遺伝子機能解析のためのダイズ毛状根形質転換

ここでは、トランスジェニックダイズ毛根の高効率生産のためのプロトコルを提示します。

大豆(グリシンマックス)は、何千もの産業用途を持つ農業における貴重な作物です。ダイズの根は、窒素や病原菌を固定するために共生する土壌微生物との相互作用の主要な場所であり、ダイズの根の遺伝学を含む研究は、その農業生産を改善するために最も重要です。ダイズ毛状根(HR)の遺伝子形質転換は、 アグロバクテリウム・リゾゲネス NCPPB2659株(K599)によって媒介され、ダイズ根の遺伝子機能を研究するための効率的なツールであり、開始から終了までわずか2か月かかります。ここでは、ダイズHRで目的の遺伝子を過剰発現およびサイレンシングする方法を概説する詳細なプロトコルを提供します。この方法論には、ダイズ種子の滅菌、K599による子葉の感染、およびRNA単離および必要に応じて代謝物分析のための遺伝子形質転換HRの選択と収穫が含まれます。このアプローチのスループットは、複数の遺伝子またはネットワークを同時に研究するのに十分であり、長期的に安定した形質転換アプローチに取り組む前に最適な工学戦略を決定することができます。

大豆(グリシンマックス)は農業で最も価値のある作物の一つです。食品、動物飼料、石油など、何千もの商業的および産業的用途があり、製造用の原材料の供給源として^{使用されています1}。窒素固定土壌微生物、すなわち根粒菌と共生関係を形成する能力は、ダイズ遺伝学研究の重要性をさらに高めます²。たとえば、大豆の根の窒素固定特性を微調整すると、炭素排出量の削減につながり、窒素肥料の要件を大幅に削減できます³。したがって、特にダイズ根生物学の側面を制御する遺伝学を理解することは、農業や産業に広く応用されています。これらの利点を考慮すると、ダイズ遺伝子の機能を解析するための信頼性の高いプロトコルを持つことが重要です。

アグロバクテリウム・ツメファシエンスは、多くの植物種の核ゲノムにトランスファーDNA(T-DNA)を統合する能力を持っているため、おそらく植物の遺伝子形質転換に最も一般的に使用されるツールです。アグロバクテリウム菌が植物に感染すると、腫瘍誘導(Ti)プラスミドが宿主染色体に移され、感染部位に腫瘍が形成されます。 アグロバクテリウムを介した形質転換は、遺伝子機能解析や作物形質改変のために何十年にもわたって広く使用されてきました⁴。目的の遺伝子は、A. tumefaciensを介した形質転換を介して宿主植物細胞に容易に導入することができるが、この方法にはいくつかの欠点がある。時間と費用がかかり、大豆などの多くの植物種について広範な専門知識が必要です。A. tumefaciensを用いた子葉節アプローチでは、数種類のダイズを形質転換することができるが、このアプローチの非効率性は、迅速かつ高効率の代替遺伝子形質転換技術を必要とする^4,5。専門家でなくても、このアグロバクテリウム根圏媒介毛根(HR)形質転換法を使用して、これらの欠点を克服することができます。

HR形質転換は、遺伝子機能の解析だけでなく、特殊な代謝物やファインケミカル、複雑な生理活性^{糖タンパク質の製造}などのバイオテクノロジーアプリケーションにも比較的高速なツールです6。ダイズHRの生産は、子葉の表面を傷つけた後、アグロバクテリウム根粒菌を接種することによって生成できるため、広範な専門知識^{を必要としません7。} A. rhizogenesは、そのTiプラスミドによってコードされる病原性(Vir)遺伝子を発現し、そのT-DNAセグメントを植物細胞のゲノムに転写、運搬、および統合すると同時に、異所性根の成長を刺激します⁸。

バイオリスティックスやA. tumefaciensベースの組織、細胞、臓器培養の形質転換などの他のダイズ遺伝子発現システムと比較して、HR発現システムはいくつかの利点を示します。第一に、HRは遺伝的に安定しており、ホルモンフリー培地で迅速に産生されます^1,9,10。さらに、HRは、天然の根と同等以上の量の特殊な代謝産物を産生することができます^11,12。これらの利点により、HRは、A. tumefaciensと互換性のない植物種、または互換性のある組織を形成するために特別な組織培養条件を必要とする植物種にとって望ましいバイオテクノロジーツールになります。HR法は、RNAシーケンシングを用いて、タンパク質間相互作用、タンパク質細胞内局在、組換えタンパク質産生、ファイトレメディエーション、突然変異誘発、およびゲノムワイド効果を解析するための効率的なアプローチです¹³、^14、15。また、重要な微生物病原体であるフィトフトラ・ソーヤに対する大豆の防御を薬用し、ヒトで印象的な抗癌作用と神経保護作用を持つグリセオリンなど、業界で価値のある特殊な代謝産物の生産を研究するためにも使用できます^16,17。

このレポートは、大豆HRを生成するための簡単で効率的なプロトコルを示しています。 以前のHR形質転換法と比較して、このプロトコルは、ダイズ子葉に接種する前にTiプラスミドの存在について A.リゾゲネス 形質転換体を事前にスクリーニングすることにより、HR形成率の有意な(33%-50%)改善を提供します。ダイズ転写因子遺伝子を過剰発現またはサイレンシングするいくつかのバイナリベクターを形質転換することにより、このプロトコルの適用性を実証します。

注意: すべての手順を無菌条件下で実行することをお勧めします。

1.大豆種子の殺菌

1. バイオセーフティキャビネットに、16〜20個の丸いウィリアムズ82大豆種子を手付かずの状態(つまり、ひび割れや傷がない)で50mLの遠沈管に入れます。
2. 30 mLの70%イソプロピルアルコールを加え、30秒間軽く振ってから、アルコールをデカントします。
3. 種子を30 mLの10%漂白剤で10秒間静かに振とうし、種子を室温(RT、25°C)で5分間溶液に入れます。5分後、漂白剤を排出します。
4. すすぎごとに1分間、30mLの滅菌超高純度H2Oで3回振とうを繰り返し、各すすぎの間に_H2Oを廃棄します。
5. 滅菌した種子を、5 mLの発芽共培養(GC)培地(オートクレーブ半強度液体ムラシゲおよびスクーグ[MS]培地と1%スクロース[pH = 5.8]で飽和させたろ紙に置き、次に2.5 mL / Lビタミンを添加します)滅菌シャーレに入れます。
6. プレートを室温(25°C)の暗所に3日間置いた後、プレートを22°Cで16時間の冷白色T5蛍光灯(100 μE ^m-2·s-1)の下で4日間移し、種子を発芽させました。
   注意: しわやひびの入った種は捨てます。最高の種子は大きくて均一に黄色のものです。一部の種子は損傷、病気、または発芽の失敗のために最適ではない可能性があるため、実験に必要な種子の数の少なくとも2倍を滅菌して、高品質の種子を選択します。

2. K599による子葉の感染

注:pGWBシリーズベクターは、二重選択によりT-DNAカセット全体のゲノム統合が保証されるため、使用してください。エレクトロポレーションを用いて、目的の遺伝子を保持するバイナリーベクターを A. rhizogenes pRi2659¹⁸に形質転換した。

1. A.リゾゲネスpRi2659プラスミド¹⁸の配列に基づいて、Tiプラスミド遺伝子VirD2を検出するためのプライマーを設計した(VirD2フォワード:5'-CCCGATCGAGCTCAAGTTAT-3';VirD2 リバース: 5'-TCGTCTGGCTGACTTTCGT-3';予想される増幅サイズ:221 bp)。形質転換後、PCRキットを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によるVirD2の保持についてアグロバクテリウムコロニーをテストします(材料の表を参照)。PCRサイクル:94°Cで3分間;35サイクル(94°Cで1分間、58°Cで30秒間、72°Cで1分間);72°Cで10分間。
2. VirD2と目的遺伝子(GOI)の両方を含むA.リゾゲネスコロニーを選択した後、目的のプラスミドに適した抗生物質(50 mg/L)を含むLuria-Bertani(LB)培地プレートに一部をストリークアウトし、30°Cで一晩インキュベートします。 スペクチノマイシンを使用する場合は、100 mg / Lの濃度を追加します。
3. P200ピペットチップを使用して、LBプレートから長さ~1.5 cmのK599 アグロバクテリウム をこすり落とし、細胞を1 mLのリン酸緩衝液(PB;0.01 M Na₂HPO₄、0.15 M NaCl、pH 7.5)に再懸濁します。
4. 滅菌済みの超高純度H₂O(v / v = 1:1)およびアセトシリンゴン(AS;ジメチルスルホキシド[DMSO]中の100 mMストック、v / v = 1:1000)でアグロバクテリウムを希釈します。キュベットチューブを用いて光学密度600nm(OD600)で吸光度を測定します。予想される最適範囲は 0.5 から 0.8 の間です。
5. バイオセーフティキャビネットで、滅菌したメスをK599 アグロバクテリウム 溶液に浸し、子葉の内面(軸方向、平らな面)に沿って1 mmの深さの切り込みを入れます。接種中は、子葉を安定させるために滅菌鉗子を使用してください。
6. ASでGC培地で飽和させたろ紙を含むシャーレに、切り取った約6〜8個の子葉を下にして置きます。
   注:6枚のプレートを調製するには、50 mLのGC培地と50 μLの100 mM ASで最終濃度100 μMを達成するだけで十分です。
7. プレートをRT(25°C)で16時間の日長(~65 μE)下で3日間インキュベートします。
8. 感染した子葉を毛状根成長(HRG)プレート(3%スクロース[pH = 5.8]および2.6 g / Lゲルザンを含むオートクレーブ半強度MS)に移し、2.5 mL / Lビタミン混合物と500 mg / Lティメンチンを追加します)。
   注:いくつかの代替ベンダーのtimentinにはいくつかの問題がありましたが、そのうちK599は排除されませんでした。HRG培地には、背の高いペトリ皿プレート(100 mm x 25 mm)を使用することをお勧めします。
9. 長さ2〜3 cmの二次根を持つ一次根が観察されるまで(~3〜4週間)、16時間の日長でパラメータを100 μE光に設定して、成長チャンバー内で22°CでHRGプレートをインキュベートします。

3. 人材の選定と獲得

1. カルスから成長し、二次根(長さ2〜3 cm)を含む一次根(長さ5〜7 cm)を滅菌メスと鉗子を使用して収穫します。適切な抗生物質を含む選択HRGプレートに移します。選択したHRGプレートでHRをさらに5日間成長させます。
   注:カナマイシン(50 mg / L)、ハイグロマイシン(50 mg / L)、またはホスフィノトリシン(10 mg / L)が通常選択に使用されます。発現ベクターの場合、pGWB2は過剰発現に、pANDA35HKはRNAiサイレンシングに、pGWB6は細胞内局在に、pMDC7は誘導発現に使用されます。
2. 5日目に、長さ3〜6 cmの二次根を持つトランスジェニックHRを収穫します。蛍光タンパク質を観察する場合、二次根はほとんど自家蛍光を有さない。エリシター処理や化学処理を行う場合は、二次根を1cmに切り、HRG寒天に~100mgを山状に据える。次に、パイルを80 μLの適切な処理で飽和させ、プレートをRT(25°C)でインキュベートします。
3. 所望の治療時間の後、RNAまたは代謝産物の抽出に進みます。
4. RNAの場合は、滅菌したペーパータオルで根をすばやく軽くたたいて乾かし、2 mLのマイクロ遠心チューブに直接収穫します。
5. パラフィルムを使用してチューブの上部をすぐに密封し、先のとがった鉗子を使用して2つの小さな穴を開け、チューブを液体窒素に浸します。凍結乾燥を3日間行い、サンプルを-80°Cで保存します。
   注:白人のHRを選択することが不可欠です。選択的プレート上で5日間成長した後、トランスジェニックHRは白色のままであるが、非トランスジェニック根は茶色に変わる。

