傷害による老化と生体内での骨格筋におけるリプログラミングの評価

ここで生体内でリプログラミングを誘導しながら傷害時に骨格筋の老化の両方を検出するための詳しいプロトコルおよび多能性幹細胞を提示します。このメソッドは、組織の再生中に細胞の老化の役割を評価し、生体内リプログラミングに適しています。

細胞の老化は、がんや高齢化など多くの生理学的および病理学的プロセスのために重要である安定した細胞増殖停止によって特徴付けられるストレス反応です。最近では、老化は組織の修復と再生にも関与しています。したがって、それは体内老化細胞を識別するますます重要になっています。老化関連 β ガラクトシダーゼ (SA β Gal) アッセイは、老化細胞の文化とin vivoの両方を検出する最も広く使われている試金です。この試金は、ライソゾームの β-ガラクトシダーゼ活性の組織化学的検出 (6 または 5.5) 以下の pH でことができます老化細胞のライソゾーム含量の増加に基づいています。これにより形態, 組織アーキテクチャに関する場所など貴重な情報を提供しています彼らの居住環境における老化細胞の同定、フローサイトメトリーなど、他の試金と比較して、免疫組織染色 (IHC) を介して他のマーカーとの結合の可能性。SA β Gal 試金の主要な制限は、新鮮なまたは冷凍サンプルの要件です。

ここで、どのように細胞老化を理解するための詳しいプロトコルは提示細胞の可塑性と組織再生の生体を促進します。怪我の組織再生を研究するのに確立されたシステムに骨格筋の老化細胞を検出するのに SA β Gal を使用します。さらに、トランスジェニック マウス モデルの Nanog、多能性幹細胞のマーカーを検出するのに IHC を使用します。このプロトコルを調べるし、細胞の老化誘導細胞の可塑性と生体内でリプログラミングのコンテキストでを定量化することが出来ます。

細胞の老化は、安定した細胞周期の阻止によって特徴付けられるストレス反応の形式です。研究は過去 10 年間で、老化が萌芽期の開発、線維化、生物^1,2の高齢化などさまざまな生物学的および病理学的プロセスに関連付けられていることをしっかりと確立しています。細胞の老化は、テロメアの短縮³によって引き起こされる彼らの分裂寿命の終わりに線維芽細胞で初めて確認されました。複製ストレスのほか、DNA 損傷、酸化ストレス、がん化シグナル ゲノム ・ エピゲノムの変化、うちのどれかが最終的に p21/p53 および pRB の細道を起動などの老化を引き起こすことができる他の多くの刺激があります。確立し、永続的な成長逮捕¹を強化します。老化細胞の重要な特性の 1 つは、彼らは代謝活性が維持され老化関連の分泌形質 (SASP) を力強く表現: 多くの炎症性サイトカイン、増殖因子、細胞外マトリックスの分泌要因⁴。SASP の要因は、媒介と増幅老化作用、免疫細胞を集め、ローカルおよび全身の組織調査¹を変更することで、強力な効果のために重要な役割を果たすに提案されている.興味深いことに、老化が最近組織修復と再生^5,6の重要であると提案されています。さらに、我々 を含む、いくつかのラボからのデータは組織損傷が誘導する老化が再生^7-9を促進するために、SASPs による細胞の可塑性を高める可能性を示唆しています。したがって、すべての新たなデータは、老化で生体を調査する重要性を強調表示します。

細胞の可塑性は、ポスト誘導多能性幹細胞 (iPSC) 時代文化とin vivoの¹⁰の異なる刺激にさらされると代替運命を採用する新しい id を取得するセルの能力です。におけるリプログラミング達成体内^11,12, をすることができます知られている場所の表現、山中 4 因子を含むカセット: Oct4、 Sox2、 Klf4、C-myc (OSKM) が誘導体内の複数の臓器の奇形の形成を促進することができます。したがって、重要な規制当局と細胞の可塑性¹¹にとって重要な経路を識別するために、強力なシステムとして再マウス モデル (i4F) を使用できます。

適切かつ敏感な体内システムがどのように細胞老化の理解に不可欠な組織再生における細胞の可塑性が調節します。ここでは、堅牢なシステムと老化と組織再生における細胞の可塑性の間のリンクを評価する詳細なプロトコルを提案します。(TA) 脛骨前方筋群、組織再生や i4F マウス モデルを研究する万全の体制で cardiotoxin (CTX) の組み合わせによる筋肉の損傷により細胞老化のin vivo検出筋再生中にプログラムし直します。

