嚢胞性線維症患者の喀痰中の 緑膿菌 の可視化

このプロトコルは嚢胞性線維症の患者の喀痰内の細菌のセルそして多糖類の統合の遺伝子座(Psl)の多糖類の視覚化のための方法を提供する。

嚢胞性線維症患者の肺内の緑膿菌の早期発見と根絶は、慢性感染症を発症する可能性を減らすことができます。慢性緑膿菌感染症の発症は、肺機能の低下と罹患率の増加に関連しています。したがって、小児患者の約10〜40%で発生する抗生物質療法で緑膿菌を根絶できない理由を解明することに大きな関心があります。緑膿菌の宿主クリアランスと抗生物質感受性に影響を与える多くの要因の1つは、空間構成(凝集やバイオフィルム形成など)と多糖類産生の変動です。そこで、CF患者の喀痰中の緑膿菌のin situ特性を可視化することに興味を持ちました。喀痰サンプルをハイドロゲルマトリックスに包埋した後、組織透明化技術を適用し、宿主細胞に対する3D構造を保持しました。組織透明化後、蛍光標識および色素を添加し、可視化を可能にした。細菌細胞の可視化のために蛍光in situハイブリダイゼーションを行い、エキソ多糖類の可視化のために蛍光標識抗Psl抗体を結合させ、DAPI染色を行って宿主細胞を染色し、構造的洞察を得ました。これらの方法により、共焦点レーザー走査型顕微鏡によるCF患者の喀痰中の緑膿菌の高解像度イメージングが可能になりました。

本研究では、小児嚢胞性線維症(CF)患者の喀痰中の緑膿菌のin vivo構造を可視化する実験が設計されました。緑膿菌感染症は、小児CF人口の30〜40%で慢性化します。慢性感染症が確立されると、それらを排除することはほとんど不可能です¹.緑膿菌の早期感染患者から分離された緑膿菌株は、一般的に抗菌薬の影響を受けやすいため、^{慢性感染症の}確立を防ぐために抗シュードモナル抗生物質で治療されます2。残念ながら、すべての緑膿菌分離株が抗生物質療法後に肺から効果的に除去されるわけではありません。抗生物質の失敗に関連する正確なメカニズムは完全には解明されていません。これまでの研究では、バイオフィルム細胞の密度、凝集、多糖類産生のばらつきが抗生物質の有効性に影響を与える可能性があることが示されています³。緑膿菌は、Pel、Psl、アル^ギン酸の3つの細胞外多糖類を産生します4。緑膿菌のほとんどの菌株は、それぞれのエキソ多糖類を発現する遺伝的能力を持っていますが、多くの場合、1種類の多糖類が主に発現しています⁵。アルギン酸エキソ多糖類は、CF肺の慢性感染症と関連しており、ムコイド表現型^6,7をもたらします。多糖類のPelとPslは、初期接着の補助やバイオフィルム構造の維持、抗生物質耐性の付与など、複数の機能を持っています⁸。

組織のin vivo構造を可視化することを目的とした方法は、さまざまなサンプルタイプに対して開発されています^9,10,11。最近では、CF患者の喀痰中のin vivo微生物群集を視覚化するように調整されています¹²。喀痰内の微生物群集の同定に特化した組織透明化プロトコルの最適化は、DePas et al., 2016¹²によって開発されました。MiPACTという用語は、Passive CLARITY techniqueの後にmicrobial identificationの略で、CF痰^11,12の除去のために造られました。組織透明化技術では、標本は最初に固定され、次に透明化され、染色と顕微鏡的視覚化のために固有の構造をそのまま残します¹¹。CF喀痰サンプルを固定・除去することで、バイオフィルム構造、細菌細胞密度、多微生物との関連、病原体と宿主細胞との関連に関する疑問に答えることができます。喀痰内に保存された細菌を直接調べる利点は、宿主特異的な状況で分析・可視化できることです。実験のために実験室で臨床分離株をin vitroで増殖させることは非常に有益ですが、そのような方法ではCF肺環境を完全に再現することができず、その結果、検査結果と患者の転帰の間に乖離が生じます。

ここで紹介する方法は、CF患者や他の呼吸器感染症の患者からの細菌を視覚化するために、喀痰を固定および除去するために使用できます。本明細書に記載の染色および顕微鏡分析の特定のタイプは、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)であり、続いてハイドロゲル内での抗Psl抗体結合、およびその後の共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)による分析である。組織透明化に続いて、他の免疫組織化学および顕微鏡検査法も適用できます。

