骨骼肌损伤诱导衰老和体内重编程的评价

在这里, 我们提出了一个详细的协议, 以检测两个衰老和多能干细胞的骨骼肌肉损伤时, 诱导在体内重新编程。该方法适用于评价细胞衰老在组织再生过程中的作用和重新编程体内。

细胞衰老是一种应激反应, 其特点是稳定的细胞生长阻滞, 这是重要的许多生理和病理过程, 如癌症和衰老。最近, 衰老也牵涉到组织修复和再生。因此, 识别衰老细胞在体内变得越来越重要。衰老相关的β-乳糖 (SA β-加仑) 检测是最广泛使用的检测方法, 在培养和体内的衰老细胞。这种方法是基于在衰老细胞中增加溶酶体的含量, 这使得在 suboptimum pH 值 (6 或 5.5) 上, 组织化学检测溶体乳糖活性。与其他的检测方法, 如流式细胞仪, 这使得在其居住环境中的衰老细胞的鉴定, 这提供了宝贵的信息, 如与组织结构的位置, 形态学, 和通过免疫组织化学 (IHC) 与其他标记物耦合的可能性。对新鲜的或冰冻的样品的要求是对 SA β-加仑测定的主要限制。

在这里, 我们提出了一个详细的协议, 以了解如何细胞衰老促进细胞可塑性和组织再生在体内。我们使用 SA β-加仑来检测骨骼肌损伤后的衰老细胞, 这是一个行之有效的组织再生研究系统。此外, 我们使用 IHC 检测 Nanog, 一个多能干细胞的标志, 在转基因小鼠模型。该协议使我们能够检查和量化细胞衰老的背景下诱导细胞可塑性和体内重新编程。

细胞衰老是一种以稳定的细胞周期阻滞为特征的应激反应形式。在过去的十年中, 研究已经确定衰老与各种生物学和病理过程有关, 包括胚胎发育、纤维化和生物体老化^1,2。细胞衰老首先被确定在人成纤维细胞在其复制寿命结束时由端粒缩短³触发。除了复制的压力, 还有许多其他刺激, 可以诱导衰老, 包括 DNA 损伤, 氧化应激, 致癌信号, 和基因组/表的改变, 其中任何可能最终激活 p53/p21 和/或 pRB 途径建立并加强永久性增长逮捕¹。衰老细胞的一个重要特征是它们保持新陈代谢活性, 并表现出衰老相关的分泌表型 (SASP): 许多炎症细胞因子、生长因子和细胞外基质的分泌因素⁴。SASP 因子在调节和增强衰老作用方面起着重要作用, 因为它们对吸引免疫细胞和改变局部和全身组织环境¹有很强的影响。有趣的是, 衰老最近被提出是重要的组织修复和再生^5,6。此外, 包括我们在内的几个实验室的数据表明, 组织损伤导致的衰老可能增强细胞的可塑性, 通过 SASPs, 促进再生^7-9。因此, 所有涌现的数据突出了研究衰老的重要性在体内。

在后诱导多能干细胞 (iPSC) 时代, 细胞可塑性是一个细胞获得一个新的身份和采取替代的命运时, 暴露在不同的刺激, 在文化和在体内¹⁰的能力。众所周知, 完全重新编程可以实现在体内^11,12, 其中包含四 Yamanaka 因素的卡带的表达: Oct4, Sox2, Klf4, 和c-myc(OSKM) 可诱导体内促进多器官畸胎瘤的形成。因此, 一个编程的小鼠模型 (i4F) 可以被用来作为一个强大的系统, 以确定关键的调节器和路径, 是重要的细胞可塑性¹¹。

一个合适的和敏感的在体内系统是必要的, 以了解如何细胞衰老调节细胞可塑性的背景下组织再生。在这里, 我们提出了一个健壮的系统和详细的协议, 以评估在组织再生的背景下衰老和细胞可塑性之间的联系。心脏 (酰) 诱导的肌肉损伤的胫骨前 (TA) 肌肉组, 一个行之有效的系统研究组织再生, 和 i4F 小鼠模型, 允许检测细胞衰老和在体内在肌肉再生过程中重新编程。

为了评估细胞可塑性和衰老之间的联系, i4F 小鼠受酰损伤, 用强力霉素 (0.2 毫克/毫升) 在7天内诱发急性肌肉损伤, 以诱导体内重编程。虽然酰引起的急性肌肉损伤和再生协议最近已发布¹³, 出于道德上的原因, 此过程将在当前协议中省略。TA 肌肉样本将收集在10天后受伤的¹³, 当衰老细胞的峰值已经被观察到之前,¹⁴。在这里, 这个详细的协议描述了所有的步骤来评估衰老的水平 (通过 SA β-加仑) 和重新编程 (通过 IHC 染色 Nanog)。

衰老相关的β-乳糖 (SA-β-加仑) 检测是最常用的检测方法, 可以在培养和体内¹⁵中发现衰老细胞。与其他检测方法相比, SA β-加仑法可以在其本机环境中使用完整的组织结构来鉴定衰老细胞, 这对体内研究尤为重要。此外, 它是可能的夫妇的 SA β加仑测定与其他标记使用 IHC。然而, SA β-加仑检测确实需要新鲜或冰冻样本, 这仍然是一个主要的限制。当新鲜或冰冻的组织是常规可用的, 如冰冻的 TA 肌肉样本, SA β-加仑显然是最合适的检测衰老细胞的方法。Nanog 是用于检测 reprogramed 细胞的标记, 有两个原因: 1) 是多的重要标志;2) 更重要的是, 它的表达不是由强力霉素 (dox) 驱动的, 因此它检测诱导的多而不是 Yamanaka 盒的强迫表达。

值得注意的是, 本研究中提出的染色协议可以单独进行, 以简化量化程序, 但也可以在 co-staining 过程中进行, 以在同一剖面上显示衰老和多能干细胞。

动物按照欧洲共同体的准则和巴斯德研究所 (CETEA) 批准的议定书的伦理委员会处理.

1. 库存解决方案的准备工作

1. 准备用于肌肉标本固定的材料。将0.5 克的粉胶与20毫升的水溶于 RT, 用于肌肉固定的冷冻埋入培养基.
2. 准备 SA 和 #946 的解决方案;-Gal 染色.
   1. 通过在蒸馏水中溶解各自的粉末, 准备 k ₃ Fe (cn) ₆ (100 mm)、k ₄ Fe (CN) ₆ (100 mm)、氯化镁 ₂ (1M) 的库存解决方案.
   2. 准备 0.2% C _{的库存解决方案 20} H ₆ Br ₄ Na ₂ O ₅ (曙红) 稀释它在水中。
   3. 准备 c ₁₄ H ₁₅ BrClNO ₆ (x gal) (50 毫克/毫升) 的库存解决方案, 方法是在 c ₃ H ₇ NO (胺, DMF) 中溶解 X gal 粉末.
   4. 存储 K ₃ fe (cn) ₆ 和 k ₄ fe (cn) ₆ 解决方案位于4和 #176; C 和氯化镁 ₂ 在 RT 上.
      注意: X gal 可存储在分-20 和 #176; C, 最多6月。红红溶液可在 RT 中保存, 必要时可在过滤后再使用。k ₃ Fe (cn) ₆ 和 k ₄ Fe (cn) ₆ 解决方案是 protectedfromthe 光。X gal 解决方案在水中不稳定, 必须保护不受光照.
3. Nanog 染色解决方案的准备: 性解决方案包含 0.1% Na ₃ c ₆ h ₅ o ₇ (柠檬酸三钠), 0.1% c ₁₄ h ₂₂ o (c ₂ h ₄ O) _n (n = 9-10) (海卫 X-100) 在蒸馏水中, 应储存在4和 #176; c. 制备含有5% 胎牛血清 (FBS) 的含磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的阻断溶液, 应在 RT 中保存.

2。SA 和 #946;-Gal 染色在冰冻的 ta 肌肉部分

1. 为 TA 肌肉准备固定材料, 将少量的粉胶放在软木片上.
2. 受伤的小鼠 (2 月大, C57/B6) 在10天前与心脏 (CDX) 一起受伤, 如前面所描述的 ¹³ 。使用受害 (PBS 注入) TA 从同一个鼠标的负控制。如果 在体内 需要重新编程, 则在 Dox (1 毫克/毫升) 在饮用水中的同一天 (保护免受光照), 在酰损伤后.
   注: Dox 解决方案需要每3天更换一次, 总处理时间为7天。
   1. 将两个 TA 肌肉 (受伤和控制) 从小鼠中分离出来, 如前所述 ( 图 1A ) ¹³ 。为了确保横断面, 将 TA 肌肉的远端肌腱插入粉胶中, 并 #190; 部分肌肉外 ( 图 1B ), 并直接冻结在液氮冷却戊的 #60; 1最小
      注意: 确保 TA 肌肉处于垂直位置, 并在软木塞的中心。样品可存储在-80 和 #176; C 或直接 cryosectioned 在10和 #181; m 部分.
3. 处理如 图 1B 中所述的 TA 肌肉。
   1. 将 1 ^st -10 ^th 节按正确的顺序分发到每张幻灯片左上角的十张不同的幻灯片上。将 11 ^th 节放在第一张幻灯片的 1 ^st 部分的旁边;除第二张幻灯片上的 2 ^nd 部分外, 12 ^th 节将按照相同的顺序放置。重复此过程直到10节/幻灯片获得十张幻灯片 (总共100节), 以确保第一节和最后一节之间的最小 1 mm 距离.
4. 在 PBS 中固定4分钟, 其中包含1% 甲醛和0.2% 戊二醛。用 PBS、2x 和 #160 冲洗; 10 分钟接下来, 在 PBS (pH = 5.5) 中孵育30分钟的部分, 执行 RT 中的所有步骤.
   注意: 固定必须是温和的, 以保持酶活性。在引擎盖下面执行此步骤。PBS 的 pH 值是至关重要的, 必须保护 X gal 解决方案免受光照.
5. 在 x gal 解决方案中孵育部分, 其中包含: 4 mm K3Fe (cn) ₆ 、4 mm K4Fe (cn) ₆ 、2 mm MgCl2 和400和 #181; PBS 中的 g/mL X gal, pH = 5.5。在黑暗中孵育37和 #176; C 至少24小时. 用 PBS 冲洗幻灯片, 3x 10 分钟, 在 RT 上.
   注意: 孵化需要至少24小时, 并可持续48小时, 以最大化 SA 和 #946;-Gal 信号。该解决方案需要在24小时的孵化后改变。应保护幻灯片不受光照。如果只需要 SA 和 #946;-Gal 染色, 请继续执行步骤2.5。如果需要 co-staining 与 Nanog, 请跳到步骤 3.1.
6. 在 pbs 中修复1% 甲醛中的幻灯片, 用 pbs 进行30分钟的洗涤, 3x 10 min. Counterstain 与0.2% 曙红。将这些幻灯片浸泡在红红溶液中1分钟, 并简单地用蒸馏水冲洗。最后, 用水性 non-fluorescing 安装介质安装幻灯片 (请参阅 材料表 ).
   注意: 必须执行 post-fixation。在引擎盖下面执行此步骤。所有步骤都在 RT 上执行.

肌损伤诱导细胞衰老的检测

最近已经证明, 肌肉损伤诱发短暂的细胞衰老¹⁴。在10天后 (DPI), 大部分受损的纤维正在进行再生与中央定位核, 一个标志, 再生纤维, 并重建肌肉的结构。在某些地区, 浸润性炎症细胞明显减少, 但仍可见。10 DPI 是一个很好的时间点来检测衰老细胞的 SA β-Gal, 因为有较少的坏死和炎症细胞存在于肌肉, 以干扰染色。为了确定染色的特异性, 用 PBS 从同一个鼠标 (图 1A) 注入的 TA 作为临界负控制。

为了确保更好和更精确地评估 SA β-加仑阳性细胞, 不同平面的 TA 肌肉的截面被放置在同一张幻灯片中 (图 1B)。用曙红的反染法对 ImageJ 软件自动定量化 SA β-加仑阳性细胞非常重要曙红反染色概述了该部分, 它允许数字扫描仪检测的部分与正确的焦点。仔细定义检测范围和阈值非常重要 (图 2A-d)。此外, 手动策划的过程对于允许更准确地检测和量化 (图 2E) 是必不可少的。

细胞衰老在肌肉中促进体内的重新编程

编程鼠模型 (i4F) 提供了一个理想的系统来评估衰老对细胞可塑性和再生的影响。在肌肉损伤时, i4F 小鼠用 dox 治疗, 以诱发体内重编程。7天 dox (1 毫克/毫升) 的治疗是足够的诱导重新编程的细胞水平, 而仍然是良好的耐受小鼠 (图 3A)。因此, 我们在7天内从 i4F 小鼠身上收获 10 DPIs 的受伤肌肉。

虽然有可能执行 co-staining 的 SA β加仑与 Nanog, 它不建议定量由于潜在的干扰染色。如上所述, 计数器染色是数字扫描仪检测的关键。最好的反染色的 SA β-加仑连同 Nanog 是快速红色 orhematoxylin。然而, 反染色可能掩盖在任何 SA β-加仑或 Nanog 信号。因此, 为了更精确地量化, 最好在连续的幻灯片上分别执行它们 (图 3B)。通过从相邻的幻灯片中量化 SA β-Gal 阳性和 Nanog 阳性细胞, 我们建立了它们之间的正相关 (图 3C), 表明衰老对细胞可塑性和再生的潜在参与。

图 1: 评估肌肉损伤后的衰老水平。(A)用于诱导衰老的肌肉损伤策略的图示。(B)肌肉切片准备的示意图表示。(C) SAβGal 染色1-4 与曙红的代表性图像。箭头指向 SA β-Gal⁺单元格。缩放条形图 = 50 µm. (D)定量的 SA β-加仑的⁺细胞在受伤和受害的 TA 肌肉。每个点对应于一个单独的动物。统计学意义由双尾 Student´s t 检验: ** 和 #60; 0.001。请单击此处查看此图的较大版本.

图 2: 通过 ImageJ 软件对 SA β-Gal⁺单元格进行量化。 (a-d) ImageJ 软件界面中的肌肉部分的屏幕截图。将肌肉切片图像转换成灰度级(a)的屏幕截图;在(B)部分中选择所有 SA β-Gal + 单元格;分析所选粒子(C);ROI 管理器(D)中所有计数的颗粒的汇总。(E)手动治疗过程的屏幕快照。请单击此处查看此图的较大版本.

图 3: 肌肉损伤后重新编程的体内的评估。 (A) 在体内重编程和肌肉损伤后的衰老水平进行评估的示意图表示。(B)有代表性的图像的 SA β加仑和 Nanog 染色的冰冻切片受损骨骼肌。SAβGal 染色1-4 与曙红 (左);快速红 (右) Nanog 1-4 的免疫组织化学染色。无损伤的肌肉显示在顶部和受伤的肌肉下面。缩放条形图 = 50 µm. (C)在连续的部分中, SA β-Gal ⁺和 Nanog⁺单元格的量化和关联 (n = 9 鼠标, 值代表每只老鼠的2部分的平均值)。请单击此处查看此图的较大版本.

表 1:50 毫升 X 加仑溶液的组成。

在这里, 我们提出了一种检测编程小鼠骨骼肌中的衰老和多能干细胞的方法。该方法可用于评价和量化衰老和诱导细胞可塑性在体内, 并检查衰老在组织修复和再生中的作用。

在目前的协议, 衰老相关的β-乳糖 (SA β加仑) 检测被用来探测体内衰老细胞的骨骼肌肉。这种检测检测到增加的溶酶体β-乳糖活性在 suboptimum ph 值 (6.0 或 5.5), 特别是与衰老细胞相关, 而这酵素的活动通常测量在酸性 ph 值 4.5^16,17。因此, 重要的是要调整 ph 值 (ph 值 = 6 或 5.5), 以确保特定的检测衰老相关的活动。此外, 与曙红的反染色是必不可少的自动定量的 SA β-加仑的⁺细胞, 其中弱和漫无信号的计数。为了避免潜在的变异性, 最好是同一个人执行整个计数过程。

虽然 SA β-加仑检测是最广泛使用和接受的生物标志物衰老细胞, 它不是一个独家标记的衰老。有人建议, 在文化中的 over-confluent 细胞可能会导致假阳性的 SA β Gal¹⁸。检测的灵敏度可以是细胞类型和组织类型依赖在体内¹⁹。因此, 有必要使用其他独立的标准标记, 如缺乏增殖, 增加表达衰老调解人 (p16, ARF, p53, p21 和 p27), 并分泌各种 SASP 因素, 进一步确认和表征衰老在体内。此外, 适当的负控制是必不可少的解释结果, 特别是对在体内研究。

尽管 SA β-加仑检测并不完美, 但它确实为体内研究提供了特别有价值的信息。它允许检测在其居住环境中的衰老细胞与完整的组织结构, 提供重要的信息, 促进进一步了解衰老细胞在不同的生理和病理的作用上下文.此外, 它还可以与其他标记的免疫, 如细胞表面标记, 以确定衰老细胞的细胞特征;或 stemness 标记物来研究衰老在再生和肿瘤发生中的潜在参与。以前, 我们进行了 SA β-乳糖酶免疫组织化学染色的 Nanog 在同一节或近接近研究的潜在联系衰老和在体内重新编程⁸。虽然这个协议的重点是骨骼肌肉, 它可以肯定扩展到其他组织。

最近, 细胞衰老已经牵连到组织修复和再生, 很可能通过 SASPs^7,8,9。了解衰老对组织修复和再生的作用机制, 必将对再生医学产生巨大的影响。这一检测提供了一个重要的和有价值的工具, 以促进衰老细胞的鉴定和量化在体内。

作者声明他们没有竞争的金融利益。

我们感激 Clemire Cimper 的出色技术支持。在实验室工作的资金由巴斯德研究所, 中心全国研究科学, 和国家研究 (Laboratoire 卓越复兴, Investissement d 艾文莉;ANR-10-LABX-73), 研究 (ANR-16-CE13-0017-01) 和基金会弧 (PJA 20161205028)。cc 和 ac 是由复兴财团的博士和博士后奖学金资助的。