老化と細胞の可塑性の間のリンクを評価するには、i4F マウスは急性の筋肉の損傷を誘発する CTX と負傷、生体内でリプログラミングを誘発するドキシサイクリン (0.2 mg/mL) 7 日間で治療します。CTX 誘発急性筋肉の損傷、再生プロトコルは、倫理的な理由の最近公開された¹³をされている、現在のプロトコルでこの手順が省略されます。老化細胞のピークが以前¹⁴を観察されているとき、10 日間のポスト傷害¹³TA 筋サンプルが収集されます。ここでは、この詳細なプロトコルは、(SA β Gal) を経由して老化のレベルと (IHC 染色 Nanog) 経由でリプログラミングを評価するために必要なすべての手順を説明します。

老化関連 β ガラクトシダーゼ (SA β Gal) アッセイは、文化とin vivoの¹⁵の両方老化細胞を検出する最も一般的に使用される試金です。その他の試金に比べると、SA β Gal 試金はそのまま組織アーキテクチャでは、生体内で調査のため特に重要です彼らのネイティブ環境における老化細胞の同定をことができます。また、カップルは IHC を使用して他のマーカーと SA β Gal 試金することが可能です。ただし、SA β Gal 試金は、主な制限のまま新鮮なまたは冷凍のサンプルを必要は。新鮮なまたは冷凍の組織は TA 筋サンプルを冷凍など、日常的に使用できるが、SA β Gal は明らかに老化細胞を検出する最も適切な試金です。Nanog は 2 つの理由 reprogramed の細胞を検出するために使用されるマーカー: 1); 多能性の重要なマーカーは2) もっと重要なは、その表現はないドキシサイクリン (dox) によって駆動される、山中カセットの強制発現ではなく誘導多能性を検出するため。

本論文で示したプロトコルを汚す定量化手順を簡素化する個別に行うことができるが、また老化の両方を可視化する共同染色手順と同じセクションを多能性幹細胞で行うことができます注意してくださいが重要です。

欧州共同体ガイドラインとの Institut パスツール (CETEA) 承認プロトコルの倫理委員会に従って処理された動物

1。 在庫ソリューションの準備

1. 筋サンプル固定のための材料を準備します。筋固定のため凍結埋め込み媒体に RT で 20 mL の水で tragacanth ガムの 0.5 g を溶解します
。
2. SA β Gal の汚損のためのソリューションを準備します。
   1. 溶液 K ₃ Fe(CN) ₆ (100 mM)、K ₄ Fe(CN) ₆ (100 mM)、MgCl ₂ (1 M) 蒸留水でそれぞれの粉末を溶解することにより準備します
   。
   2. 0.2% C ₂₀ H ₆ Br ₄ Na ₂ O ₅ (エオジン) の原液を水で希釈して準備します
   。
   3. ない (ジメチルホルムアミド、DMF) C ₃ H ₇ X gal 粉末を溶解することにより原液 C ₁₄ H ₁₅ BrClNO ₆ (X-gal) (50 mg/mL) を準備します
   。
   4. ストア K ₃ Fe(CN) ₆ と 4 ° c、K ₄ Fe(CN) ₆ ソリューションと室温 MgCl ₂
      注: X gal に格納できる因数-20 ° C で最大 6 ヶ月。エオシン ソリューションは常温保管し、必要に応じてフィルター処理後に再利用できます。K ₃ Fe(CN) ₆ K ₄ Fe(CN) ₆ ソリューションは、protectedfromthe ライト。光から保護するため、耐水性ではない X gal ソリューションです
   。
3. Nanog 染色溶液の調製: 透過ソリューションを含む 0.1% Na ₃ C ₆ H ₅ O ₇ (クエン酸ナトリウム)、0.1% C ₁₄ H ₂₂ O (C ₂ H ₄ O) _n (n = 9 10) (トリトン X-100) 蒸留水 4 で貯えられるべき ° C は、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、右に格納する必要がありますでブロッキング溶液 5% ウシ胎児血清 (FBS) を準備

