Method Article
生体内でのマクロファージ募集に対するケモカインの効果を試験するために、その位置ハイブリダイゼーション中のマウント全体を使用してケモカインの異所性発現を検出し、免疫染色を用いてマクロファージの標識を行った。ライブイメージングは、マクロファージ移行のリアルタイム観察に使用されました。
ゼブラフィッシュは、基礎研究や生物医学研究で広く使用されています。多くのゼブラフィッシュトランスジェニックラインは、現在、様々なタイプの細胞に標識するために利用可能です。ゼブラフィッシュの透明な胚体のために、生体内の特定のタイプの細胞の挙動に対する1つのケモカインの影響を研究することは便利です。ここでは、生体内でのマクロファージ移行に関するケモカインの機能を調べるためのワークフローを提供した。IL-34を過剰発現させる組織特異的過剰発現プラスミドを構築し、マクロファージが蛍光タンパク質によって特異的に標識された1細胞段階のトランスジェニック魚胚にプラスミドを注入した。その後、その場で蛍光全体を使用し、ケモカイン発現のパターンとマクロファージの数または位置を検出した。注入されたWT胚を、安定なトランスジェニックラインを生成するために上げた。最後に、共焦点ライブイメージングを用いて、安定したトランスジェニック魚のマクロファージ挙動を直接観察し、生体内のマクロファージに対するIL-34の機能を調べた。
ゼブラフィッシュは、インド発祥の小さな熱帯硬骨淡水魚です。遺伝子保全に関しては、ゼブラフィッシュはヒト1と87%の類似性を持つ。ゼブラフィッシュの遺伝子調節、タンパク質機能、細胞行動(マイブレーション、増殖et.alなどの細胞行動を研究することにより、ヒトの関連する主題に関する洞察を提供します。ゼブラフィッシュ胚は、色素を阻害した後、異なる段階で初期胚の発達を観察するために使用することができる。一方、ゼブラフィッシュが性的成熟に発展するまでに3ヶ月しかかからないうちに、ゼブラフィッシュは4日ごとに数百個の卵を産むことができる。ミニサイズ、単純な繁殖、強力な生殖能力、これらの利点は、ゼブラフィッシュ培養を非常に省スペースにし、大規模な培養に役立ちます。従来の哺乳類モデルマウスはゼブラフィッシュよりもメンテナンスコストが高いため、マウスの飼育の規模が制限されます。初期の胚の発達の側面では、マウス胚は母親の子宮におけるマウス胚の発達の特徴のために生きている状態で観察することは困難である。それどころか、ゼブラフィッシュ胚は外部から発達し透明であるため、顕微鏡下で観察しやすい。さらに、ゼブラフィッシュは、関連する遺伝子機能研究のための様々なトランスジェニックラインを構築することが非常に容易である。現在、様々なゼブラフィッシュトランスジェニックラインは、異なるタイプの細胞に標識するために利用可能である。特定の場所でケモカインを過剰発現させるトランスジェニックラインを構築し、ゼブラフィッシュの細胞挙動に関するケモカイン機能を研究することは、今や非常に便利です。
ここでは、ビボ2、3、4、5、6、7におけるマクロファージ挙動に対するIL-34の機能を調べるためにゼブラフィッシュトランスジェニックラインを使用するワークフローを提供した。まず、遺伝子il34の肝臓特異的過剰発現プラスミドを構築し、蛍光タンパク質GFPによりマクロファージを特異的に標識した1細胞ステージTg(mpeg1:GFP)魚胚にプラスミドを注入した。次いで、その場で蛍光マウント全体を使用し、il34発現のパターンとマクロファージの数または位置を検出した。注入されたWT胚を、安定なトランスジェニックラインを生成するために上げた。これらのステップでは、サイトカイン産生ラインを確立し検証し、マクロファージ分布に及ぼす影響を視覚的に評価しました。最後に、サイトカインに応答するマクロファージの挙動を調べ、共焦点ライブイメージングを用いてマクロファージ移行を直接観察し、生体内のマクロファージ移行におけるil34の機能を確認した。
注:全ての試料をフェニルチオール(PTU)卵水で処理し、色素を抑制した。
1. Tgの生成 (fabp10a:il34) トランスジェニックコンストラクトと魚の注入
2. 蛍光全山インシチュアライブリゼーション(WISH)と免疫染色と組み合わせる
3. ライブイメージング
ゼブラフィッシュのプロトコルに関与する手順を図2に示します。まず、il34がfabp10aプロモーターによって駆動されたpBLK-fabp10a-il34-sv40コンストラクトを生成した(図2)。この構築物を、トランスジェニック安定線を生成するために成人に提起したGFPおよびWT胚でマクロファージに標識できるゼブラフィッシュ胚(mpeg1:GFP)にマイクロ注入した(図2)。il34の発現は、その中の蛍光全体によって分析された(図2および図3)。GFPによって標識されたマクロファージを免疫染色により分析した(図2および図3)。ライブイメージングを使用して、マクロファージが3-3.5 dpfの間にil34誘導の下で肝臓に移行するかどうかを直接観察しました(図2、図4、補足ムービー1、補足ムービー2).
図1:共焦点顕微鏡ライブイメージングのソフトウェア動作。ZENブラック2.3ソフトウェアを開き、生きているセルワークベンチを顕微鏡キャリアテーブルに取り付け、[検索(A)] をクリックします 。インキュベーション|温度(B)温度を29°Cに設定する。生細胞ワークベンチの中央に皿を置き、トリカインでE2溶液10で魚を覆う。これらすべての後、[取得(C)]メニューをクリックし、スマートセットアップ(D)メニューで必要なスキャンモードとレーザーを選択し、Zスタックと位置(E)を選択します。最後に、実験デザイナ(F)メニューをクリックし、[マルチブロック実験を有効にする]を選択し、最初のブロックで、低倍率の下でサンプルを見つけてから、高倍率に切り替えて、観測領域を視野の中心は、位置とZスタック(GおよびH)情報を設定し、適切なレーザー強度、走査層および画像速度を選択する。新しいブロックを作成し、上記の手順を繰り返します。すべてのブロックを設定した後、適切な数のループ(I)を設定し、記録を開始します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:生体内でのマクロファージ移行におけるケモカインの機能を調べるためのワークフロー。IL-34を過剰発現させる組織特異的(肝臓)過剰発現プラスミドを構築し、マクロファージが蛍光タンパク質によって特異的に標識された1細胞段階のトランスジェニック魚胚にプラスミドを注入した(Tg: (mpeg1: GFP))).注入されたWT胚を、安定なトランスジェニックラインを生成するために上げた。次に、その場ハイブリダイゼーションおよび免疫染色における全マウント蛍光を用いて、一過性注入胚または安定ライン胚(4dpf)の遺伝子発現のパターンおよびマクロファージの数または位置を検出した。最後に、共焦点ライブイメージングを用いて、安定なトランスジェニック魚(3-3.5 dpf)におけるマクロファージの挙動を直接観察し、生体内のマクロファージにおけるIL-34の機能を調べた。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:蛍光WISHは免疫染色と組み合わせる。この図は、Jiang et al.11から変更されています。pBLK-fabp10a-il34-sv40構築物の合計1.8nL(30ng/μL)を、1細胞ステージTg(mpeg1:GFP)ゼブラフィッシュ胚にマイクロ注入した。(A)4dpf胚(6倍)におけるGFP発現(緑色)のil34発現(赤)及び全マウント抗体染色のWISH。魚の全身の画像は、共焦点によって撮影され、Photoshopで一緒にステッチされた2つの別々の画像で構成されています。インセットは、対応するボックス化された領域(オレンジ色の点線領域)の高倍率(20倍)です。(B)未注入でマクロファージ細胞数を定量的に分析し、注入された胚の肝臓(白い点線領域に示す)と尾部領域(約13番目と17番目のソマイトの間で、2つの白い点線の間に示す)を構築する。データは、コントロールと比較して、マンホイットニーUテスト、** p <0.01によって分析されました。n = 5, 5 を注入し、魚を制御する 4 dpf.バー:200 μm(白線)。50 μm (黄色の線)。(C)4dpf安定線胚(6倍)におけるGFP発現のil34発現及び全マウント抗体染色のWISH。魚の全身の画像は、共焦点によって撮影され、Photoshopで一緒にステッチされた2つの別々の画像で構成されています。インセットは、対応するボックス化された領域(オレンジ色の点線領域)の高倍率(20倍)です。(D)Tg(mpeg1:GFP)およびTg(fabp10a:il34;mpeg1:GFP)胚の肝臓(白い点線領域に示す)と尾部領域(およそ13日の間)におけるマクロファージ細胞数の定量的分析そして17番目のソミテ、2つの白い点線の間に示す)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:安定なトランスジェニック魚におけるマクロファージの挙動を直接観察する共焦点ライブイメージング。この図は、Jiang et al.11から変更されています。ライブイメージングの顕微鏡写真は、コントロール魚(A)で28分以内に肝臓(赤)を通過するマクロファージ(緑色、白い矢印で標識された)のプロセスと、28年以内に肝臓(赤色)に移行するマクロファージ(緑色、白い矢印でラベル付け)のプロセスを示しています。IL-34の分は魚(B)を過剰発現する。スケールバー = 40 μm (白線)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足ムービー1:IL-34の過剰発現魚において2時間以内に肝臓(赤色)に移行するマクロファージ(緑色、白い矢印で標識)のプロセスを示すライブイメージング。スケールバー = 20 μm (白線)。この映画は、Jiangら11から再公開されました。このビデオを見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください。