研究倫理委員会(REB)の承認は、被験者から喀痰サンプルを収集して保管するために必要です。本論文で紹介する研究は、Hospital for Sick Children REB#1000058579によって承認されました。

1.痰の収集

1. 喀痰を滅菌コレクションカップに保管し、固定前に4°Cで最大24時間直ちに保管します。.
   注:固定せずに4°Cで喀痰を長時間放置すると、細胞の分解、特に白血球の分解につながる可能性があります。できるだけ早く固定することが望ましいです。
2. 喀痰サンプルを滅菌15mLチューブに移します。
3. 等量の4%パラホルムアルデヒド(PFA)を喀痰サンプルに加えます。例えば、喀痰サンプルが0.5 mLの場合、0.5 mLの4%PFAを加えます。穏やかな反転で混ぜます。
4. 喀痰を4°Cで一晩インキュベートします。
5. 固定喀痰2 mLそれぞれに5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加えてサンプルを洗浄します。
   注:この洗浄ステップに必要な遠心分離はありません。
6. ピペットで上澄みを慎重に取り除きます。
   注意: 先端を痰から遠ざけてピペットで痰を吸い上げないようにし、表面の液体を非常にゆっくりと吸引します。洗浄ステップは遠心分離を伴わないため、喀痰栓の構造的完全性を損なわない。
7. 手順1.6〜1.7をさらに2回繰り返します。
8. 0.01%(w/v)のアジ化ナトリウムを含むPBSの2倍の容量でペレットを再懸濁します。
9. 喀痰を4°Cで保管します。

2. 喀痰のMiPACT(ティッシュクリアリング技術)処理

1. ハイドロゲル成分(30%29:1アクリルアミド:ビスアクリルアミド、硬化剤、PBS)を嫌気性パックを含む密閉容器で72時間脱気します。
   注:酸素はアクリルアミドの重合を阻害するため、嫌気性パックと密閉容器が必要です。あるいは、嫌気性フード内でこのステップを実行するか、密閉容器に真空を適用するか、またはアクリルアミド混合物を通して_N2 ガスをバブリングすることによって、酸素を除去することができる。
   1. 密封された嫌気性容器内でキャップを外した状態で、30% 29:1 アクリルアミド:ビスアクリルアミド溶液 2 mL を 15 mL チューブに加えます。
   2. 15 mL チューブ中の PBS 5 mL に 0.5 g の硬化剤を添加して、10% (w/v) 硬化剤の濃縮ストックを作成します。キャップをチューブから外し、密閉された嫌気性容器に保管してください。
   3. 数 mLの滅菌PBSを、キャップを外した状態でチューブに入れ、嫌気性容器内に残します。
2. 最終濃度が0.2%硬化剤、4%の29:1アクリルアミド:ビスアクリルアミドをPBSに溶かしたハイドロゲルの溶液を15 mLのチューブで5 mLの溶液にします。反転して混合し、フィルター滅菌します。
3. 喀痰サンプルを冷蔵庫から取り出し、メスで無菌状態で小さなセクション(直径約5 mm)に切断します。
   注:喀痰が非常に流動的な場合でも、このステップを実行できますが、メスを使用して目的の画分を分離する前に、ピンセットで保存溶液から喀痰を取り除くには、忍耐力と練習が必要です。
4. カットした喀痰サンプルを8チャンバーのカバーガラススライドのウェル内に置きます。
5. ステップ2.2のフィルター滅菌したヒドロゲル溶液300μLを、喀痰を含む各ウェルに加えます。
6. 嫌気性パックが入った密閉容器内に8チャンバーのカバーガラスを置き、37°Cで3時間放置します。
   注:喀痰が埋め込まれたヒドロゲルを重合すると、固いゲルの粘稠度になるはずです。
7. 凝固したヒドロゲル喀痰サンプルを、pH 8の8%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)5 mLを含む15 mLの培養チューブに移し、喀痰が透明になるまで、37°C(振とうの有無にかかわらず)で3〜14日間サンプルを透明にします。
   注:クリアリング時間は喀痰の組成に依存し、一般的に振とうで短縮できます。ただし、サンプルの完全性を損なうほど振とう速度を上げないように注意してください。DNAに富むサンプルが多いほど、粘液に富むサンプルに比べて透明化に時間がかかります。
8. 8%SDS溶液を廃棄物収集容器にデカントします。滅菌ピンセットを使用して、ハイドロゲルに包埋した各サンプルを滅菌済みの50 mLコニカルチューブに移します。50 mLのコニカルチューブのそれぞれに10 mLのPBSを加えてハイドロゲルを洗浄し、溶液を30分から1時間放置してからデカントします。これをさらに2回繰り返します。
   注意: この洗浄ステップには遠心分離は含まれていません。余分な水分と上澄み液はピペットで慎重に取り除かれます。
9. 洗浄したサンプルを、0.01%(w/v)アジ化ナトリウムと1x RNase阻害剤を含むPBSで4°Cで保存します。

3. ヒドロゲル蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)プロトコル

1. 滅菌ピンセットを使用して保存溶液からハイドロゲルサンプルを取り出し、サンプルを滅菌表面(スライドガラスやペトリ皿など)に置きます。
2. 滅菌メスを使用して、ハイドロゲルを~1mmの厚さのスライスに切断します。
3. ハイドロゲルの1 mm切片を滅菌1.5 mLチューブに入れます。
4. 1.5 mLのチューブに1 mLのハイブリダイゼーションバッファー(25%ホルムアミド、0.9 M NaCl、20 mM Tris-HCl [pH 7.6]、0.01% SDS、精製および脱イオンH₂O)を調製します。
5. 蛍光標識したPseaerAプローブ(150.7 nM¹²)をハイブリダイゼーションバッファーに添加し、逆位で混合します。
   注意: ホルマリン溶液は直火から遠ざける必要があります。ハイブリダイゼーション緩衝液は、事前に調製し、-20°Cでアリコートで保存することができる¹³。
6. 200〜500μLのハイブリダイゼーションバッファーをハイドロゲルの各~1 mm切片に添加し、ハイドロゲルサンプル全体が浸漬されていることを確認します。
7. PseaerAプローブをヒドロゲルサンプルとハイドロゲルサンプルを暗所に置き、46°Cで振とうせずに18~24時間ハイブリダイズさせます。
8. ハイブリダイゼーション緩衝液を廃液回収容器にデカントする。
9. フィルター滅菌洗浄バッファー(337.5 mM NaCl、20 mM Tris-HCl、5 mM EDTA(エチレンジアミン四酢酸)[pH 7.2]、0.01% SDS、精製および脱イオン化H₂O)でサンプルを1回すすぎ、1.5 mLチューブのそれぞれに1 mLの洗浄バッファーを添加し、除去します。
   注:洗浄バッファーは事前に作成し、室温(RT)で保存できます。
10. 新鮮な洗浄バッファー 1 mL をチューブに加え、暗所で 48 °C で 6 時間、振とうせずにサンプルをインキュベートします。

4. ヒドロゲルとPsl0096抗体の結合

1. 洗浄バッファーを 1 mL ピペッターで滅菌除去します。
2. PBS 溶液中の 2% BSA(w/v)溶液に 1 mL の 2% BSA 溶液を加えて除去し、サンプルをすすぎます。
3. 500 μL の 2% BSA/PBS 溶液をハイドロゲルサンプルに添加して、非特異的タンパク質結合をブロックします。その後、サンプルを暗所の室温で一晩、振とうせずにインキュベートします。
4. ブロッキング溶液を1 mLピペットで滅菌除去します。
5. Psl0096-Texas Red抗体溶液を、500 μLの新鮮な2% BSA/PBS中で最終濃度0.112 μg/mLに希釈して調製します。
6. 500 μLの抗体溶液をハイドロゲルサンプルに加え、振とうをせずに、光から保護した状態で室温で6時間インキュベートします。

5. DAPI(4',6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール)染色

1. 磁性攪拌子を入れたフラスコに、40 gの非イオン性密度勾配培地、30 μLのTween20、3 μgのアジ化ナトリウム、および30 mLのPBSを加えて、屈折率マッチング溶液(RIMS)を調製します。溶液をマグネチックスターラーで15分間、または完全に溶解するまで攪拌します。
2. 10 mLのシリンジと滅菌済みの0.2 μmフィルターを使用して、溶液を50 mLのコニカルチューブにフィルター滅菌します。
   注:溶液は4°Cで数ヶ月間保存できます。
3. Psl0096-Texas Red抗体溶液を滅菌済み1 mLピペットで除去します。
4. 1 mL の PBS を添加してから除去することにより、ハイドロゲルサンプルをすすぎます。
5. ハイドロゲルサンプルを 250 μL の RIMS 溶液と 10 μg/mL の DAPI と室温で、暗所で穏やかに振とうしながら一晩インキュベートします。
6. 共焦点イメージングの前に、サンプルを0.9mmまたは1.7mmの灌流チャンバーにマウントし、ガラスカバーガラスで密封します。
   注:FISHおよび/または免疫組織化学の後、RIMSに浸漬する前に、喀痰粘液の可視化が必要な場合は、蛍光レクチン染色を適用できます¹²。

6. イメージング

1. 25倍、40倍、63倍、または100倍の倍率で標準的な技術を使用して共焦点レーザー走査型顕微鏡イメージングを実行します。

実験の全体的な計画を図 1 と 図2にまとめます。 図1 は、喀痰処理と喀痰除去プロトコルの概要を示しています。喀痰の処理と除去には最大17日かかる場合があります。ただし、プロトコルは停止する可能性があり、サンプルはPFAによる固定後(2日目)または組織除去後(クリア時間に応じて5〜17日目)に保存できます。 図2に、FISHと抗体の結合プロトコルをまとめました。FISHおよび抗体染色プロトコルは完了するまでに4日かかりますが、開始後に完了し、共焦点画像を撮影する必要があります。上記のプロトコルを使用して、緑 膿菌 細胞の高解像度3D画像を取得し、喀痰内のin-situ構造を視覚化することができます。

このプロトコルで使用される藻の除去そしてそれに続く適用はサンプル内の P.の緑膿菌の 詳しい視覚化を可能にする。図 3 および 図4 に示す喀痰サンプルは、新たに発症した 緑膿菌 感染症の小児CF患者(17歳)から採取されたものです。 図3Aでは、喀痰サンプル内に細胞の凝集体が見られました。黄緑色の桿体の出現は、3つの蛍光色素すべてが重なっているためである。この喀痰サンプルの細胞数は把握していませんが、プローブ検出限界は10⁴ 細胞/mLであることがわかりました( 補足図1を参照)。 図3Bでは、PseaerA-488プローブの 緑膿菌 細胞への種特異的な結合により、個々の棒状が緑色で見られました。赤色で示したPsl0096-Texas Red抗体は、シュードモンエキソ多糖が喀痰のどこに位置するかを示しています。この場合、Psl0096抗体は緑 膿菌 細胞とほとんど重複しているように見えました(図3C)。この方法では、喀痰内のシュードモナル細胞を他の細菌細胞や宿主構造との関係で可視化することも可能になりました。 図4では、真核細胞内で緑膿菌の細胞群が貪食され、その近傍に他の小さな球 菌 細胞群が観察されました。Psl0096抗体は、Psl産生のプランクトン 性緑膿菌 にも結合できることが実証されています( 補足図2参照)。

図1:喀痰処理とMiPACTプロトコルを示すフロー図。
要約すると、喀痰はポリアクリルアミド溶液に埋め込まれる前に固定されます。透明化したハイドロゲルは、4 °Cで保存するか、FISHおよび抗体結合プロトコルとともに使用できます。この画像は BioRender.com で作成されました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:蛍光 in situ ハイブリダイゼーションおよび抗体染色プロトコルを示すフロー図。
喀痰がヒドロゲルマトリックス内で完全に透明になったら、染色法を適用できます。この画像は BioRender.com で作成されました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:ハイドロゲルマトリックスに埋め込まれた初期の 緑膿菌 感染症の患者から採取した喀痰サンプルの免疫蛍光画像。
ハイドロゲル試料を、PsearA-Alexa488プローブ(緑)、Psl0096-Texas Red抗体(赤)、およびDAPI(青)とハイブリダイズした。(A)3つのチャンネルすべてで見た喀痰サンプル、(B)PseaerA-488プローブが結合した場所を示す緑色のチャンネルのみの下の喀痰、(C)Psl0096-Texasの赤色結合が発生した赤色のチャンネルのみの下の喀痰。画像は100倍の倍率で撮影されました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:ハイドロゲルマトリックスに埋め込まれた初期の 緑膿菌 感染症の患者から採取した喀痰サンプルの免疫蛍光画像。
ハイドロゲル試料を、PsearA-Alexa488プローブ(緑)、Psl0096-Texas Red抗体(赤)、およびDAPI(青)とハイブリダイズした。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

補足図1:PAO1とPseaerA-488プローブのプランクトン培養物の蛍光in situハイブリダイゼーション。この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2:DAPIおよびPsl0096-Texas Red抗体で染色した緑膿菌。(A)PAO1-Δpsl株、(B)PAO1株。この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

このプロトコルの目的はCFの患者からの喀痰の P.のaeruginosa のセルのその場の構成に垣間見るようにすることである。喀痰サンプルは、すぐに固定できない場合は、処理されるまで4°Cで保存する必要があります。喀痰中の 緑膿菌 の細胞数は、4°Cで保存した場合、1時間、24時間、または48時間処理しても有意に変化しないことが実証されていますが、25°Cで24時間または48時間放置すると、細菌の増殖の結果として細菌の細胞数が大幅に増加します¹⁴。この研究では、喀痰サンプルは去痰後最大24時間まで4°Cで保存されました。炎症性細胞数は、4°Cで放置し、9時間以上後に処理すると、喀痰中に減少することが示されていることに注意する必要があります¹⁵。したがって、サンプル処理のカットオフ時間を決定する際には、喀痰で視覚化したい特定の細胞とマーカーを考慮することが重要です。

この方法でのサンプル処理は、喀痰サンプルを 4 % PFA に固定することから始まります。パラホルムアルデヒドは、細菌細胞とその細胞外マトリックスを架橋し、顕微鏡での可視化と分析のためにその構造を維持します^11,16。残念ながら、喀痰中の特定の炎症細胞の総細胞数を取得することが目的である場合、PFAはこれらの細胞の数を減少させることが示されているため、他の固定剤を検討する必要があります¹⁷。この研究のもう一つの限界は、時間がかかり、実施に2週間以上かかる可能性があることです。したがって、時間的制約のある治療決定を必要とする診断方法への開発には適していない可能性があります。さらに、喀痰サンプル内の微生物の多様性全体を理解するには、この方法は適していませんが、qPCRなどの他のハイスループット微生物検出法と組み合わせることができます。

アクリルアミドヒドロゲルの組成は、組織の種類および用途に応じて変化させることができる¹¹。CF喀痰のような不安定な検体では、アクリルアミドだけでなく、29:1のアクリルアミド:ビス-アクリルアミド混合物で構造的支持を提供する必要があります。ヒドロゲルにパラホルムアルデヒドを含めると、構造をさらに安定化させることができ、プローブや抗体の拡散を可能にするためにインキュベーション時間が長くなるというトレードオフ^{が生じる9。}ヒドロゲルにホルムアルデヒドを添加すると、その効果が望ましくない場合、除去プロセス中の組織の腫脹を防ぐこともできます¹¹。

現在の方法は、CF患者の喀痰中の緑膿菌細胞を特異的に標的としています。このプロトコルの代替方法と修正は、他の細菌の視覚化の最適化を導くために考慮することができます。種および属固有のFISHおよびハイブリダイゼーション連鎖反応(HCR)プローブを適用することにより、黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス属、アクロモバクターキシロソキシダンなどの他のCF病原体を同定できます¹²。本研究では、シュードモン性エキソ多糖類Pslを標的とした。アルギン酸塩やPelなどの他の標的は、将来の実験でこれらのエキソ多糖類に特異的な蛍光抗体で調べることができます。MiPACT法とFISHおよび抗体染色を併用してCLSMに適用した場合、完了するまでに数週間かかります。研究課題が喀痰の3次元空間視覚化に関係しない場合、存在する細菌を視覚化するより迅速な方法があります。喀痰サンプル内の細菌を視覚化するために使用された以前の方法は、薄い切片または塗抹標本を利用し、FISH¹⁸、グラム染色、および一次抗体と対比染色を適用してバイオフィルムの外多糖類と細菌細胞の視覚化を可能にする免疫組織化学技術が含まれます^19,20。

これらのタイプのイメージング技術には、将来的にいくつかの潜在的なアプリケーションがあります。さまざまな細菌や、食細胞などの宿主細胞との相互作用を可視化する能力は、緑膿菌株の一部がCF気道から効果的に除去されるのに対し、他の 菌 株は除去されない理由の理解を深める可能性がある。呼吸器検体内の細菌のイメージングは、抗菌効果の尺度として、また新しい抗バイオフィルム薬の研究結果としても使用される可能性がある²¹。また、 緑膿菌 とCF肺マイクロバイオーム内の黄色 ブドウ球菌などの生物との空間的関係を可視化することで、肺増悪の病態形成における同時感染・コロニー形成の役割や抗生物質治療への反応の解明に役立つ可能性があります。細菌の in vivo イメージングは、人工呼吸器関連肺炎や慢性創傷感染症など、他の感染症にも適用できます²²。得られた知見は、将来の治療法開発の指針として活用することができます。

何一つ。

著者らは、この研究に資金を提供してくれた嚢胞性線維症財団と、抗Psl0096抗体を惜しみなく寄付してくれたMedImmuneに感謝の意を表したいと思います。この研究では、トロント大学のCAMiLoDイメージング施設でイメージングを実施しました。