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膵臓がんは、依然として治療が最も困難ながんの1つです。したがって、治療効果を評価する前臨床モデルが再現性があり、臨床的に関連性があることが重要です。このプロトコールは、再現性があり、臨床的に関連性のある線維形成性スフェロイドを生成するための簡単な共培養手順を説明しています。
膵管腺がん(PDAC)は、5年生存率が<12%の最も致命的ながんの1つです。治療の最大の障壁は、腫瘍を取り囲み、血管新生を減少させる高密度の線維形成性細胞外マトリックス(ECM)であり、一般にデスモプラスラと呼ばれます。がんの治療には、さまざまな薬剤の組み合わせや製剤が試験されており、その多くは前臨床で成功を収めていますが、臨床的には失敗しています。したがって、治療に対する腫瘍の反応を予測できる臨床的に関連性のあるモデルを利用できるようにすることが重要になります。このモデルは、切除された臨床腫瘍に対して以前に検証されています。ここでは、頑健なECMを自然に生成でき、その成長をサポートするための外部マトリックスソースや足場を必要としない、線維形成性三次元(3D)共培養スフェロイドを成長させるための簡単なプロトコルについて説明します。
簡単に説明すると、ヒト膵臓星状細胞(HPaSteC)とPANC-1細胞を使用して、それぞれ1:2の比率で細胞を含む懸濁液を調製します。細胞は、ポリHEMAコーティングされた96ウェル低接着Uウェルプレートに播種されています。プレートを遠心分離して、細胞が最初のペレットを形成するようにします。プレートは5%CO2で37°Cのインキュベーターに保存され、培地は3日ごとに交換されます。プレートを指定された間隔でイメージングして、スフェロイドの体積を測定できます。14日間の培養後、成熟した線維形成性スフェロイドが形成され(すなわち、平均体積0.048 + 0.012 mm3(451 μm x 462.84 μm))、実験的治療評価に利用できます。成熟したECM成分には、コラーゲンI、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、ラミニンが含まれます。
膵臓がんの予後不良にはさまざまな理由が関連していますが、その中には、検出が遅れる原因となる簡単に検出できるバイオマーカーがないことが挙げられます。もう一つの大きな理由は、組織を取り巻く間質が厚いため、血液供給が減少することです。大量の細胞外マトリックス(ECM)、細胞間相互作用、内皮細胞、さまざまな免疫細胞、周皮細胞、増殖性筋線維芽細胞、線維芽細胞集団、および非腫瘍細胞の存在(一緒にして線維形成反応を構成する)1が、PDACの化学療法および放射線治療耐性2の原因となる厚い間質を構成します.がん細胞と間質細胞は、複雑でダイナミックな双方向の相互作用を持っています。一部の要素は疾患の進行を弱めたり加速させたりしますが、ほとんどのプロセスは腫瘍の発生中に適応します1。これにより、成長因子、血管新生促進因子、プロテアーゼ、接着分子が豊富な環境が提供されます。これらの因子は、血管新生、細胞増殖、転移、および浸潤を促進します3,4。これらが一緒になって、腫瘍に対する免疫と薬物特権の聖域となり、薬剤耐性をもたらします。
デスモプラスラは、免疫細胞および膵臓星細胞(PSC)とともに、さまざまなECMタンパク質からなる複雑な混合物です。これらが一緒になって、細胞が成長するための足場を形成する傾向があります。PSCは、間質コンパートメント5の最大のコンポーネントの1つです。マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)、マトリックスメタロプロテアーゼの組織阻害剤(TIMP)、がん関連線維芽細胞(CAF)6などの酵素を産生する能力は、それらが線維形成反応の進行に重要な役割を果たす可能性が高いことを示唆しています。ECM、がん関連線維芽細胞(CAF)、および血管系は、PDACの主要な側面です。CAFの中で、筋線維芽細胞と炎症性CAFは、腫瘍誘発性の特性に関与する活性クロストークに関与していると推測されています7。腫瘍上の線維芽細胞形成が広範囲に及ぶほど、予後は不良になります8,9,10。
確立された細胞株による単層細胞培養は、薬物毒性を解析するための有用なツールであり続けており、概念実証や創薬研究の出発点として適しています。しかし、確立された細胞培養株には、生殖細胞DNAと臨床的関連性が欠けています11。それらは平らな表面で成長するため、腫瘍の一部である場合とは異なる in vitro 選択基準を受け、異常に分裂し、分化した表現型を失います12。全体として、シングルセル培養は腫瘍の不均一性を制限するため、臨床的関連性を失います。腫瘍の微小環境(ECMなど)の複雑さを正確に表現することはできません。3D培養は、複雑な腫瘍微小環境をより忠実に再現することができます。