補足ムービー2:マクロファージ(緑色、白い矢印で標識)がコントロール魚で2時間以内に肝臓(赤色)の周りをさまよっているプロセスを示すライブイメージング。スケールバー = 20 μm (白線)。この映画は、Jiangら11から再公開されました。このビデオを見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください。
ここで説明するプロトコルは、マクロファージン生体内の挙動に関するケモカインの機能を調べ、手順にはいくつかの技術的専門知識を必要とします。要約すると、プロトコルの合併症を避けるためにいくつかの重要なステップがあります:1)目的の細胞にラベルを付けるために、特定の強いトランスジェニック信号を示す適切なトランスジェニックラインを選択します。2)イメージングおよびトランスジェニック遺伝子過剰発現のためにアクセス可能な適切な組織を選択します。3)敏感で特定のRNAプローブを作ります。4)セルの挙動を正確にキャプチャするために、適切な観察時間枠を選択します。
免疫染色と組み合わせたその位置ハイブリダイゼーションにおける全マウント蛍光の手順では、遺伝子発現を検出するために使用されるRNAプローブは感度が高く、シグナルは十分に強くする必要があります。細胞の挙動に関する遺伝子機能を捕捉するためには、一連の時点をテストする必要があります。例えば、マクロファージ移行に対するil34の効果を観察する上で、fabp10aプロモーターは2〜3 dpfで発現し始めたが、肝臓におけるマクロファージ蓄積は当時明らかではなかった。肝臓のマクロファージの濃縮が明らかになるのは4dpfだけである。さらに、その後のハイブリダイゼーション後、その後の免疫染色のシグナル強度が影響を受ける。例えば、GFPと比較すると、DsRedは、おそらく異なるタンパク質構造のため、その場所のハイブリダイゼーション後の免疫蛍光染色において着色することが困難である。一般的に言えば、その中で蛍光を全て取り付けた後の免疫染色のシグナル強度は、単一の免疫染色のシグナル強度よりも小さくなるであろう。
共焦点顕微鏡を用いたライブイメージング工程では、試料を皿の底部に近づける必要がある。胚がアガロースに浮かぶと、目的の作業距離が不十分であり、また、目的とサンプルの間のアガロースがイメージングの質に影響を与える。また、各時間のイメージング用サンプル数を適切に設定する必要があります。1つは、各魚の2つのスキャンの間の時間のスパンが細胞の行動の詳細を失うには長すぎないようにする必要があります。したがって、この方法は、厚い組織で速く移動する細胞を追跡するのに適していません。
結論として、このプロトコルは、マクロファージ、好中球、およびT細胞などの様々な細胞の挙動に関するケモカインの機能を観察するために使用することができる。ここでは、ケモタキシス6、7におけるCSF-1R機能の最近同定されたリガンドであるIL-34を、マクロファージ移行を誘導する異所性発現ケモカインとして用いった。細胞化学タキシスの既存の実験モデルのほとんどはインビトロ細胞実験に基づいていますが、インビトロ実験はインビボで複雑な環境をモデル化するには単純すぎる場合があります。また、インビトロの状況を見るだけでは、生体内での化学的魅力をイメージすることは困難です。この方法は、マウスにとって困難である直接細胞挙動観察のためにゼブラフィッシュの特定の利点を利用した。現在の方法では、数日以内に細胞挙動に関するケモカイン機能を迅速にテストし、ゼブラフィッシュを分子生物学と細胞生物学を研究する強力なモデルにすることができました。
著者は何も開示していない。
私たちは、Tg(fabp10a:DsRed)トランスジェニックラインを共有するためのジンロンペン博士に感謝します。Tg(mpeg1:GFP)トランスジェニックラインを共有するためのジロン・ウェン博士。pTol2ベクターを提供する川上浩一博士。この研究は、中国国家自然科学財団(31771594)、広東科学技術計画プロジェクト(2019A030317001)、中央大学基礎研究基金(D2191450)によって支援されました。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibody | |||