代表的な結果は、公表されたデータ^19、20からのものである。形質転換K599 アグロバクテリウム 菌のコロニーPCR(cPCR)結果を 図1に示す。図 1に陽性コロニーによって示されるように、目的の遺伝子はcPCRによって検出された(図1A)。しかし、コロニーの3分の1から2分の1は VirD2 遺伝子スクリーニングに陰性であり(図1B)、Tiプラスミドの喪失を示しており、カルスや毛状の根を生成することができません。 図2 は、ダイズHRの全体的な調製手順と遺伝子発現解析を示しています。 図3 は、GFP-GmJAZ1-6の細胞内局在を実証する。 図4 は、ウィリアムズ82毛根におけるグリセリン転写因子 GmHSF6-1 の過剰発現および GmMYB29A2 のRNAiサイレンシングを示す遺伝子発現解析である。同様の結果がいくつかの最近の報告で得られている^20、21。

図1:目的の遺伝子またはVirD2のコロニーPCRプライマーを用いたK599アグロバクテリウムのコロニーPCR(cPCR)。 (a)目的の遺伝子cPCR。(B) VirD2 cPCR。略語:C =コロニー;+ve =ポジティブコントロール;-ve = ネガティブコントロール。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:ダイズ毛状根(HR)培養および遺伝子機能解析手順の概要。 カルスは、K599 アグロバクテリウム 感染の2週間後に創傷部位に形成された。細胞分化は1週間後に起こり、その後HR伸長のために1週間経過した。これに続いて、HRハーベスティングとウォールグルカンエリシター(WGE)/模擬処理を24時間行った。HRを、超高速液体クロマトグラフィー(UPLC)分析のための代謝物抽出および遺伝子発現分析のためのRNA単離にそれぞれ供した。WGEは、 フィトフトラソヤエからの壁グルカンエリシターです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:トランスジェニックウィリアムズ82毛状根の緑色蛍光タンパク質(GFP)に翻訳融合したGmJAZ1-6の蛍光顕微鏡。 (A)グリーンチャネル(GFP)。(B)ブルーチャンネル(DAPI)。(C)緑と青のチャンネルをマージしました。すべての画像は、ツァイス共焦点顕微鏡を使用して収集されました。DAPI(6 μg/mL)画像は核染色を示します。スケールバーは5μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:遺伝子発現解析。 (A)GmHSF6-1¹⁹ウィリアムズ82ダイズHRを24時間模擬処理下で過剰発現した場合、またはWGEで24時間誘発した場合の遺伝子発現。(B)RNAi-GmMYB29A2 20ウィリアムズ82ダイズHRにおける遺伝子発現は、WGEで²⁴時間誘発されました。WGEは、フィトフトラソヤエからの壁グルカンエリシターです。 ^ある対照よりも有意に大きく、^bが有意に小さい、対応のある学生のt検定(p < 0.01)。エラーバーはSE(n≥3回の生物学的反復)を表す。1つの一次根から収集された二次根は、1つの生物学的複製を示した。この図は、Linら¹⁹およびJahanら²⁰の許可を得て修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

過去10年間で、大豆HR法は、窒素固定22,23、生物的および非生物的ストレス耐性24,25、および代謝物生合成経路^26,27に関与する遺伝子を研究するための強力なツールとして開発されてきました。植物がどのように代謝産物を産生するかについての知識は、病原体に対する生化学的防御の媒介に関与する遺伝子ネットワークを研究するために使用できるため、農業生産および製薬業界に多くの利点があります²⁸。