3D培養は、1970年代に健康な細胞とその腫瘍性細胞に導入されました13。スフェロイド14を通じて悪性組織の形態と構造を研究するために、いくつかの技術が使用されてきた。間質細胞との共培養は、TMEシグナルをモデル化できます。EMTマーカーのアップレギュレーションは、細胞を星状細胞と共培養したときに見られた15。PDACスフェロイドと間質との相互作用は、ECMコンポーネントとの共培養によってモデル化できます。PSCと特異的に共培養すると、臨床的に関連性のある薬物細胞毒性データが得られることが報告されています16,17,18。PSCはまた、アポトーシスを回避し、さまざまなパラクリン因子19を介してがん細胞の増殖を刺激し、EMT移行を誘導することにより、薬剤耐性を助けます。したがって、薬物または薬物送達システムの成功を評価するために使用される基準に、早い段階からPSCを含めることが重要になります。膵臓癌細胞単独と比較して、PSCが増殖を促進し、組み合わせてより速い増殖をサポートする能力は、免疫不全マウスで2つの細胞株の皮下側面注射を評価したときにもin vivoで見られました20。
細胞タイプがECMコンポーネントと相互作用する能力も、共培養スフェロイドを成長させる際に考慮すべきことが重要です。BxPC-3とPANC-1は、コラーゲンへの結合において同等の親和性を有することが報告されています。2つの細胞株はラミニンにも同等に結合しますが、BxPC-3の方がよりよく結合するという報告があります21,22,23,24,25。遊走に関しては、Stahle et al.26は、BxPC-3と比較してPANC-1細胞の運動性が5倍速いことを示しました。PANC-1細胞は主に単一細胞として遊走することも報告されていますが、BxPC-3細胞は密集したシートとして遊走します。細胞の選択は、腫瘍25のサイズにも影響する。BxPC-3腫瘍は、PANC-1から得られた腫瘍よりも27.28大きいことが示されましたが、1つの研究では反対の29のケースが示されました。サイズと運動性の違いにもかかわらず、どちらの細胞もマウスで腫瘍を形成するために長期間の潜伏が必要であることが報告されています。この期間は、BxPC-3 では特に長く、4 週間から 4 か月の範囲です25。しかし、BxPC-328またはBxPC-3がん幹細胞30がより早く目に見える腫瘍を形成したという文献もあり、腫瘍の成長期間にばらつきが見られる可能性があることを示唆しています。したがって、ここに記載されている期間は、腫瘍増殖率の最初のガイドラインとしてのみ役立つはずです。
BxPC-3細胞は、表面に緩い細胞と密集したコアを持つスフェロイドを形成しますが、PANC-1細胞は、多孔質で堅牢なスフェロイド31 とコンパクトなスフェロイドの両方を形成することが報告されています。PANC-1細胞はまた、分化が少なく、より攻撃的であることが報告されています32。攻撃的な性質32 を最前線に保ち、PANC-1細胞の高い運動性、コンパクトなスフェロイドを形成する能力、およびECM成分と相互作用する能力と組み合わせて、PANC-1細胞がスフェロイド研究に選ばれました。
ここ数年、スフェロイド培養は、二次元(2D)培養と比較して、その臨床的関連性において優位性を実証することに成功しています。その関連性は、動物研究の代替としてこの技術を使用し、腫瘍の生物学をよりよく理解するために活用されています。スフェロイドの臨床的関連性は、特にPSCと共培養された場合、剛性33、TGF-βの発現34,35,36,37,38、E-カドヘリン、F-アクチン18,34,36,37、α-SMA 34,35,37などのスフェロイドのさまざまな機能を研究するためにそれらを使用することを可能にしました。38、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDHA)32、HIF-1α35,39、薬剤耐性16,37,40、細胞遊走41、細胞浸潤37、線維化35、放射線耐性42、表現型変化18、不均一性36、相互作用の細胞レベル39およびECM成分の実証37,38、39。記載されているデータを取得するために使用されたプロトコルの多くは、Matrigel、吊り下げ法、プリントされた型、またはその他の足場に依存して、スフェロイドとECMの増殖をサポートします。また、この研究では通常、非ヒト線維芽細胞または患者から新たに単離された星状細胞を使用します。腫瘍を生体内疾患に類似させるためには、星状細胞を使用することが重要であるが、新たな抽出物に関連する患者間のばらつきが、これらの研究の再現を困難にしている。
このプロトコルは、開発が容易で、再現性があり、臨床的に関連性があり、足場のないモデルを実証することを目的としており、ECMを自然に生成する共培養の能力のみに依存しています。そのために、PANC-1細胞(単一細胞として移動する自然な傾向があるため)とヒト膵臓星細胞(HPaSteC)を混合したシンプルな共培養法が選択されました。これは、幹細胞のように振る舞い、薬剤耐性が高いためです。Durymanov et al.38による研究をベースラインとして使用して、以下に詳述するプロトコルは、細胞比や培地交換間の期間などのパラメータをさらに最適化した後に確立されました。このプロトコールから得られたスフェロイドは、新薬候補評価のモデルシステムとして使用することができます40。