Alexa 488-Anti-Goat antibody | Invitrogen | A11055 | |
Anti-Digoxigenin-HRP | perkinelmer | NEF832001EA | |
Goat-Anti-GFP antibody | Abcam | ab6658 | |
Reagent | |||
CaCl2· 2H2O | Sigma | 21097 | |
Cyanine 3 Plus Amplification Reagent | perkinelmer | NEL745001KT | |
E2 solution | 15 mM NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 µM KH2PO4 + 50 µM Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3 | ||
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life | 10099-133 | |
Formamide | Diamond | A100314 | |
Glycerol | Sigma | V900860 | |
Heparin sodium | Sigma | H3149 | |
Hybridization buffer(HB) | 50% formamide+ 5×SSC+9 mM sodium citrate+50 μg/ml heparin sodium+ 500 μg/mL tRNA+ 0.1% Tween20 | ||
KCl | Sigma | P5405 | |
KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
Low melting agarose | Sigma | A9414 | |
Methanol | GHTECH | 1.17112.023 | |
Methylene blue | Sigma | M9140 | |
MgSO4 | Sigma | M2643 | |
Na2HPO4 | Sigma | S5136 | |
NaCl | Sigma | S5886 | |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 158127 | Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 °C to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 °C. Caution. Manipulate with mask. |
10×PBS | 14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O | ||
Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
1×Plus Amplification Diluent | perkinelmer | NEL745001KT | |
Proteinase K | Fermentas | E00492 | |
20×Saline sodium citrate(SSC) | 175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0 | ||
Sodium citrate | Sigma | A5040 | |
Tricaine | Sigma | E10521 | |
tRNA | Sigma | R6625 | |
Tween20 | Sigma | P2287 | |
Plasmid | |||
pBLK-fabp10a-il34-sv40 | For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation | ||
pBSK-il34 | For il34 probe preparation | ||
Fish | |||
Tg (mpeg1: GFP) | Label macrophages with GFP | ||
Tg (fabp10a: DsRed) | Label liver cells with DsRed | ||
Tg (fab10a:il34) | Over-expression IL-34 in liver cells |
このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します
許可を申請This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved