Method Article
פרוטוקול זה מספק שיטות להדמיה של תאי חיידקים ורב-סוכר סינתזת רב-סוכר (Psl) בתוך כיח של חולי סיסטיק פיברוזיס.
גילוי מוקדם ומיגור של Pseudomonas aeruginosa בריאות של חולי סיסטיק פיברוזיס יכול להפחית את הסיכוי לפתח זיהום כרוני. התפתחות זיהומים כרוניים של P. aeruginosa קשורה לירידה בתפקוד הריאות ולעלייה בתחלואה. לכן, יש עניין רב להבהיר את הסיבות לכישלון למגר P. aeruginosa עם טיפול אנטיביוטי המתרחשת בכ 10-40% מהחולים ילדים. אחד הגורמים הרבים שיכולים להשפיע על פינוי הפונדקאי של P. aeruginosa ורגישות לאנטיביוטיקה הוא שינויים בארגון המרחבי (כגון צבירה או היווצרות ביופילם) וייצור פוליסכרידים. לכן, היינו מעוניינים לדמיין את המאפיינים באתרו של P. aeruginosa בתוך כיח של חולי CF. טכניקת ניקוי רקמות יושמה על דגימות כיח לאחר הטמעת הדגימות במטריצת הידרוג'ל כדי לשמור על המבנים התלת-ממדיים ביחס לתאים המארחים. לאחר ניקוי הרקמות, נוספו תוויות פלואורסצנטיות וצבעים כדי לאפשר הדמיה. הכלאה פלואורסצנטית באתרו בוצעה לצורך הדמיה של תאי חיידקים, קשירה של נוגדנים אנטי-PSL המסומנים באופן פלואורסצנטי להדמיה של האקסופוליסכריד וצביעה DAPI כדי להכתים תאים מארחים כדי לקבל תובנה מבנית. שיטות אלה אפשרו הדמיה ברזולוציה גבוהה של P. aeruginosa בתוך כיח של חולי CF באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.
במחקר זה, ניסויים תוכננו כדי לדמיין את המבנה in vivo של Pseudomonas aeruginosa בתוך כיח של חולי סיסטיק פיברוזיס ילדים (CF). זיהומים P. aeruginosa הופך כרוני ב 30-40% מאוכלוסיית CF ילדים; ברגע זיהומים כרוניים להתבסס, הם כמעט בלתי אפשרי לחסל1. P. aeruginosa מבודד מחולים עם זיהום מוקדם הם בדרך כלל רגישים יותר מיקרוביאלית, ולכן, אלה מטופלים עם אנטיביוטיקה אנטי pseudomonal כדי למנוע הקמת זיהום כרוני2. למרבה הצער, לא כל המבודדים של P. aeruginosa מנוקים ביעילות מהריאה לאחר טיפול אנטיביוטי. המנגנונים המדויקים הקשורים לכשל אנטיביוטי לא הובהרו במלואם. מחקרים קודמים הראו כי שינויים בצפיפות תאי ביופילם, צבירה וייצור רב-סוכר יכולים להשפיע על יעילות אנטיביוטיקה3. P. aeruginosa מייצר שלושה רב-סוכרים חוץ-תאיים: Pel, Psl ו-alginate4. לרוב הזנים של P. aeruginosa יש את היכולת הגנטית לבטא כל אחד מהאקסופוליסכרידים, אם כי לעתים קרובות סוג אחד של פוליסכריד מבוטא בעיקר5. אלגינט exopolysaccharide קשור לזיהומים כרוניים בריאה CF, וכתוצאה מכך פנוטיפ רירית 6,7. לרב-סוכרים Pel ו-Psl תפקידים רבים, כולל סיוע בהתקשרות ראשונית ושמירה על מבנה הביופילם, והענקת עמידות לאנטיביוטיקה8.
שיטות שמטרתן לדמיין מבנים in vivo של רקמות פותחו עבור מגוון רחב של סוגי מדגם 9,10,11. לאחרונה, הם הותאמו כדי לדמיין קהילות מיקרוביאליות in vivo בתוך כיח מחולי CF12. אופטימיזציה של פרוטוקול ניקוי רקמות במיוחד לזיהוי קהילות מיקרוביאליות בתוך כיח פותחה על ידי DePas et al., 201612. המונח MiPACT, ראשי תיבות של microbial identification after Passive CLARITY technique, נטבע לניקוי כיח CF11,12. עבור טכניקות ניקוי רקמות, הדגימות מתוקנות תחילה, ולאחר מכן הופכות לשקופות תוך השארת הארכיטקטורה הטבועה בהן ללא פגע לצורך צביעה והדמיה מיקרוסקופית11. תיקון וניקוי דגימות כיח CF מאפשרים לחוקרים לענות על שאלות הקשורות למבנה הביופילם, צפיפות תאי חיידקים, קשרים רב-מיקרוביאליים וקשרים בין פתוגנים לתאים מארחים. היתרון של בחינה ישירה של חיידקים שנשתמרו בתוך הכיח הוא שניתן לנתח אותם ולדמיין אותם בהקשר ספציפי למארח. למרות שגידול חוץ גופי של מבודדים קליניים במעבדה לניסויים יכול להיות אינפורמטיבי מאוד, שיטות כאלה אינן מסוגלות לשחזר באופן מלא את סביבת הריאות של CF, וכתוצאה מכך נוצר נתק בין תוצאות המעבדה לבין תוצאות המטופלים.