さらに、回転楕円体の文化に詳しくないユーザーにとっては、MISpheroIDナレッジベースの開発について論じたPeirsman et al.43の著作が参考になるかもしれない。これは、ラボプロトコル間の不均一性に対処するのに役立つ可能性のあるいくつかの最小限の情報ガイドラインを確立します。いくつかの制限はありますが、この研究は、培地、細胞株、スフェロイド形成方法、および最終的なスフェロイドサイズの選択が、スフェロイドの表現型特性を決定する上で重要であることを示しました。
1. 2D細胞培養
2. ポリ(2 -ヒドロキシエチルメタクリレート(ポリHEMA)溶液コーティング、96ウェルプレート用
3. 2D細胞培養計画
4. 3D文化の成長
図1:3D線維形成性膵臓がんスフェロイドの増殖プロセスの概要 (BioRenderを使用して生成)。この図は、関連する基本的なプロセスの概要を示しています。すなわち、細胞をトリプシンし、初期細胞数を使用して希薄な細胞懸濁液を作製し、希釈した細胞懸濁液を使用して共培養物を調製し、各ウェルに細胞懸濁液を添加し、培養物をインキュベートし、培地の維持と最終的なスフェロイド形成を14日目に期待どおりに行います。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:U底ウェルの構造。 右の画像は、井戸の「ハロー」部分を示すために誇張された形状です。この図は、ハローの上で作業することがスフェロイドの成長と偶発的な損失を避けるために重要であるため、井戸の「ハロー」部分がどこにあるかを定義することを目的としています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
5. ECM成分の評価と共焦点顕微鏡
スフェロイドの増殖に関与する最も重要な3つのステップは、初期細胞数、スフェロイドの播種中の混合ステップ、およびスフェロイドを成長させるためのタイムリーな培地交換の実施です(図1)。さらに、3日目以降のFigure 2 onのメディア変更に精通することは、ウェルあたりのメディア量の増加による効果的なメディア変更を可能にするために重要です。これらすべてのステップを指示に従って実行すると、スフェロイド(図3)は平均体積0.048±0.012mm3(451μm×462.84μm)まで成長することがわかります(図4)。 細胞がよりよく増殖する可能性がある例に遭遇し、14日目に0.096 ± 0.014 mm3(611 μm x 560 μm)の初期平均体積が増加しました。インキュベーターの温度と湿度の維持や、後の継代に比べてわずかに活力が向上する早期の細胞継代の使用など、さまざまな理由により、スフェロイドの初期体積が大きくなる可能性があります。
図3:14日目に観察された代表的なスフェロイド(サイズ:451.59 μm x 462.84 μm)。 スケールバー = 200 μm。各回転楕円体は、それぞれ最長軸と最短軸に沿って測定され、方法のセクションで説明されている式を使用して体積を計算します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:17日間にわたるスフェロイドの成長の進行。 プレート 1 と 2 は反復です。エラーバーは標準偏差を表します。この図は、6日目、10日目、14日目、17日目に見られる可能性のあるスフェロイド体積の概算値として使用できます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
しかし、細胞の計数が正しく行われなかったり、細胞懸濁液が十分に混合されていなかったり、最終培養が定期的に維持されていなかったり、これらの誤差が組み合わさって発生すると、より小さなスフェロイドや不完全な成長のスフェロイドが発生する可能性があります。同様の外観のスフェロイドは、初期の最適化研究でプレート全体ではなく、プレートの周辺部のウェル内の培地のみを3日目に補充した場合にも見られました(図5)。あるいは、細胞が十分に混合されていない場合、または最初のカウント/希釈エラーにより、推奨値よりも多くの細胞をウェルごとに播種する場合、ウェルごとに複数のスフェロイドが見られる場合があります。PANC-1:HPaSteC細胞を240:120の比率で使用した場合も同様の結果が見られました(図6)。これは、スフェロイドが方向ごとに成長する場合にも時折見られることがありますが、そのようなスフェロイドの数は少なくなります(たとえば、4/96ウェルには、ウェルごとに1つではなく2つのスフェロイドが含まれている場合があります)。複数のスフェロイドに遭遇した場合は、複数のスフェロイドがあるウェルの使用を避けるか、これらのスフェロイドが処理されているときの体積の変化をメモしてください。ピペットチップがハローの下に沈む不適切な培地交換(図1)も、スフェロイドの偶発的な紛失につながる可能性があります。
図5:14日目の増殖が不十分な回転楕円体の代表的な画像。 スケールバー = 200 μm。ここでは、細胞がうまく凝集していないため、スフェロイドの長さや幅を測定することが難しくなります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:14日目に見られる、成長が不十分な2つのスフェロイドを含む井戸の代表的な画像。 スケールバー = 200 μm。ここで、スフェロイドの1つのサイズは246.61μm×178.31μmで、もう1つのサイズは289.13μm×252.35μmです。これは、初期希釈液または実験開始に使用した細胞の品質に問題がある可能性が高い例です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
また、スフェロイドは、コラーゲンI、ラミニン、ヒアルロン酸、フィブロネクチンの4つの主要なECM成分を含むECMを発達させます。同研究室が以前に発表した研究では、PANC-1単独に対する共培養の利点は、ホモPANC-1スフェロイドが拡散性コラーゲンを示し、フィブロネクチンを示さず、ヒアルロン酸沈着が少ないという点で実証されています。
図7:未処理のスフェロイドで17日目に観察された4つの主要なECM成分の代表的な画像:コラーゲンI、ラミニン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン。 これらの画像は、スフェロイドの凍結切片を免疫染色した後に取得されます。これらの画像の明るさは、外観の違いを強調するために均一に増加しています。組織が損傷している、または欠落している領域は、強度測定が行われている間に調整する必要があります。スケールバー = 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
スフェロイドを増殖させるために選択された期間および細胞比は、以前に報告された研究に基づいていた38。これらの研究を最適化しようと、NIH3T3細胞をHPaSteC細胞に置き換えようとしたところ、スフェロイドの体積とアポトーシスパターンは、PANC-1:HPaSteC比が120:60のときに報告された最適化パラメータ(PANC-1:NIH3T3:: 120:12)と非常によく似ていることがわかりました。これらの研究では 14 日目までアポトーシスのみが測定されますが、このプロセスで説明されているプロトコルでは、14 日目から 17 日目まで破片形成の目に見える増加が観察されないため、17 日目までスフェロイドを使用し続けます。対照として、17日目に評価されたすべてのスフェロイドには、スフェロイドの体積とアポトーシスの自然な増加のベースラインとして機能する未処理のアームが常に含まれています。
スフェロイドの播種と成長のプロセスには、適切な計数、細胞の添加前の混合、培養の維持という3つの重要なステップがあります。このプロセスは少数のPANC-1およびHPaSteC細胞を使用することに依存しているため、適切な数と適切な希釈液を持つことが重要になります。これは、HPaSteC細胞がPANC-1細胞よりも小さく、細胞数を過小評価しやすいため、特に重要です。したがって、セルを慎重にカウントすることが重要です。カウントを過小評価すると複数のスフェロイドが形成され、過大評価するとスフェロイドの形成が不十分になる可能性があります。
また、すべてのステップでサスペンションをよく混合することも重要になります。細胞が沈降することを期待して作業することで、混合不足を防ぎ、細胞の均一な分布を確保するのに役立ちます。スフェロイドを複数のプレート(例えば、2つのプレート)に調製する際には、前後の混合(ステップ4.4.1)の数を各ウェル間で少なくとも20回にすることをお勧めします。これは、最初のプレートが半分完了すると 15 に減らし、次のプレートを開始すると 10 に減らし、2 番目のプレートの後半に進むと 5 に減らすことができます。ピペットで前後の混合と並行して攪拌動作を行うことで、混合の範囲を改善するのに役立ちます。考慮すべきアイデアは、2つのプレートを準備する際に2人目を巻き込むことで、速度と混合効率が向上するためです。このシナリオでは、2 人のユーザーがフードの反対側のコーナーで作業することで、個々のサスペンションとプレートで同時にフードを使用できます。
細胞培養を維持することは、スフェロイドが常に十分な栄養供給を確保できるようにする必要があります。3日目と6日目の培地サプリメントは、細胞が増殖している場所であり、十分に栄養を与える必要があるため、最も重要です。6日目と10/11日目のメディア交換も、古いメディアを捨てるために上清を採取する必要があるため、注意が必要です。この手順は、「ハロー」までメディアを静かに引き出し、それを超えないようにして慎重に行う必要があります。これにより、スフェロイドに近づきすぎることによるメディアの吸引や、メディア交換中に意図せずにスフェロイドが失われるのを防ぐことができます。