2。TA 筋部の凍結に SA β Gal 染色

1. コルクのスライスにガム、tragacanth の少量を置くことによって脛骨筋の固定材料を準備します
。
2. 負傷マウス雌雄 (2 ヶ C57/B6) の負傷した cardiotoxin (CDX) と 10 日前に ¹³ を前述のよう。負の制御として同じマウスから非負傷した (PBS インジェクション) TA を使用します。生体内で 書き換えが必要な場合治療 Dox (1 mg/mL) と各マウス水を飲んで (光から保護)、同じ日に CTX 損傷直後後
   。 注: Dox ソリューション 3 日総治療日数を 7 日に変更する必要があります。
   1. は、( 図 1 a) ¹³ を前述のマウスから両方の TA 筋肉 (負傷および制御) を分離します。横断切片を確保、tragacanth ガムに TA 筋の遠位腱を挿入し、( 図 1 b) 外筋の約 ¾ 一部を残して、液体窒素にて凍結する冷却のイソペンタン < 1分
      注: 脛骨筋が垂直な位置で、コルクの中心部にされていることを確認します。-80 ° C または直接 10 μ m のセクションで cryosectioned でサンプルを格納できます
   。
3. 図 1 b のように TA 筋肉を処理します。 各スライドの上部の左位置に 10 の異なるスライドに正しい順序で
   1. 配布、1 ^st-10 ^th セクション。11 ^番目 のセクションを配置するには、1 ^st セクションに隣接して最初のスライド12 ^番目 のセクション、2 番目のスライドの 2 ^nd セクション以外にも右を配置する同じ順序に従います。10 セクション/スライドが 10 スライド (合計で 100 セクション) の最初のセクションと前のセクション間の最小 1 mm を確実に得られるまでこのプロセスを繰り返します
   。
4. 1% パラホルムアルデヒドと 0.2% グルタルアルデヒドを含む PBS では 4 分のセクションを修正します。2 x 10 分、PBS で洗浄します。次に、PBS でセクションを孵化させなさい (pH 5.5 を =) 30 分室温のすべての手順を実行します
   。 注: 固定は、酵素活性を維持するために軽度でなければなりません。この手順では、フードの下で。PBS の pH が重要であり X gal ソリューションは光から保護する必要があります
。
5. X gal のソリューションを含む加温セクション: pbs は、400 μ g/mL X Gal MgCl2、2 mM、4 mM K4Fe(CN) ₆ 4 mM K3Fe(CN) ₆ pH 5.5 を =。孵化 24 時間洗浄の最小値の 37 ° C で暗闇の中、pbs 室温の 3 × 10 分のスライド
   注: 孵化 24 時間の最小値を必要とし、SA β Gal 信号を最大にする 48 時間の最後のことができます。ソリューションは培養 24 時間後に変更する必要があります。スライドは、光から保護する必要があります。SA β Gal の染色が必要な場合にのみは、2.5 の手順に進みます。Nanog 染色が必要な場合してくださいにスキップ ステップ 3.1
。 30 分洗浄 PBS の
6. 修正スライド 1% パラホルムアルデヒドの 3 × 10 分 0.2% エオシン対比染色、pbs スライドします。エオシン溶液 1 分間のスライドを浸すし、簡単に蒸溜水でそれらをすすいでください。最後に、非蛍光剤取り付けの水溶液でのスライドをマウント (材料の表 を参照してください).
   注: それはポストの固定を行うために不可欠です。この手順では、フードの下で。ルートですべての手順を実行

