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Um die Wirkung eines Chemokins auf die Makrophagenrekrutierung in vivo zu testen, wurde die gesamte Mount-in-situ-Hybridisierung verwendet, um die ektopische Expression des Chemokins zu erkennen, und Immunstaining wurde verwendet, um Makrophagen zu kennzeichnen. Live-Bildgebung wurde für die Echtzeitbeobachtung der Makrophagenmigration verwendet.
Zebrafische sind weit verbreitet in der Grundlagen- und biomedizinischen Forschung verwendet. Viele transgene Zebrafische sind derzeit verfügbar, um verschiedene Arten von Zellen zu kennzeichnen. Aufgrund des transparenten embryonalen Körpers von Zebrafischen ist es für uns bequem, die Wirkung eines Chemokins auf das Verhalten einer bestimmten Art von Zellen in vivo zu untersuchen. Hier haben wir einen Workflow zur Untersuchung der Funktion eines Chemokins zur Makrophagenmigration in vivo bereitgestellt. Wir konstruierten ein gewebespezifisches Überexpressionsplasmid, um IL-34 zu überexpressen und injizierten das Plasmid in transgene Fischembryonen im Einzellstadium, deren Makrophagen speziell durch ein fluoreszierendes Protein gekennzeichnet wurden. Wir verwendeten dann ganze Mount-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung und Immunostaining, um das Muster der Chemokin-Expression und die Anzahl oder Position von Makrophagen zu erkennen. Die injizierten WT-Embryonen wurden erhöht, um eine stabile transgene Linie zu erzeugen. Schließlich verwendeten wir konfokale Live-Bildgebung, um das Makrophagenverhalten in den stabilen transgenen Fischen direkt zu beobachten, um die Funktion von IL-34 auf Makrophagen in vivo zu untersuchen.
Zebrafisch ist ein kleiner tropischer Süßwasserfisch aus Indien. In Bezug auf die Generhaltung haben Zebrafische eine Ähnlichkeit von 87% mit dem Menschlichen1. Es kann uns Einblicke zu verwandten Themen des Menschen geben, indem es die Genregulation, Proteinfunktion und Zellverhalten wie Migration, Proliferation et.al in Zebrafischen untersucht. Zebrafisch-Embryo kann verwendet werden, um die Entwicklung von frühen Embryonen in verschiedenen Stadien nach der Hemmung des Pigments zu beobachten. Inzwischen dauert es nur drei Monate, bis sich Zebrafische zu einer Geschlechtsreife entwickeln, dann kann der Zebrafisch alle 4 Tage Hunderte von Eiern produzieren. Mini-Größe, einfache Zucht, starke Fortpflanzungsfähigkeit, diese Vorteile machen Zebrafischkultur sehr platzsparend, förderlich für großflächige Kultur. Die traditionelle Säugetiermodellmaus hat höhere Wartungskosten als Zebrafische, wodurch der Umfang des Anhebens von Mäusen begrenzt wird. Im Bereich der frühen Embryoentwicklung ist der Mausembryon aufgrund der Eigenschaften der Entwicklung von Mausembryonen im Mutterleib schwer im Leben zu beobachten. Im Gegenteil, Zebrafischembryonen entwickeln sich äußerlich und sind transparent, daher sind sie unter dem Mikroskop leicht zu beobachten. Darüber hinaus ist Zebrafisch sehr einfach, eine Vielzahl von transgenen Linien für die verwandte Genfunktionsforschung zu konstruieren. Derzeit stehen verschiedene transgene Zebrafische zur Verfügung, um verschiedene Zelltypen zu kennzeichnen. Es ist jetzt sehr praktisch, transgene Linien zu konstruieren, um Chemokine an bestimmten Stellen zu überexprimieren und die Chemokinfunktion auf zellzelliges Verhalten bei Zebrafischen zu untersuchen.
Hier haben wir einen Workflow zur Verwendung von Zebrafisch transgene Linie zur Untersuchung der Funktion von IL-34 auf Makrophagen Verhalten in vivo2,3,4,5,6,7. Zunächst konstruierten wir ein leberspezifisches Überexpressionsplasmid des Gens il34 und injizierten das Plasmid in einzellige Tg-Embryos (mpeg1: GFP), die die Makrophagen durch das fluoreszierende Protein GFP spezifisch kennzeichnen. Dann verwendeten wir ganze Mount-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung und Immunostainierung, um das Muster des il34-Ausdrucks und die Anzahl oder Position von Makrophagen zu erkennen. Die injizierten WT-Embryonen wurden erhöht, um eine stabile transgene Linie zu erzeugen. In diesen Schritten haben wir die Zytokin-produzierende Linie etabliert und validiert und die Auswirkungen, die auf die Makrophagenverteilung zu sehen sind, visuell bewertet. Schließlich haben wir zur Untersuchung des Makrophagenverhaltens als Reaktion auf das Zytokin konfokale Live-Bildgebung verwendet, um die Makrophagenmigration direkt zu beobachten, um die Funktion von il34 auf der Makrophagenmigration in vivo zu bestätigen.
HINWEIS: Alle Proben wurden mit Phenylthiourea (PTU) Eiwasser behandelt, um Pigment zu hemmen.
1. Erzeugung von Tg (fabp10a:il34) Transgene Konstrukte und Fischinjektion
2. Fluoreszierende Whole Mount In Situ Hybridisierung (WISH) kombinieren mit Immunostainierung
3. Live Imaging
Die Schritte im Protokoll der Zebrafische sind in Abbildung 2dargestellt. Zuerst haben wir das pBLK-fabp10a-il34-sv40 Konstrukt generiert, in dem il34 vom promotorium enwerter Bauart "fabp10a" angetrieben wurde (Abbildung 2). Das Konstrukt wurde mikroinjiziert in ein-Zell-Stadium Tg (mpeg1: GFP) Zebrafisch-Embryonen, die Makrophagen mit GFP- und WT-Embryonen kennzeichnen können, die zu Erwachsenen erhoben wurden, um transgene stabile Linie zu erzeugen (Abbildung 2). Die Expression von il34 wurde durch die gesamte Mount-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung analysiert (Abbildung 2 und Abbildung 3). Makrophagen, die durch GFP gekennzeichnet waren, wurden durch Immunfärbung analysiert (Abbildung 2 und Abbildung 3). Wir verwendeten Live-Bildgebung, um direkt zu beobachten, ob Makrophagen unter der il34-Induktion während 3-3,5 dpf in die Leber wandern würden ( Abbildung2, Abbildung 4, Ergänzender Film 1 und Ergänzender Film 2) .