この方法は、以前に引用した方法32,34,35,36,37,39とは異なり、容易に再現可能であり、金型や足場材料を必要としないという点で大きな利点があります。さらに、使用される培地は、標準的な細胞培養培地であり、これは、EGM−2培地39、星状細胞培地の混合物、およびDMEM−FBS35または細胞型34に応じていずれかの培地単独とは対照的に、比較的安価である。この利点は、ラボ間の翻訳可能性とセットアップの容易さにおいて重要になります。このプロセスは、複数のプレートにスケールアップすることもできますが、2つのプレートごとに1人が必要になる可能性があります。また、スフェロイドの堅牢な性質により、攪拌条件下での評価も可能です。このステップは、スフェロイドが関与する細胞の薬物動態研究や、放出および吸収の探索研究に特に役立ちます。
その利点にもかかわらず、この方法の制限は、播種ステップ中に非常に徹底的な混合が必要であることです。これは時間がかかり、肉体的にも大変な作業になります。これを回避する方法として考えられるのは、播種プロセス中に一定の攪拌条件を維持するために、十分に滅菌された磁気ビーズを使用することを含むことです。回転楕円体の収集も難しく、ある程度の練習が必要です。また、スフェロイドは成長するのに時間が必要なため、培地の変更に対応するための人員と供給の可用性を確保するための慎重な計画が必要です。
結論として、臨床的に関連性のある線維形成性3Dスフェロイドを作製するためのシンプルで再現性の高い方法が開発されました。スフェロイドは堅牢で、コラーゲンI、ラミニン、ヒアルロン酸、フィブロネクチンなどのECM成分を生成することができます。これらのスフェロイドの生成に関わる単純さは、容易に再現性があり、第3の細胞株を含めるなどの変化に容易に適応できるという独自の利点を持っています。このモデルのもう一つのユニークな利点は、治療40に耐性があることです。これにより、その臨床的関連性が高まり、最も効果的な薬剤のみが選択され、前進して膵臓がんの治療に利用できるようになります。さらに、これらのスフェロイドを採取してマウスに移植し、 in vivo 解析38のための再現可能な線維形成腫瘍を与えることができ、また、前述のようにナノ粒子44の様々なサイズの浸透を調べるためにも使用することができる。
著者は何も開示していません。
記載されている研究は、サウスダコタ州知事経済開発局、サウスダコタ州評議委員会競争的研究助成プログラム(SD-BOR-CRGP)、およびサウスダコタ州立大学の薬学部の支援を受けて行われました。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Axio Observer inverted microscope | Carl Zeiss | 0450-354 | |
Cellometer Auto T4 | Nexcelom Bioscience LLC | Auto-T4 | |
DMEM, powder, high glucose | Gibco | 12100046 | |
Donkey anti-sheep conjugated with Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175712 | |
Fetal Bovine Serum | Cytiva | SH3091003HI | |
Goat antirabbit IgG labeled with Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175145 | |
Human Pancreatic Stellate Cells (HPaSteC) | ScienCell | 3830 | |
Microscope Nikon | Nikon | Eclipse Ts 100 | |
Nunc 96-Well Polystyrene Round Bottom Microwell Plates | Thermo Scientific | 12-565-331 | |
Olympus Fluoview FV1200 confocal laser | Olympus | N/A | Discontinued product |
PANC-1 | ATCC | CRL-1469 | |
Poly-HEMA | Sigma | P3932 | |
Rabbit polyclonal anti-laminin antibodies | Abcam | ab11575 | |
Rabbit polyclonal anti-type I collagen antibodies | Abcam | ab34710 | |
Sheep polyclonal anti-hyaluronic acid antibodies | Abcam | ab53842 | |
Stellate cell media complete kit | ScienCell | 5301 | |
Trypsin | MP Biomedicals, LLC | 153571 | Trypsin solution prepared according to manufacturers protocol and used at 0.25%w/v |
Trypsin Neutralization Solution (TNS) | ScienCell | 103 |
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