3。免疫組織化学を使用して反 Nanog 抗体

1. 、スライドに直接透過液の 2 x 10 分追加 200 μ L の PBS で 10 分洗浄 4% パラホルムアルデヒドを含む PBS でスライドを固定し、5 分間インキュベートします。
   1. 洗浄スライド PBS、2 x 5 分と最後の洗浄、使用 200 μ L の PBS のスライドで直接 0.25 %bsa を含みます。室温のすべてのこれらの手順を実行します
      注意: は、フードの下で固定の手順を実行します
   。
2. 主アンチ Nanog 抗体 加温スライド (最終濃度: 1.25 μ G/ml) 4 ° c 5% を含む PBS で一晩 FBS。PBS、2 x 10 分でスライドを洗って最後の洗浄で 5 分実行 0.25 %bsa を含む使用 200 μ L の PBS をすべての洗浄を室温ステップ
   注: インキュベート蒸発を防ぐために湿らせたペーパー タオルをボックスのスライドです
。 使用する準備ができてから rAb HRP 二次抗体の 100 μ L で
3. 加温スライド キット (材料の表 を参照してください) に PBS、3 x 5 分付き 45 分洗浄用スライドの二次抗体を削除します。光から保護と RT ですべての手順を実行します
。
4. 可視化
   1. 最初に、希釈、3, 3 '-ジアミノベンジジン (C ₁₂ H ₁₄ N ₄ C ₁₂ H ₁₈ Cl ₄ N ₄ (₄ HCl) 軽くたたく) 基板バッファー内キット (基板バッファー溶液 1 mL のために軽打の 20 μ L) を使用する準備ができてによって提供されます。各スライドに直接 DAB 溶液 100 μ L を追加し、最大室温 10 分間インキュベート
      注意: DAB 薄めたたて準備する必要があります、4 ° C で最大一週間保存することができます。インキュベーション時間バック グラウンド信号を最小限に抑えるために調整することができますが、すべてのスライドの同じを保持する必要があります
   。
   2. は、水ですすいで DAB ソリューションを削除します。Counterstain 速い赤ソリューション (準備 材料の表 を参照) を持つスライド 20 分洗浄水スライド再度簡潔にします
   。
   3. は 95% のエタノール 5 m のによってそれらを脱水します。100% エタノール, 2 x 5 分後に。最後に、迅速な硬化取付中のスライドをマウント (材料の表 を参照してください).
   4. は、バック グラウンドを避けるために 20 X に明視野顕微鏡でスライドを観察
      。 注: 高速赤色溶液常温保管して再使用できるフィルタ リングの後
   。

4。分析と定量化

1. SA β Gal 定量化
   1. スライドをスキャンし、取得した画像に基づく各スライドのベスト セクションを選択します。定量化のため少なくとも 2 セクション/TA を使用します。セクションを判断 ' s 質組織の整合性、染色、counterstaining の品質に基づいています。定量化, 全体の TA 筋を通して SA β Gal 定量化のより豊かな表現を可能にするサンプル間に最大可能距離と 2 つの最高品質のセクションを選択します
   。
   2. SA β Gal 陽性細胞 ( 図 2) の定量化。
      1. の最小と最大の肯定的な SA β Gal セルを手動で選択してピクセルのサイズ ランクを決定します。
         1. ImageJ ソフトウェアを使用してスキャンしたスライドのデジタル画像を開きます
         。
         2. インターフェイスでは、をクリックして ' 分析 ' > ' ツール ' > ' ROI マネージャー ' > ' 分析 ' > ' 測定を設定 ' > ' 領域を選択 '。選択ツールを使用し、サラウンド、最小および最大正 SA-β-Gal 携帯しをクリックして ROI マネージャーに追加 ' 追加 '。使用してサイズを測定、' 測定 ' ボタンをクリックし、後で使用する値を保存します
         。
      2. すべての表示されている肯定的なセルが選択されてを確認するしきい値パラメーターを調整します。
         1. 変換をクリックしてグレースケール画像 ' 画像 ' > ' タイプ ' > ' 8 ビット ' ( 図 2 a)。次へ ' 画像 ' > ' 調整 ' > ' しきい値 '、すべての肯定的な SA β Gal のセルは赤 ( 図 2 b) で覆われるまで 2 番目のカーソルを移動し、クリックして ' 適用 '.
         2. をクリックして分析粒子 ' 分析 ' > ' 粒子の分析 ' > ' サイズ (ピクセル ^2) '、4.1.2.1 のステップで定義された値を適用して、入力 ' 循環 ': ' 0.00 1.00 '、クリックして ' ok '; すべての概要が、カウント粒子が ROI マネージャー ( 図 2 D) で表示されます
         。
      3. 元の画像を選択したすべての粒子を転送します。定量の正確さを確認する手動で選択範囲を調整します。陽性細胞 (緑色の矢印、 図 2 e) を追加および偽陽性細胞 (赤矢印、 図 2 e) を削除します。最後に、アウトラインのセクション ( 図 2 D) 使用によって区域を測定、' 選択ツール '。クリックして ' ROI マネージャー ' > ' 追加 ' > ' メジャー '.
      4. 重要なは、断面の面積によって陽性細胞数を正規化します
      。
2. Nanog 定量化
   1. 20 倍の倍率で手動で明視野顕微鏡 Nanog 陽性細胞をカウントします
      。 注: 高速赤 counterstaining TA 筋の形態の良い評価が可能します。ただし、染色は非常に軽い、セクションの明確な輪郭を欠いています。スキャナーは、しばしばセクションの境界を識別するために失敗し、フォーカスを正しくことはできません。マーカーを使用して、スキャンする前に、断面図のエッジを円またはセクションを検出するより敏感なスキャナーを使用することが可能です。現在のプロトコルの Nanog 陽性細胞を手動でカウントする効率的です
   。

筋肉傷害による細胞老化の検出

最近では筋損傷が細胞の老化が過渡¹⁴を誘導すること示されています。10 日後に損傷 (DPI)、損傷した筋線維の大部分は、中心部にある核、再生、筋線維の特徴と再生を受けているし、筋のアーキテクチャが再確立されました。浸潤炎症細胞が特定の地域で表示を維持しながら大幅に減少します。10 DPI 少ない壊死と炎症性細胞は染色を妨害する筋の存在があるので、SA β Gal が老化細胞を検出する良い時間点であります。染色の特異性を決定するには、同じマウス (図 1 a) から PBS を注入した TA は重要なネガティブ コントロールとして使用されます。

SA β Gal 陽性細胞のより良いより正確な評価を確保するため、TA 筋肉の別の平面からのセクションは、同じスライド (図 1 b) に配置されます。エオシン染色カウンターは、ImageJ ソフトウェアによって SA β Gal 陽性細胞の自動定量化のため重要です。エオシン カウンター染色により、正しいフォーカスを持つセクションを検出するデジタル スキャナー] セクションをについて説明します。慎重に範囲と (図 2 a-d) 検出のしきい値を定義することが重要です。さらに、手動で精選されたプロセスのより正確な検出と定量化 (図 2 e) を許可することが欠かせません。

細胞の老化促進体内筋におけるリプログラミング

リプログラマブル マウス モデル (i4F) は、細胞の可塑性と再生に関する老化の影響を評価する理想的なシステムを提供します。筋肉の損傷、時に i4F マウスは、リプログラミング体内誘導する dox と扱われます。7 日 dox (1 mg/mL) 治療は、まだマウス (図 3 a)、忍容性、細胞のレベルでは、リプログラミングを誘導するために十分です。したがって、我々 は dox を 7 日間投与した i4F マウスから 10 Dpi で負傷した筋肉を収穫します。

Nanog の SA β Gal の共同染色を行うことは、潜在的な干渉染色による定量化のためそれはお勧めしません。前述のようはカウンター染色デジタル検出にとって欠かせないものです。染色 Nanog とともに SA β Gal の最高のカウンターが速い赤 orhematoxylin です。ただし、SA β Gal または Nanog の信号をカウンターを汚す可能性がありますマスク。したがってより正確な定量化する連続したスライド (図 3 b) 上で個別に実行することをお勧めします。SA β Gal 陽性と隣接するスライドから Nanog 陽性細胞を定量化することで細胞の可塑性と再生に関する老化の潜在的な関与を示唆している (図 3)、それらの間の正の相関関係を確立しました。

図 1: 筋損傷後の老化度を評価します。(A)老化を誘導するために使用される筋肉傷害戦略の概略図。(B)筋セクション準備の模式図。(C) SAβGal counterstained エオシンで染色の代表的なイメージ。矢印は、SA β Gal⁺のセルをポイントします。スケール バー = 50 μ m。 SA β Gal⁺の(D)の定量化は負傷者や非負傷した TA 筋細胞。各ドットは、個々 の動物に対応します。統計的有意性は、2 尾 Student´s t-テストによって評価された: * * * p < 0.001。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: ImageJ ソフトウェアによる SA β Gal⁺細胞の数量。ソフトウェア インターフェイスで ImageJ 筋部(A ~ D)スクリーン ショット。グレースケール(A)に筋断面画像の変換のスクリーン ショットすべての SA を選択する-β-Gal + (B)セクションのセルの(C)選択した粒子の分析ROI マネージャー (D)ですべてのカウント particals の概要です。(E)手動キュレーションのプロセスの設定画面します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3:生体内でリプログラミング筋損傷後の評価。 (A)模式図筋損傷後体内のリプログラミングや老化のレベルを評価します。(B) SA β Gal、Nanog は破損した骨格筋の凍結切片の染色の代表的なイメージ。(左); エオシン染色 counterstained SAβGal免疫組織化学的染色 Nanog 高速赤 (右) と counterstained。非負傷した筋肉は、トップと負傷者筋の下に表示されます。スケール バー = 50 μ m。 (C)定量化および SA β Gal ⁺と連続したセクションの Nanog⁺セルの相関 (n = 9 マウス値はマウスごとの 2 つのセクションの平均を表します)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

表 1:50 mL X gal ソリューションの成分。

ここでは、リプログラマブル マウスの骨格筋の老化の両方を検出する方法と、多能性幹細胞を提示します。このメソッドは、評価、両方老化を定量化し体内細胞の可塑性、誘発して組織の修復・再生老化の役割を調べるに使用可能性があります。

現在のプロトコル老化関連 β ガラクトシダーゼ (SA β Gal) 試金を使用して、骨格筋における体内老化細胞を検出します。この試金は、この酵素の活性は通常酸性 pH 4.5^16,17で測定しながら老化細胞に具体的に関連付けられている値を受け渡す pH (6.0 あるいは 5.5) で増加ライソゾーム β-ガラクトシダーゼ活性を検出します。したがって、pH を調整することが重要だ (pH = 6 または 5.5) 老化関連アクティビティの特定の検出を確保するため。さらに、カウンター エオシンで染色が弱いと拡散反射光の信号をカウントされません SA β Gal⁺セルの自動定量化のため不可欠です。潜在的な変動を避けるためには、同じ人が数えるプロシージャ全体を実行することが望ましいです。

SA β Gal 試金は最も広く使用され、老化細胞のバイオ マーカーを受け入れ、老化の排他的なマーカーではありません。それは過剰合流培養細胞が SA β Gal¹⁸偽陽性を引き起こす可能性が示唆されています。アッセイの感度は、電池の種類をすることができ、組織が依存して生体内で¹⁹を入力します。したがって、それはさらに確認し、特徴付ける増殖、老化メディエーター (p16、ARF、p53、p21、p27) の発現増加と SASP 因子の分泌の不足などの他の独立した標準的なマーカーを使用する必要老化の生体。また、適切な否定的なコントロールは、特に生体内で研究結果を解釈するために不可欠ではありません。

完璧な SA β Gal 試金ではないという事実にもかかわらず、生体内での研究の特に貴重な情報を提供それは。それはそのまま組織アーキテクチャでは、生理学的および病理組織学的に異なる老化細胞の役割のさらなる理解を促進する重要な情報を提供する居住環境の老化細胞の検出が可能します。コンテキストです。老化細胞の細胞のアイデンティティを決定する細胞表面マーカーなど、他のマーカーの免疫染色の結合されたさらに、または未分化マーカー老化再生と癌の潜在的な関与を調べる。以前、Nanog 同じセクションまたは近接の老化及び生体内で⁸をリプログラミングの潜在的なリンクを調査するための免疫組織化学的染色を持つ SA β Gal アッセイを行った。このプロトコルは骨格筋に焦点を当ては、他の組織に確かに拡張できます。

最近では、細胞の老化は、組織の修復と再生、SASPs^7,8,9を介して可能性が最も高いに関与しています。老化が組織の修復と再生に貢献する方法のメカニズムを理解することは確かに、途方もない影響再生医療。この試金は、識別を容易にするために重要かつ貴重なツールを提供し、体内細胞の老化の定量化。

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

彼女の優れたテクニカル サポートの Clemire Cimper にお世話になっております。H.L. の研究室での仕事は、パスツール研究所、凝った科学センターの注ぐラ ・ アジャンス ナシオナル デ ラ凝った (フランス d'Excellence リバイブ、Investissement d'Avenir; によって賄われていたANR-10-LABX-73)、アジャンス ナシオナル デ ラ抜き (ANR-16-CE13-0017-01) および財団アーク (PJA 20161205028)。C. c. と交流は、博士・復活のコンソーシアムからドクターによって賄われています。