklığı kırmızı noktalar özetlenmiştir. (Ii, iv) Yan bakıldı. cg:. çimento bezi (B) kontrol Geleneksel orofasial boyutları (siyah) ve (mavi) embriyolar tedavi inhibitörü. Mm mm, (ii) yüz genişliği (i) Vücut boyu, (iii) yüz yükseklik, mm (iv) ağız genişliği, mm olarak (h) ağız yuvarlaklığı denklem kullanılarak ImageJ belirlenen bir birimsiz sayısı: (4 &#8197; × &#8197; [Alan]) / (π &#8197; × &#8197; Mm [ana ekseni] 2). (Vi) Orofasial alanı, <sup&gt; 2. Eşitsiz varyans varsayılarak Student T-testi ile belirlenen yıldızlarla önemini göstermektedir. α &lt;0.05. (C) Temel Bileşen Analizi. Kontroller siyah ve RAR inhibitör tedavi embriyolarda olan mavi vardır. Siyah oklar outliers gösterir. PC1 = 73,63,% PC2 = 9.56%. (D) dönüşüm ızgara ek olarak Procrust mesafe ve p-değeri gösteren ayırıcı fonksiyon analizi. Vektör Kapalı daire bitiş RAR inhibitör tedavi embriyolarda dönüm noktası konumudur. Vektörün hattının ucu kontrollerde dönüm pozisyondur. Siyah oklar burun işaretlerinde kayma göstermektedir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52062/52062fig7highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus at JoVE.com

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Xenopus laevis embriyoların hastanın ağız boyutunu ve şeklini ölçmek için bir yöntem geliştirilmiştir. Bu protokol, geleneksel boyutu ölçümleri, hastanın ağız geliştirme ve kusur daha sofistike analizlerine olanak sağlamak için geometrik morfometrik ile birleştirilir.

Orofasial fenotipleri Niceleme<em&gt; Xenopus</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

quantification-of-orofacial-phenotypes-in-xenopus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

9.7K Görüntüleme.  Virginia Commonwealth University.  Xenopus laevis embriyoların hastanın ağız boyutunu ve şeklini ölçmek için bir yöntem geliştirilmiştir. Bu protokol, geleneksel boyutu ölçümleri, hastanın ağız geliştirme ve kusur daha sofistike analizlerine olanak sağlamak için geometrik morfometrik ile birleştirilir. 

Video: Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Vitro Nükleer Meclisi fraksiyonlara Xenopus Yumurta ayıklar kullanma

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Biyoloji

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Xenopus Oosit ifade İyon Kanalları Patch Kelepçe Kaydı

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Xenopus laevis Oosit, Mikroenjeksiyon

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Görselleştirme RNA Yerelleştirme Xenopus Oosit

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

İyonlaştırıcı Radyasyon Cevabı γH2AX Foci Kantitasyonu

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic development 1, 2. One of the signaling pathways involved in this regulation is the Wnt pathway, which is used many times during embryogenesis and critical for human disease3, 4, 5. Multiple molecular components of this pathway coordinately regulate signaling in a spatially-restricted manner, but the underlying mechanisms are not fully understood. Xenopus embryonic epithelial cells is an excellent system to study subcellular localization of various signaling proteins. Fluorescent fusion proteins are expressed in Xenopus embryos by RNA microinjection, ectodermal explants are prepared and protein localization is evaluated by epifluorescence. In this experimental protocol we describe how subcellular localization of Diversin, a cytoplasmic protein that has been implicated in signaling and cell polarity determination6, 7 is visualized in Xenopus ectodermal cells to study Wnt signal transduction8. Coexpression of a Wnt ligand or a Frizzled receptor alters the distribution of Diversin fused with red fluorescent protein, RFP, and recruits it to the cell membrane in a polarized fashion 8, 9. This ex vivo protocol should be a useful addition to in vitro studies of cultured mammalian cells, in which spatial control of signaling differs from that of the intact tissue and is much more difficult to analyze.

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Xenopus embryonic ectoderm has become an attractive model for studies of cell polarity. An assay is described, in which subcellular distribution of fluorescent proteins is assessed in ectoderm cells. This protocol will help address questions related to spatial control of signaling.

Floresan Proteinleri Polarize Translokasyon Xenopus Wnt Sinyalizasyonu Cevabı Ektoderm

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Yüz Nakli<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyolar

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

<em&gt; Xenopus</emFluorometri ile&gt; Yumurta Kes-açık Vazelin Gap Gerilim-kelepçe Tekniği

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...