生産性とコスト効率を優先するために、このプロトコルは手順を簡素化します。例えば、ゲル化剤を含むより高価な固体培地を使用する代わりに、大豆種子は、液体成長培地で飽和された工業用グレードのペーパータオルを使用して無菌条件下で発芽する。無菌ラボ技術と無菌作業条件の維持は、真菌や酵母などの幅広い微生物が in vitro 培養の汚染を引き起こす可能性があるため、HR形質転換実験に不可欠です。

さらに、適切な強度の光と日長を使用することは、HR文化にとって非常に重要です。 in vitro 培養における植物の成長と発達のプロセスは、以前のさまざまな研究で観察されたように、光強度と日長の質に大きく影響されます。光の強度が低すぎたり高すぎたりすると, 根の誘導のプロセスが遅くなる可能性があります.同様に、日長が不適切な場合、カルス形成および分化細胞発生の失敗を招く可能性がある²⁹。さらに、過去の実験に基づいて、非トランスジェニックHRは、唯一の抗生物質として使用するとカナマイシン(50 mg / L)に耐性があります。このため、我々は通常、ハイグロマイシンとカナマイシンの二重耐性をコードするベクターを使用します。この厳格な選択の下で、全根の15%〜30%の陽性トランスジェニックHR率を得ることができますが、それらのHRの~80%は、ベクターによってコードされている遺伝子を有意に過剰発現/サイレンシングしています。

HR形質転換実験の成功を確実にするためには、実験で使用された A.リゾゲネス 株が病原性遺伝子をコードするTiプラスミドを保持しているかどうかをテストすることが重要です。Tiプラスミドの存在は、T-DNAの植物ゲノム^への組み込みを成功させるために必要です4。Tiプラスミドを検出するためのcPCRの使用は、このプロトコルの重要なステップとなっています。過去には、私たちの形質転換の33%〜50%がカルスと根を生成できないことがわかりました。無意識のうちに、これは A.リゾゲネスの形質転換またはその後の培養中にTiプラスミドが失われたためでした。今回、形質転換後の アグロバクテリウム コロニーのPCR分析により、Tiプラスミドが存在し、形質転換実験の100%が根を産生することを確認しています。このプロトコルでのcPCRの使用は、標準的なHR変換手順への貴重な追加であることが証明されています。失敗した実験の数が減り、時間とリソースの両方が節約されました。また、cPCRステップにより、形質転換プロセスが意図したとおりに機能することを確認し、実験結果の信頼性と再現性を確保することができました。

それにもかかわらず、この簡略化された方法にはいくつかの制限があります。例えば、このプロトコルは、トランスジェニックHRにおける遺伝子機能に関する基本的な細胞生物学的疑問に答えることができる。ただし、新芽や葉などの他の植物組織に関する質問は、HRではテストできない場合があります。研究されているプロセスが異所性ホルモンレベルまたは A.根圏遺伝子によって導入された他の要因の影響を受けないことを確認することは常に重要です。研究者はその限界に注意し、正確で意味のある結果を確実にするために実験を慎重に設計する必要があります。

要約すると、ここで示すプロトコルは、ダイズの根の遺伝子機能を調査するための非常に効率的な方法です。私たちは最近、多重遺伝子工学的アプローチを研究し、ダイズの生化学的防御の調節に関与する遺伝子ネットワークを理解する上でその価値を実証しました¹⁹。このアプローチの相対的な効率は、多数の遺伝子の調査を必要とする植物生物学の複雑な質問に答えるのに理想的です。

著者は開示するものは何もありません。

この研究は、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)の助成金番号RGPIN-2020-06111とブラッドレースからの寛大な寄付によって資金提供されました。K599ア グロバクテリウム と予備プロトコールを提供してくれたWayne Parrott氏(ジョージア大学)と、pGWB2、pGWB6、およびpANDA35HK空ベクターを提供してくれたNakagawa & Hachiya Labs(島根大学)に感謝します。