Abbildung 1: Softwarebetrieb des konfokalen Mikroskops Live-Bildgebung. Öffnen Sie die ZEN black 2.3 Software, installieren Sie die lebende Zell-Workbench auf dem Mikroskop-Trägertisch, und klicken Sie dann auf Suchen (A) | Inkubation | Temperatur (B), um die Temperatur auf 29 °C einzustellen. Legen Sie die Schale in die Mitte der lebenden Zelle Werkbank, decken Sie den Fisch mit der E2-Lösung10 mit Tricain. Klicken Sie nach all diesen Ausweise auf das Menü "Erfassung" (C), wählen Sie den erforderlichen Scanmodus und die Laser im Menü Smart Setup (D) aus, und wählen Sie dann Z-Stack und Position (E) aus. Klicken Sie schließlich auf das Menü Experiment Designer (F), wählen Sie im ersten Block das Multiblock-Experiment aktivieren,um die Probe unter der niedrigen Vergrößerung zu finden, und wechseln Sie dann zur hohen Vergrößerung, lassen Sie den beobachteten Bereich im Mitte des Gesichtsfeldes, stellen Sie die Position und Z-Stack (G und H) Informationen, wählen Sie die entsprechende Laserintensität, Scan-Schichten und Bildgebungsgeschwindigkeit. Erstellen Sie einen neuen Block, und wiederholen Sie die obigen Schritte. Nachdem Sie alle Blöcke eingerichtet haben, legen Sie die entsprechende Anzahl von Schleifen (I) fest und starten Sie die Aufnahme. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Ein Workflow zur Untersuchung der Funktion eines Chemokins bei der Makrophagenmigration in vivo. Wir konstruierten ein gewebespezifisches (Leber-) Überexpressionsplasmid, um IL-34 zu überexpressen, und injizierten das Plasmid in transgene Fischembryonen im Einzellstadium, deren Makrophagen speziell durch ein fluoreszierendes Protein gekennzeichnet wurden (Tg: (mpeg1: GFP )). Die injizierten WT-Embryonen wurden erhöht, um eine stabile transgene Linie zu erzeugen. Wir verwendeten dann ganze Mount-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung und Immunostaining, um das Muster der Genexpression und die Anzahl oder Position der Makrophagen der transientinjizierten Embryonen oder stabilen Linienembryonen (4 dpf) zu erkennen. Schließlich verwendeten wir konfokale Live-Bildgebung, um das Makrophagenverhalten bei den stabilen transgenen Fischen (3-3,5 dpf) direkt zu beobachten, um die Funktion von IL-34 auf Makrophagen in vivo zu untersuchen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Fluoreszierende WISH kombinieren mit Immunostainierung. Diese Zahl wurde von Jiang et al.11geändert. Insgesamt 1,8 nL (30 ng/l) des pBLK-fabp10a-il34-sv40-Konstrukts wurden mikroinjiziert in einzellige Tg(mpeg1: GFP) Zebrafischembryonen. (A) WISH von il34-Expression (rot) und vollwertige Antikörperfärbung der GFP-Expression (grün) in 4 dpf Embryo (6x). Das Ganzkörperbild des Fisches besteht aus zwei getrennten Bildern, die von konfokalen und in Photoshop zusammengenähten Bildern aufgenommen wurden. Eintsets sind eine hohe Vergrößerung (20x) der entsprechenden geschachtelten Bereiche (orange gepunktete Bereiche). (B) Quantitative Analyse der Makrophagenzellzahlen in nicht injizierter und konstruktiv injizierter Embryosleber (im weiß gepunkteten Bereich dargestellt) und Schwanzbereich (ungefähr zwischen dem 13. und 17. Die Daten wurden durch Mann Whitney U Test analysiert, ** p < 0.01 im Vergleich zur Kontrolle. n = 5, 5 für die 4 dpf injizierten und kontrollieren den Fisch. Stäbe: 200 m (weiße Linie); 50 m (gelbe Linie). (C) WISH der il34-Expression und vollwertige Antikörperfärbung der GFP-Expression in 4 dpf stabilen Linienembryon (6x). Das Ganzkörperbild des Fisches besteht aus zwei getrennten Bildern, die von konfokalen und in Photoshop zusammengenähten Bildern aufgenommen wurden. Eintsets sind eine hohe Vergrößerung (20x) der entsprechenden geschachtelten Bereiche (orange gepunktete Bereiche). (D) Quantitative Analyse der Makrophagenzellzahlen in Tg (mpeg1: GFP) und Tg (fabp10a: il34; mpeg1: GFP) EmbryosLeber (im weiß gepunkteten Bereich dargestellt) und Schwanzbereich (ungefähr zwischen dem 13. und 17. Somite, dargestellt zwischen zwei weißen gepunkteten Linien). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Konfokale Live-Bildgebung zur direkten Beobachtung des Makrophagenverhaltens bei den stabilen transgenen Fischen. Diese Zahl wurde von Jiang et al.11geändert. Mikrographien der Live-Bildgebung zeigen den Prozess eines Makrophagens (grün, durch weiße Pfeile beschriftet), das innerhalb von 28 min an der Leber vorbeigeht (rot) in Kontrollfischen (A) und dem Prozess eines Makrophagens (grün, mit weißen Pfeilen beschriftet), das innerhalb von 28 in die Leber (rot) wandert. min in IL-34 überextierbaren Fischen (B). Skalenbalken = 40 m (weiße Linie). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzender Film 1: Live-Bildgebung, die den Prozess von Makrophagen (grün, mit weißen Pfeilen beschriftet) zeigt, die innerhalb von 2 h in IL-34-Überextierkungsfischen in die Leber (rot) wandern. Skalenbalken = 20 m (weiße Linie). Dieser Film wurde von Jiang et al.11wiederveröffentlicht. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Ergänzender Film 2: Live-Bildgebung, die den Prozess von Makrophagen (grün, mit weißen Pfeilen beschriftet) zeigt, die innerhalb von 2 h in Kontrollfischen um die Leber (rot) wandern. Skalenbalken = 20 m (weiße Linie). Dieser Film wurde von Jiang et al.11wiederveröffentlicht. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht es uns, die Funktion eines Chemokins auf das Verhalten von Macrophagein vivo zu untersuchen, und das Verfahren erfordert einige technische Servierkenntnisse. Zusammenfassend gibt es mehrere kritische Schritte, um Komplikationen im Protokoll zu vermeiden: 1) Wählen Sie eine geeignete transgene Linie, die spezifisches und starkes transgenes Signal zeigt, um die Zelle von Interesse zu kennzeichnen; 2) wählen Sie ein geeignetes Gewebe, das für die Bildgebung und transgene Genüberexpression zugänglich ist; 3) eine empfindliche und spezifische RNA-Sonde zu machen; 4) Wählen Sie ein geeignetes Beobachtungszeitfenster aus, um das Zellverhalten genau zu erfassen.
Bei der Operation der gesamten Mount-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung in Kombination mit Immunostainierung sollte die RNA-Sonde, die zum Nachweis der Genexpression verwendet wird, empfindlich sein und das Signal muss stark genug sein. Um die Genfunktion auf Zellverhalten zu erfassen, sollte eine Reihe von Zeitpunkten getestet werden. Zum Beispiel, bei der Beobachtung der Wirkung von il34 auf Makrophagen Migration, Obwohl der fabp10a Promotor begann, bei 2-3 dpf auszudrücken, Makrophagen Akkumulation in der Leber war nicht offensichtlich zu dieser Zeit. Erst durch 4 dpf wird die Anreicherung von Makrophagen in der Leber sichtbar. Darüber hinaus wird nach der In-situ-Hybridisierung die Signalintensität der nachfolgenden Immunfärbung beeinflusst. Im Vergleich zu GFP ist DsRed beispielsweise schwierig, die Immunfluoreszenzfärbung nach in situ-Hybridisierung zu färben, wahrscheinlich aufgrund der unterschiedlichen Proteinstrukturen. Im Allgemeinen wäre die Signalintensität der Immunfärbung nach der fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung geringer als die der Einzelimmunfärbung.
Im Live-Bildschritt mit dem konfokalen Mikroskop ist es notwendig, die Probe in der Nähe des Bodens der Schale zu halten. Wenn die Embryonen in Agarose schweben, kann der Arbeitsabstand des Objektivs nicht ausreichen, auch die Agarose zwischen dem Objektiv und der Probe würde die Qualität der Bildgebung beeinträchtigen. Außerdem sollte die Anzahl der Proben für die Bildgebung zu jeder Zeit richtig eingestellt werden. Man muss sicherstellen, dass die Zeitspanne zwischen zwei Scans jedes Fisches nicht zu lang wäre, um die Details des Zellverhaltens zu verlieren. Diese Methode eignet sich daher nicht für die Verfolgung von Zellen, die sich schnell in dicken Geweben bewegen.
Zusammenfassend kann dieses Protokoll verwendet werden, um die Funktion von Chemokinen auf das Verhalten einer Vielzahl von Zellen wie Makrophagen, Neutrophile und T-Zellen zu beobachten. Hier verwendeten wir IL-34, einen kürzlich identifizierten Liganden der CSF-1R-Funktion in Chemotaxis6,7, als ektopisch exprimiertes Chemokin, um Makrophagenmigration zu induzieren. Die meisten der bestehenden experimentellen Modelle von Zellchemotaxis basieren auf In-vitro-Zellexperimenten, aber die In-vitro-Experimente sind manchmal zu einfach, um die komplexe Umgebung in vivo zu modellieren. Auch ist es schwierig, die Chemo-Anziehungsfähigkeit in vivo abzubilden, wenn man sich einfach die In-vitro-Situation anschaut. Diese Methode nutzte die spezifischen Vorteile von Zebrafischen für die direkte Zellverhaltensbeobachtung, die für Mäuse schwierig ist. Die aktuelle Methode ermöglichte es uns, die Chemokin-Funktionen innerhalb weniger Tage schnell auf Zellverhalten zu testen und Zebrafische zu einem leistungsfähigen Modell zu machen, um die Molekular- und Zellbiologie zu studieren.
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Wir danken Dr. Jingrong Peng für die gemeinsame Nutzung der transgenen Tg-Linie (fabp10a: DsRed); Dr. Zilong Wen für die gemeinsame Nutzung der transgenen Tg(mpeg1: GFP) Dr. Koichi Kawakami für die Bereitstellung des pTol2-Vektors. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (31771594), Guangdong Science and Technology Plan Projects (2019A030317001) und den Fundamental Research Funds for the Central Universities (D2191450) unterstützt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibody | |||
Alexa 488-Anti-Goat antibody | Invitrogen | A11055 | |
Anti-Digoxigenin-HRP | perkinelmer | NEF832001EA | |
Goat-Anti-GFP antibody | Abcam | ab6658 | |
Reagent | |||
CaCl2· 2H2O | Sigma | 21097 | |
Cyanine 3 Plus Amplification Reagent | perkinelmer | NEL745001KT | |
E2 solution | 15 mM NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 µM KH2PO4 + 50 µM Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3 | ||
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life | 10099-133 | |
Formamide | Diamond | A100314 | |
Glycerol | Sigma | V900860 | |
Heparin sodium | Sigma | H3149 | |
Hybridization buffer(HB) | 50% formamide+ 5×SSC+9 mM sodium citrate+50 μg/ml heparin sodium+ 500 μg/mL tRNA+ 0.1% Tween20 | ||
KCl | Sigma | P5405 | |
KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
Low melting agarose | Sigma | A9414 | |
Methanol | GHTECH | 1.17112.023 | |
Methylene blue | Sigma | M9140 | |
MgSO4 | Sigma | M2643 | |
Na2HPO4 | Sigma | S5136 | |
NaCl | Sigma | S5886 | |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 158127 | Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 °C to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 °C. Caution. Manipulate with mask. |
10×PBS | 14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O | ||
Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
1×Plus Amplification Diluent | perkinelmer | NEL745001KT | |
Proteinase K | Fermentas | E00492 | |
20×Saline sodium citrate(SSC) | 175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0 | ||
Sodium citrate | Sigma | A5040 | |
Tricaine | Sigma | E10521 | |
tRNA | Sigma | R6625 | |
Tween20 | Sigma | P2287 | |
Plasmid | |||
pBLK-fabp10a-il34-sv40 | For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation | ||
pBSK-il34 | For il34 probe preparation | ||
Fish | |||
Tg (mpeg1: GFP) | Label macrophages with GFP | ||
Tg (fabp10a: DsRed) | Label liver cells with DsRed | ||
Tg (fab10a:il34) | Over-expression IL-34 in liver cells |
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