ניתן להשתמש בשיטות המוצגות כאן כדי לתקן ולנקות כיח כדי לדמיין חיידקים, בין אם מחולי CF או חולים עם זיהומים אחרים בדרכי הנשימה. הסוג הספציפי של צביעה וניתוח מיקרוסקופי המתואר כאן הוא הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH), ואחריה קשירת נוגדנים נגד PSL בתוך ההידרוג'ל, וניתוח עוקב באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM). לאחר ניקוי רקמות, ניתן ליישם גם שיטות אחרות של אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופ.
אישור ועדת האתיקה של המחקר (REB) נדרש כדי לאסוף ולאחסן דגימות כיח מנבדקים אנושיים. מחקרים המוצגים כאן אושרו על ידי בית החולים לילדים חולים REB#1000058579.
1. איסוף כיח
2. MiPACT (טכניקת ניקוי רקמות) עיבוד של כיח
3. פרוטוקול הכלאה פלואורסצנטית של הידרוג'ל באתרו (FISH)
4. קשירת נוגדנים הידרוג'ל ו-Psl0096
5. DAPI (4′,6′-diamidino-2-phenylindole) צביעה
6. הדמיה
התכנון הכולל של הניסוי מסוכם באיור 1 ובאיור 2. איור 1 מספק סיכום של פרוטוקולי עיבוד כיח וניקוי כיח. עיבוד וניקוי כיח עשויים להימשך עד 17 יום. עם זאת, ניתן לעצור את הפרוטוקול, וניתן לאחסן דגימות לאחר קיבוע עם PFA (יום 2) או לאחר ניקוי רקמות (ימים 5-17 בהתאם לזמן הניקוי). באיור 2 מסוכמים פרוטוקולי הקישור של FISH ונוגדנים. פרוטוקולי FISH וצביעת נוגדנים אורכים 4 ימים אך יש להשלים אותם ולצלם תמונות קונפוקליות ברגע שמתחילים. באמצעות הפרוטוקולים לעיל, ניתן להשיג תמונות תלת-ממדיות ברזולוציה גבוהה של תאי P. aeruginosa עם המבנה באתרם בתוך כיח דמיוני.
ניקוי הכיח והיישום הבא של כתמים פלואורסצנטיים המשמשים בפרוטוקול זה מאפשר הדמיה מפורטת של P. aeruginosa בתוך הדגימות. דגימות הכיח שמוצגות באיור 3 ובאיור 4 נאספו מחולה CF ילדים (בן 17) עם זיהום P. aeruginosa חדש. באיור 3A, צבר של תאים נצפה בתוך דגימת כיח; המראה של מוטות צהבהבים-ירוקים נבע מחפיפה של כל שלושת הפלואורופורים. אף על פי שאין לנו ספירת תאים עבור דגימת הכיח הזו, מצאנו שמגבלת זיהוי הבדיקה היא 104 תאים/מ"ל (ראו איור משלים 1). באיור 3B, צורות מוט בודדות נראו בירוק מהקישור הספציפי למין של הגשושית PseaerA-488 לתאי P. aeruginosa. הנוגדן Psl0096-Texas Red שנראה באדום ממחיש היכן האקסופוליסכריד המדומה היה ממוקם בתוך הכיח; במקרה הזה, נראה שהנוגדן Psl0096 חופף בעיקר לתאי P. aeruginosa (איור 3C). שיטה זו אפשרה גם הדמיה של תאים פסאודומונליים בתוך הכיח ביחס לתאי חיידקים אחרים ומבנים מארחים. באיור 4, צביר של תאי P. aeruginosa נצפה פגוציטוזי בתוך תא אאוקריוטי, וצברי תאי קוקל קטנים אחרים נצפו בסביבה. הוכח כי נוגדן Psl0096 יכול גם להיקשר לצורה פלנקטונית P. aeruginosa המיוצר על ידי Psl (ראו איור משלים 2).
איור 1: דיאגרמת זרימה המדגימה את עיבוד הכיח ואת פרוטוקולי MiACT.
לסיכום, כיח קבוע לפני שהוא מוטמע בתמיסת פוליאקרילאמיד. לאחר פינוי, ניתן לאחסן את ההידרוג'ל בטמפרטורה של 4 °C או להשתמש בו עם פרוטוקול קשירת הנוגדנים FISH. תמונה זו נוצרה באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דיאגרמת זרימה המציינת את פרוטוקולי הכלאה פלואורסצנטית באתרו וצביעת נוגדנים.
לאחר שהכיח התנקה לחלוטין בתוך מטריצת ההידרוג'ל, ניתן ליישם שיטות צביעה. תמונה זו נוצרה באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונת אימונופלואורסנציה של דגימת כיח שנאספה ממטופל עם זיהום מוקדם של P. aeruginosa המוטבע במטריצת הידרוג'ל.
דגימת ההידרוג'ל עברה הכלאה עם בדיקה PsearA-Alexa488 (ירוק), נוגדן Psl0096-Texas Red (אדום) ו-DAPI (כחול). (A) דגימת כיח שנצפתה תחת כל 3 הערוצים, (B) כיח מתחת לתעלה הירוקה בלבד המציינת היכן קשורה הבדיקה PseaerA-488, ו-(C) כיח רק מתחת לתעלה האדומה שבה התרחשה הקשירה האדומה Psl0096-Texas. התמונות צולמו בהגדלה של פי 100. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תמונת אימונופלואורסנציה של דגימת כיח שנאספה ממטופל עם זיהום מוקדם של P. aeruginosa המוטבע במטריצת הידרוג'ל.
דגימת ההידרוג'ל עברה הכלאה עם בדיקה PsearA-Alexa488 (ירוק), נוגדן Psl0096-Texas Red (אדום) ו-DAPI (כחול). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: הכלאה פלואורסצנטית באתרו של תרבית פלנקטונית של PAO1 עם הגשושית PseaerA-488. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.
איור משלים 2: P. aeruginosa מוכתם ב-DAPI ובנוגדן Psl0096-Texas Red. (A) זן PAO1-Δpsl, ו-(B) זן PAO1. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.
מטרת פרוטוקול זה היא לאפשר הצצה לארגון באתרו של תאי P. aeruginosa בכיח מחולי CF. דגימות כיח יש לאחסן ב 4 ° C עד עיבוד אם הם לא יכולים להיות קבועים מיד. הוכח כי מספרי תאי P. aeruginosa בכיח אינם משתנים באופן משמעותי אם הם מעובדים ב 1 שעות, 24 שעות, או 48 שעות, כאשר מאוחסנים ב 4 ° C, אם כי אם נשאר ב 25 ° C במשך 24 או 48 שעות, ספירת תאי חיידקים יגדל באופן משמעותי כתוצאה מצמיחת חיידקים14. עבור מחקר זה, דגימות כיח אוחסנו ב 4 ° C עד מקסימום של 24 שעות לאחר expectoration. יש לציין כי ספירת תאים דלקתיים הוכחה ירידה בכיח אם נשאר ב 4 ° C ועבד יותר מ 9 שעות מאוחר יותר15. לכן, חשוב לקחת בחשבון את התאים והסמנים הספציפיים שרוצים לדמיין בכיח כאשר מחליטים על זמן חיתוך לעיבוד דגימה.
עיבוד הדגימה בשיטה זו מתחיל עם קיבוע של דגימות כיח ב 4% PFA. Paraformaldehyde יקשר בין תאי חיידקים לבין המטריצה החוץ תאית שלהם, וישמור על המבנים שלהם לצורך הדמיה מיקרוסקופית וניתוח11,16. למרבה הצער, אם המטרה היא לקבל ספירה כוללת של תאים דלקתיים מסוימים בכיח, PFA הוכח להפחית את הספירה של תאים אלה ולכן קיבוע אחרים צריך להיחשב17. מגבלה נוספת של מחקר זה היא שזה יכול לקחת זמן רב עשוי לקחת יותר משבועיים כדי לבצע. לכן, זה לא יכול להיות מתאים לפיתוח לשיטת אבחון הדורשת החלטות טיפול תלויות זמן. יתר על כן, להבנת המגוון המיקרוביאלי הכולל בתוך דגימות כיח, שיטה זו לא תהיה מתאימה, אך ניתן לשלב אותה עם שיטות זיהוי מיקרוביאליות אחרות בעלות תפוקה גבוהה כגון qPCR.
הרכב של הידרוג'ל אקרילאמיד ניתן לשנות בהתאם לסוג הרקמה ואת היישום11. עבור דגימות לא יציבות כמו כיח CF, יש צורך לספק תמיכה מבנית עם תערובת אקרילאמיד:ביס-אקרילאמיד 29:1 (במקום רק אקרילאמיד). הכללת פרפורמלדהיד בהידרוג'ל יכולה לייצב עוד יותר את המבנה, עם פשרה של זמני דגירה ארוכים יותר כדי לאפשר דיפוזיה של בדיקות ונוגדנים9. הוספת פורמלדהיד להידרוג'ל יכולה גם למנוע נפיחות רקמות בתהליך הניקוי אם השפעה זו אינה רצויה11.
השיטה הנוכחית מכוונת באופן ספציפי לתאי P. aeruginosa בתוך כיח של חולי CF. שיטות חלופיות ושינויים לפרוטוקול זה יכולים להיחשב כדי להנחות אופטימיזציה של הדמיה של חיידקים אחרים. על ידי יישום בדיקות FISH ותגובת שרשרת הכלאה (HCR) ספציפיות למינים ולסוגים, ניתן לזהות פתוגנים אחרים של CF כגון Staphylococcus aureus, Streptococcus sp. ו- Achromobacter xylosoxidans 12. במחקר שלנו, התמקדנו באקסופוליסכריד פסאודומונלי Psl. מטרות אחרות, כולל אלגינט או Pel יכולות להיבדק עם נוגדנים פלואורסצנטיים ספציפיים עבור exopolysaccharides אלה בניסויים עתידיים. יישום שיטת MiPACT יחד עם FISH וצביעת נוגדנים עבור CLSM לוקח כמה שבועות כדי להשלים. אם שאלת המחקר אינה נוגעת להדמיה מרחבית תלת-ממדית של הכיח, ישנן שיטות מהירות יותר לדמיין את נוכחות החיידקים. שיטות קודמות ששימשו להדמיית חיידקים בתוך דגימות כיח משתמשות בחתך דק או מריחה וכוללות: FISH18, כתם גרם, וטכניקות אימונוהיסטוכימיה המיישמות נוגדנים ראשוניים וכתמי נגד כדי לאפשר הדמיה של אקסופוליסכרידים ביופילם ותאי חיידקים19,20.
ישנם מספר יישומים עתידיים פוטנציאליים של סוגים אלה של טכניקות הדמיה. היכולת לדמיין אורגניזמים חיידקיים שונים ואת האינטראקציה שלהם עם תאים מארחים, כגון פגוציטים, עשויה לקדם את הבנתנו מדוע זנים מסוימים של P. aeruginosa מנוקים ביעילות מדרכי הנשימה של CF בעוד זנים אחרים אינם. הדמיה של חיידקים בתוך דגימות נשימה עשויה לשמש גם כמדד ליעילות מיקרוביאלית וכתוצאת מחקר עבור תרופות אנטי-ביופילם חדשות21. בנוסף, הדמיה של הקשר המרחבי בין P. aeruginosa לבין אורגניזמים אחרים בתוך מיקרוביום הריאה של CF, כגון Staphylococcus aureus, עשויה לעזור להבהיר את התפקיד של זיהום משותף / נשאות בפתוגנזה של החמרות ריאתיות, ואת התגובה שלהם לטיפול אנטיביוטי. הדמיה In vivo של חיידקים יכולה להיות מיושמת גם על זיהומים אחרים, כולל אלה עם דלקת ריאות הקשורה להנשמה או זיהומים פצעים כרוניים22. כך ניתן להשתמש בתובנות שהושגו כדי להנחות את ההתפתחות הטיפולית העתידית.
ללא.
המחברים מבקשים להודות לקרן סיסטיק פיברוזיס שסיפקה מימון למחקר זה ול-MedImmune על תרומתם הנדיבה של נוגדנים נגד PSL0096. לצורך מחקר זה בוצעה הדמיה במתקן הדמיה CAMiLoD באוניברסיטת טורונטו.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution | BioRad | 161-0146 | |
8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek | ThermoFischer Scientific | 155411 | |
Anaerogen2.5L | Oxid Inc. | 35108 | |
Coverwell perfusion chambers | Electron Microscopry Sciences | 70326 -12/-14 | |
HistoDenz | Sigma | D2158 | |
Protect RNA Rnase Inhibitor | Sigma | R7387 | |
PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC | Eurofins | Order Details: Product: Modified DNA Oligo; Name: PseaerA; Sequence: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthesis: 50 nmol; Purification: HPLC; Ship state: Full yield (dry) | |
Psl0096-Texas Red | Medimmune | The Psl0096-Texas red antibodies were a gift kindly provided by Medimmune and the company should be contacted for order inquiries. | |
VA-044 Hardener | Wako | 27776-21-21 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved