ショール分析法を用いたラット乳腺全身の分枝密度の定量

げっ歯類における乳腺発達は、典型的には、記述的評価または基本的物理的属性の測定によって評価されている。分枝密度は、客観的に定量することが困難な哺乳類の発達の指標である。このプロトコールは、乳腺分枝特性の定量的評価のための信頼できる方法を記載している。

げっ歯類の乳腺を化学暴露の発生毒性を評価するためのエンドポイントとして利用する研究が増えています。これらの曝露が乳腺発達に及ぼす影響は、典型的には、基本的な寸法測定または形態学的特徴の採点によって評価される。しかし、発達の変化を解釈するための幅広い方法は、研究所間で一貫性のない翻訳につながる可能性があります。研究を通して比較されるデータから適切な解釈が形成されるように、一般的な評価方法が必要です。本研究は、乳腺の分岐特性を定量化するSholl分析法の応用を記載している。 Sholl法はもともとニューロンの樹状パターンの定量化に使用するために開発されました。オープンソースの画像解析ソフトウェアパッケージであるImageJと、この解析用に開発されたプラグインを使用することにより、乳腺分枝密度とam周産期の雌ラットの臍帯腺を決定した。ここに記載されている方法は、Sholl分析を乳腺発達の重要な特徴を定量化するための有効なツールとして使用することを可能にする。

乳腺分枝は、一般に腺発生の指標として評価される特性であるが、客観的に定量化することは困難である。 1953年にSholl ¹は、猫の視覚および運動皮質におけるニューロンの樹状突起形成を測定する方法を記載し、この技術のためのプラグインはFerriera らによって開発された² 。ニューロンと乳腺の両方が類似の樹状構造を示すため、このプラグインを用いて、周辺期ラット乳腺の2D画像における乳房上皮分岐密度を定量化した。周産期は、離乳は生涯の段階であるため、分析のために選択されました。これは、多くの場合、学術機関や試験ガイドラインの研究で評価されています。 Sholl分析は、FIJIと共に配布されているプラ​​グインです。これはオープンソースの画像処理パッケージImageJで、追加のプラグインが含まれています。プラグインはpredefを囲む一連の同心リングを作成します（典型的には、ニューロンの体細胞または乳腺の主ダクトの起源）を対象とし、対象物の最遠位部分（包囲半径）まで伸びる。次に、各リング上に発生する交差点の数（N）を数えます。また、プラグインはSholl回帰係数（ k ）を返します。これは上皮分岐の減衰率の測定値です。

ImageJを使用して、乳腺全身の骨格化画像が作成され、乳房上皮領域（MEA）が測定される。 Sholl分析プラグインを使用して画像が分析され、ここでは利用されない他の値のうちNとkの値が返されます。乳腺上皮分枝密度は、N / MEAを計算することによって決定される。腺上皮の外側領域で分枝が継続する程度は分枝の複雑さであり、均一な遠位上皮成長の指標である。 kはエピソードにおける遠位減少の尺度であるのでこれは分枝の複雑さと乳房発達の信頼できる指標の有効な尺度である。

このプロトコルは、乳腺全身マウントの骨格化画像を作成し、周辺性雄性および雌性ラットにおける乳房分枝特性を定量的に評価するコンピュータ支援法を記載する。この方法は比較的迅速であり、特別な顕微鏡検査装置の使用を必要としない。この方法の開発および検証はStanko et al。 （2015） ³ 。この報告書はまた、ラット乳腺全体=マウントの調製を記載している。同様の哺乳類全体マウント手順が、アシス（Assis） らに記載されている。 （2010） ⁴およびPlante et al。 （2011） ⁵ 。

この試験のための全ての動物の使用および手順は、NIEHS研究所の動物用ケアおよび使用委員会によって承認され、実験動物管理認定施設の評価および認定協会で実施された。

1.乳腺を摘出する

1. キシレン耐性の方法を使用して、すべてのスライドにあらかじめラベルを付けてください（鉛筆が最適です）。ラベルを保存するには、最後にマウントソリューションを使用してカバーしてください。
2. 動物実験および使用委員会が承認した方法で動物を安楽死させる。
3. 安楽死させた後、動物を解剖板上に置きます （ 図1 ）。後肢が逆V字状になるように4本の四肢を伸ばしてピン止めする（ホールディングピンまたは小ゲージ針がうまく機能する）。
4. 乳腺のサンプルから毛を守るために、腹部を70％エタノールで十分にスプレーします。
5. 鉗子を使用して、正中線で腹部の皮膚を引き上げ、小さな切開を行う。ハサミを解剖し、腹膜を穿刺しないように注意してください。
   1. 切開部から始めて、皮膚を首の領域まで、そして遠位の前肢まで切断します。鼠径部まで切ってから、同じ側の後肢の最初の関節まで遠位に切る。この切開は、通常、乳腺5と6を分離する。腹膜を切るのを避ける。
   2. 鉗子を使用して、付属の乳房脂肪パッドで皮膚を引き戻し、ハサミを切開して平滑末端を用いて腹膜から穏やかに分離する。完全に皮膚の下に鼠径乳腺^第 4 ^番目と5を公開する限り背部できるだけ離して。皮膚を解剖板に固定する（ 図2 ）。
   3. 湾曲した鉗子の丸い側面で5 ^番目の腺の乳房組織を静かに把握し、腺または皮膚にニックを入れないように注意しながら、ゆっくりと腺を皮膚から離してください。
   4. トリムを続けると、4 ^番目と5 ^番目の腺が完全に皮膚から持ち上げられるまで背側に移動。 Sholl分析の開始点として役立つので、ニップル領域が残りのグランドと一緒に取り外されていることを確認してください。腺4に付着している体から乳房組織を切り離します。
6. 腺を動物から取り出したら、静電気を帯びた25mm×75mm×1mmの顕微鏡スライド上に均一に広げ、皮膚に隣接する側を下に向けます。
   注：老齢または泌乳中の動物の腺については、51 x 75 x 1 mmのスライドが必要になることがあります。
7. 手袋を着用しながら、気泡を静かに絞ってください。プラスチックパラフィンフィルムと別の顕微鏡スライドで腺を覆い、腺を圧縮してスライドに接着させます。
   注：水で満たされた50 mLコニカルチューブが適切な重量として機能します。スライドに付着するのに要する時間は、腺の厚さに依存する。薄い、ポストナタルデイ（PND）4腺は最低30分間圧縮する必要がありますが、より厚い成人の腺は2〜5時間かかることがあります。

2.乳腺全身の準備

1. 沸騰と冷蔵が必要なので、少なくとも24時間前にカルミンミョウバン溶液を調製する。
   1. カルミンミョウバン1gと硫酸アルミニウムカリウム（AlK（SO ₄ ） ₂・12H ₂ O）2.5gを蒸留水500mLに溶解し、1Lフラスコ中で20分間沸騰させる。蒸留水を用いて最終容量を500mLにする。
   2. 溶液を濾紙を通して真空下で濾過し、貯蔵のために冷蔵する。
      注：カルミンミョウバン溶液は再使用できますが、色が消え始めると破棄してください。
2. 固定する前に、スライドからグランドを引っ張らないように注意しながら、パラフィンフィルムをグランドから剥がしてください。スライドガラススライド染色ジャーにスライドを置き、固定液（100％エタンオレンジ、クロロホルム、および氷酢酸を6：3：1の比で）で12時間~48時間麻酔した。
3. 固定液を注ぎ、腺を70％エタノールに15分間浸します。エタノール溶液の1/3を注ぎ、それを蒸留水で置き換えることによって、徐々に水分を再水和する。 5分間浸す。このプロセスを3回繰り返します。
4. 最後のすすぎの後、すべてのエタノール/水溶液を注ぎ、それを100％蒸留水で置き換えます。腺を5分間浸す。
5. 蒸留水を注ぎ、腺をカルミンミョウバン溶液に浸します。厚さに応じて、腺を12〜24時間染色します。
   注：腺は過剰染色することはできませんが、複数のバッチの染色時間は同じでなければならず、その結果、染色強度は同じになります。
6. カルミンミョウバン溶液を注ぎ、腺を100％蒸留水で30秒間すすいでください。 70％エタノールに15分間、95％エタノールに15分間浸漬することにより腺を徐々に脱水し、100％エタノールで20分間処理した。
7. 脂肪の腺をクリアするには、厚さに応じてキシレンに12〜72時間浸す。
   注：腺は半透明（透明）でなければなりません。不透明な（白っぽい）部分が残っている場合は、キシレンで半透明まで浸漬してください。乳汁分泌腺または非常に厚い腺が染色され、除去される場合、腺を完全に浄化するためにキシレンを一度交換する必要があり得る。
8. スライドをキシレンベースのマウントメディアでマウントし、グランドをカバーするのに十分な培地をピペッティングします。カバースリップを加え、気泡が発生しないようにします。
9. スライドを乾燥させます。マウントメディアが乾燥すると、カバースリップの下で収縮し、マウントメディアを追加する必要があります。追加の培地が不要になったら、スライドを完全に乾燥させます。これは2〜3週間かかります。
10. スライドが完全に乾燥したら、綿棒と少量のキシレンで残りのマウントメディアを取り除くことができます。使用しないように注意してくださいこれがマウント媒体を溶解し、カバースリップを緩めることができるので、キシレンが多すぎる。これが起こって気泡がカバーガラスの下に集まる場合は、カバーグラスをキシレンで除去し、取り付けプロセスを繰り返す必要があります。

3.分析のために全体マウント画像を準備する

1. 巨視的顕微鏡または解剖顕微鏡と適切なソフトウェアを備えたデジタルカメラを使用して、全体マウント（ 図3 ）の画像をキャプチャします。
   注：腺上皮全体を撮影する任意の倍率を選択することができますが、同じ倍率でお互いに比較されるすべての全マウント画像をキャプチャすることが不可欠です。
2. ImageJソフトウェア（またはフィジーのソフトウェア）をダウンロードしてください^6。
3. 「File」→「Open」をクリックして、ImageJで乳房全身画像を開きます。フリーハンドツールを選択し、腺上皮をトレースします。 "編集"＆＃8594; "外のクリア。
   1. ノード周辺をトレースし、Freehandツールを使用してリンパ節を除去し、 "Edit"→ "Cut"
4. 「画像」→「色」→「分割チャンネル」を選択して色チャンネルを区切ります。最もコントラストの良いチャンネル、通常は青色のチャンネルを選択します。
   注：RGBイメージは、そのイメージの赤、緑、青のコンポーネントのスタックで構成されています。これにより、これらのコンポーネントが3つの8ビットグレースケール画像に分離されます。
5. 「プロセス」→「バックグラウンドを差し引く」を選択してバックグラウンドを引きます。必要なパラメータを選択し、[プレビュー]をクリックして変更をプレビューします。
   注：「バックグラウンドを引く」は滑らかで連続的な背景を削除します。さらに、「プロセス」→「フィルタ」→「アンシャープマスク」を使用してコントラストを作成することができます。
6. 1つを選択してください eノイズを自動的に除去する方法には以下のものがあります。
   注：ImageJは自動ノイズ除去の第3の方法を提供しています.NaNを削除します。ただし、remove NaNsコマンドは32ビットイメージを使用し、現在のメソッドは8ビットイメージを使用するため適用されません。
   1. "プロセス"→ "ノイズ"→ "スペックル除去"を選択して、スペックル解除コマンドを使用してノイズを除去します。
      注：これは、各ピクセルをその3×3近傍の中央値で置き換えるメジアンフィルタを追加するのと同じです。
   2. 「プロセス」→「ノイズ」→「異常値の除去」を選択して、アウトライヤー除去コマンドを使用してノイズを除去します。
      注：このプロセスは、中央値から特定の値（しきい値）を超えて逸脱する場合、ピクセルを直近の周囲のピクセルの中央値に置き換えます。
7. 残りのノイズを手動で除去する（lass = "xfig">図4）。
   1. 元の画像のコピーを開き、これを雑音ではないものの目安としてください。ツールバーの右端にある二重赤矢印ボタンをクリックします。描画ツールを選択します。 [ツール]ボタンがツールバーに表示されます。
   2. [消しゴム]ツールをクリックします。消しゴムのツールボタンを右クリックして、消しゴムの直径を調整します。ノイズを消去するには、マウスの左ボタンを押したままにします。
      注記：消去のセッションは1回だけ取り消すことができます。マウスの左ボタンを離してもう一度クリックすると、以前の消去を元に戻すことはできません。
8. 「画像」→「調整」→「しきい値」を選択して、しきい値を調整します。スライダーを動かして、グランド（グランド）の適切な描写が得られるまで、最小（上部スライダー）および最大（下部スライダー）のしきい値を調整します。
   注記：しきい値を設定すると、グレースケールイメージが対象のフィーチャとバックグラウンドフィーチャに分割されます。
   1. 「適用」をクリックします。必要に応じて、3.6.1および3.6.2の手順に従って、この時点で追加のノイズを除去します。
9. 閾値処理およびノイズ除去によって除去された腺上皮の部分を再構築する（ 図5 ）。
   1. 元の画像の完全性を維持するために、画像再構成を慎重かつ最小限に実行します。上皮ではないものとそうでないものについては、元の画像を参考にしてください。
   2. スプレーキャンツ​​ールをクリックします（ツールのツールバーで）。 Spray Canツールボタンを右クリックして、スプレーの直径と速度を調整します。マウスの左ボタンをクリックするか押さえて、腺の欠けている部分を慎重に記入してください。
10. ショール分析を行うための腺のスケルトン画像を作成します。 「処理」→「バイナリ」→「Bを作成」を選択して、閾値処理された画像がバイナリであることを確認します inary "
    1. 黒い背景の画像が白い場合は、「処理」→「バイナリ」→「オプション」を選択し、「黒い背景」のチェックを外します。 「プロセス」→「バイナリ」→「スケルトン化」を選択してイメージをスケルトン化します。
       注：これは、バイナリイメージが1ピクセル幅の形状に縮小されるまで、ピクセルを繰り返し削除します。
    2. 「処理」→「バイナリ」→「拡大」を選択して、画像を1回拡大します。
       注：これは、バイナリイメージのエッジにピクセルを追加することで、しきい値処理とス​​ケルトン化によって作成されたギャップを埋めます。
11. 「ファイル」→「名前を付けて保存」を選択して画像を保存します。イメージタイプ（通常jpeg）を選択し、ファイル名を入力して「OK」をクリックします。
12. スケルトン画像を元の画像にオーバーレイすることによって、スケルトン画像の精度を確認します（ass = "xfig">図6）。
    1. 元画像とスケルトン画像の両方を開いてオーバーレイを作成します。 「画像」→「オーバーレイ」→「画像を追加」を選択します。 [画像の追加]ダイアログボックスで、[追加する画像]ドロップダウンメニューからスケルトン画像を選択し、不透明度を30％に設定します。
    2. 「ファイル」→「名前を付けて保存」を選択して、重ねたスケルトン画像のイメージを元のイメージに保存します。イメージの種類を選択し、ファイル名を入力して「OK」をクリックします。

4.ショール分析を行う

1. スケルトン画像を開き、「プロセス」→「バイナリ」→「バイナリにする」を選択して画像をバイナリにします。
   1. 倍率を設定する前に、画像がキャプチャされた倍率のマイクロメータを使用してピクセル数/ mmを測定します。
   2. 測定された倍率を設定する"Analyze"→ "Set Scale"を選択してください。ピクセル数/ mmを入力します。 "Known Distance"と "Pixel Aspect Ratio"の両方を1に設定します。 "Unit of Length"に "mm"を入力し、 "Global"（各画像に同じ縮尺を維持）をチェックします。
2. 一次ダクトの開始点（分析の中心）から腺上皮の最も遠位の点まで線を描くことによってSholl分析の終了半径（包囲半径）を決定する（ 図7 ）。
   1. ツールバーの線描画ツールを使用して、対象点間に線を描画します。 "M"キーを押して測定を行い、結果ウィンドウが開くことに注意してください。
      注記：「長さ」列の値は、線の長さ（mm）です。 Shollパラメータを設定するとき、この値はEnding Radiusとして自動的に入力されます。 Shollプラグインは開始点を使用しますセントリックリングの中心としての線の長さ。
3. ショール分析の実行。
   1. "Plugins" "Advanced Sholl Analysis"を選択して分析を実行します。パラメータウィンドウが表示されます。
   2. 「I.シェルの定義」の開始半径を0.00 mmに設定します。手順4.2で測定された線の長さが自動的に「終了半径」として入力されます。
   3. 「半径のステップサイズ」を0.1 mmに設定します。
      注記：半径のステップサイズによって、リングの数が決定されます（実際には反復の回数）。より小さいステップサイズはリングの数を増加させ、大きいステップサイズはリングの数を減少させる。直径が小さすぎると、リングの数が不必要に多くなりますが、半径はあまり小さく設定できません。しかし、それはあまりにも大きく設定することができます。これにより、リングが少なくなり、実際に交差点の実際の数が過小評価されます。 Stanko et al。（2015）を参照してください。
   4. "II。Multiple Samples per Radius"で "＃Samples"を1に、 "Integration"を "Mean"に設定してください。
   5. 「囲み半径カットオフ」を1に設定し、「III。記述子と曲線近似」の「＃主分岐」の「開始半径から推論する」をチェックします。
      注：「プロファイルと計算記述子を適合させる」および「フィッティング詳細を表示する」は、必要に応じてチェックすることができます。
   6. 「線形」をチェックし、「正規化なしのプロファイル」で「最適フィッティング度」を選択します。 「最も有益な情報」をチェックしてください。 「IV. Sholl Methods」の「Normalized Profilesのエリア」を選択します。
   7. 「V.出力オプション」の「交差点マスクの作成」をチェックして、交差点のヒートマップを作成します（オプション）。
   8. 「Cf. Segmentation」をクリックして、リングの画像のプレビューウィンドウを生成して領域を確認します分析の
4. [OK]をクリックして分析を実行します。

5.MEAの測定

1. 上皮樹の周りの最短距離を追跡することによってMEAを測定する（ 図8 ）。
   1. グランドのスケルトン画像が開いているImageJで、ポリゴンツールをクリックします。上皮樹の周囲の点をクリックしてポリゴンを開始し、腺の周囲を移動してクリックして線分を追加します。
   2. 上皮領域全体が迂回されたら、ポリゴンをダブルクリックして閉じます。結果ウィンドウを開くには "M"キーを押します。 「エリア」欄の値はMEAです。
2. 腺上皮がリンパ節を越えて広がっている場合は、分岐密度を計算する際にMEAからリンパ節領域（LNA）を差し引く。
   1. 同じマンのリンパ節を追跡してLNAを測定する"M"を押すと、
      注：リンパ節はLNA内の交点を数えないようにリンパ節が判断するため、MEAからLNAを差し引かなければなりません。上皮がリンパ節に達していない場合、LNAはゼロである。

6.レポートデータ

1. 包囲半径、MEA、N、 k 、および分岐密度の値を報告します。
   注記：囲み半径はステップ4.2で決定され、MEAはステップ5.1で決定されます。
   1. 分析を実行してSholl resultsウィンドウを生成します。
      注：報告されたNは、sumの和の値です。報告されたkはSholl回帰係数（半対数）の値です。 Sholl分析は、腺上皮の測定された任意の領域に対してkの値を返す。完全な上皮上のkの正確な値を得るためには、管末端が存在していなければならない。
   2. 変更するe分岐の密度を計算するためにNの出力値を使用して乳腺のSholl解析を行う（この方法の基本的な評価項目）。式N /（MEA-LNA）を用いて分枝密度を計算し、その値をN / mm ²として報告する。

このプロトコールで分析した乳腺の測定された封入半径、MEA、N、 kおよび計算された分枝密度の値を表1に報告する。 Sholl解析では、各半径（ 図9 ）および交差点のヒートマップ（選択されている場合）の交点数の線形および半対数プロットが生成されます（ 図10 ）。あまり発達していない腺は、同じMEA内でより少ない交叉を示し、したがってより低い分岐密度を有する。十分に発達した腺は、特に遠位領域において、腺上皮全体に均一に分枝し続けるであろう。これらの領域で分岐が継続する程度は、分岐の複雑さと複雑さの減少が減衰率（またはSholl回帰係数、 k ）として伝達されるために説明できます。崩壊の速度は、遠位上皮ブラの変化を反映する狭窄し、包囲半径（ すなわち、上皮の縦方向成長）に対してプロットされた交差点の数の線の傾きとして測定される。したがって、Sholl回帰係数は、対数（N / S）対半径距離（r）のプロット線の傾きを取ることによって計算される。ここで、log（N / S）= - k r +半径Rと面積^S（πR2）の各リングのための交差点の数、mは切片です。勾配-kは交点の減衰を表すので、 -k = 0の値は、分析の中心から上皮の縁までのゼロ崩壊および一様な分岐を示す。まばらに発達した腺においては、枝分かれの崩壊が増加する。上皮樹の遠位領域には交差部が少ない。勾配kが増加する。したがって、0に近づくkの値は、より大きい遠位分岐（ すなわち、分岐の複雑さ）および井戸発達した乳腺。

図1：腹部ビュー。成熟した雌のSprague Dawleyラットの腹側部分の画像で、ラットを解剖面に固定する方法と、乳頭を丸くした12個の乳腺の位置を示しています。 *腺6と7の乳頭は見えません。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図2：雌ラット乳腺。露出した乳腺4（MG4）および5（MG5）の図であり、皮膚はMG4の上およびMG5の直下の解剖表面に固定されている。腺はskから取り除かれるべきです MG5で始まり、MG5と4が完全に取り除かれるまで上と背を続ける。乳頭は腺4の遠位領域にあり、この領域を収集するように注意しなければならない。リンパ節は参照のために示される。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図3：乳腺全体のマウント。生後25日の女性Sprague Dawleyラットから採取した乳腺の全身像。スケールバー= 1mm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図4：ノイズの除去バックグラウンドを差し引いた、哺乳類の全マウント画像の青色チャネル。 （ A ）はノイズのある例を示しています。矢印は血管によって生成されるノイズを示し、管末端を取り囲むより濃く網掛けされた領域は、バックグラウンドを差し引いて生成されるノイズの例である。 （ B ）はノイズが除去された後の画像を示す。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図5：画像再構成。閾値化された画像の消去された部分の再構成。 （ A ）赤い矢印は、閾値処理によって画像の一部が失われた領域を示す。画像再構成これらの地域で競売が行われるべきである。 （ B ）削除された領域を再構成した後の乳腺画像。画像再構成は、元の画像の完全性を維持するために、慎重かつ最小限に実施する必要があります。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6：スケルトン化されたイメージのオーバーレイ元の全マウントイメージに重ねられたスケルトン化されたイメージを示すオーバーレイイメージ。この画像は、骨格化された腺が、高い精度で実際の腺の分岐を反映していることを示している。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図7：半径を囲む囲む半径がどこで測定されているかを示す乳房全身マウントのスケルトン化された画像（黄色）。線は、上皮樹の基部（分析の中心）から始まり、上皮の最も遠位の点まで伸びるべきである。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図8：乳房上皮領域。 MEAを決定する上皮樹の周りにトレースされたポリゴンを示すスケルトン画像。 より大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてくださいこの数字のシオン

図9：Shollプロット出力。各半径方向増分における交点数の線形（ A ）および半対数（ B ）プロットのSholl出力。パネル（A）の赤い点は重心（幾何中心）の横軸です。赤い線は、10 ^番目 -90 ^{パーセンタイル}を超える線形回帰であるパネル（B）において、青い線は、データの全範囲にわたって線形回帰です。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図10：交差点マスク。 「Create Inter（セクション4.3.7）、セクションMask（断面マスク）オプションが選択された場合（ステップ4.3.7）、分析は画像の包囲半径にわたる交差数のヒートマップを出力しますこのヒートマップは上皮全体の分岐交差点の密度高密度;青色=低温=低密度）。上皮全体は、 k = 0の画像のヒートマップにおいて同じ色である。この図のより大きなバージョンを見るには、ここをクリックしてください。

表1：ショール分析パラメータ。値はSholl分析の報告データです。囲み半径（ステップ4.2）およびMEA（ステップ5.1）は測定値であり、NおよびkはSholl分析結果であり、Sholl分析結果ウィンドウ（ステップ6.1）に戻され、分岐密度は式N /（ MEA-LNA）（ステップ6.1.2）。

出産から思春期まで、乳腺の成長はアロマティックである。思春期後、乳腺は、乳腺上皮が脂肪パッド全体を占有するまで、広範な管分岐および伸長を経て発達する。分枝特性は乳腺発達の重要な側面であり、これらの特性を客観的に定量化する能力は、乳房の正常な発育を評価し、乳房毒性物質への早期曝露後の異常な発達を同定するために非常に有用であり得る。

形態学的特徴の採点、基本的な寸法測定の定量化、および乳房構造の計数は、乳腺発達を評価するための典型的な方法である。しかしながら、これらの方法は、げっ歯類の乳腺の大きさおよび形状のかなりの変動のために特に敏感ではなく、経験の浅い評価者にとっては発生の解釈が困難であり得る。さらに、適切に盲検されていない研究に偏見が存在する。 Sholl分析法は、乳腺上皮の分枝密度および分枝の複雑さ、乳腺発達の離散形態学的特徴を正確に定量化するための効率的なプロトコルを提供し、研究および実験室間で容易に比較することができる。

このプロトコルのいくつかのセクションには重要なステップがあります。最初の最も重要なのは、乳腺全身の状態に関係する。この方法の正確さは、完全にそのまま収集され、欠陥なくマウントされ、適切に固定され、染色され、腺の酸化またはマウント媒体の顕著な変色を示さない乳腺に依存する。腺が裂けたり折れたりすると、枝分かれ密度の正確な尺度が得られない。管末端が存在しない場合、 kの値は腺全体を代表するものではない。閾値は腺では難しいでしょう管上皮における染色コントラストの欠如のために完全には固定されていない。最後に、酸化や変色があると、これらの傷は、患部の交点を測定することによる分析を妨げる可能性があります。

適切なマウントを準備したら、次の重要なステップは同じ倍率で画像をキャプチャすることです。可能な限り高い解像度でデジタル画像をキャプチャするのが一般的な方法です。しかしSholl分析では、すべての画像を同じ倍率でキャプチャすることが重要です。 Stanko et al。 （2015） ³では、低倍率で撮影されたより小さな腺の画像は、視覚的には発達していないように見えても、より大きな倍率で撮影されたより大きな腺の画像よりも大きな枝分かれ密度を示した。我々は、より高い倍率がより詳細な結果をもたらし、t彼は画像をスケルトン化し、より小さな腺の枝分かれ密度を上回るNを高めた。この問題は、同じ倍率ですべての画像をキャプチャすることによって軽減されます。

正確な解析の基礎は全体マウント内にありますが、ユーザが影響を受ける交差点データの変化の可能性はノイズ除去のステップ内にあります。全ての画像は、染色強度、関連性のない生理学的実体（ 例えば、血管）、および閾値化のアーチファクトのために、ある程度ノイズを含む。各画像は、画像間のノイズの量の変動のために独立してアドレス指定されなければならない。交差点の数、ひいては分岐密度を歪める可能性があるので、余りにも少なすぎる、またはあまりにも多くの騒音を除去しないように注意しなければならない。しかし、ノイズが解釈に及ぼす程度は検討されていない。ユーザーはノイズ除去にどのように細心の注意を払う必要がありますか？イメージの完全性を維持することができます。ノイズ除去を行う際には、ユーザーが治療を盲目にして、バイアスの可能性を最小限に抑えることを強く推奨します。ノイズ除去については、ImageJユーザーズガイド⁷で詳しく説明しています。この手順では、主に背景減算画像からノイズが除去されます。さらに、閾値処理プロセス自体が腺の部分を除去する可能性がある。数画素しか除去されていない腺の部分は、骨格化された画像が拡張されると自動的に再構成される。しかし、大きなギャップは手作業で再構築する必要があります。ユーザは、これらのセグメントを再構成するかどうか、またどの程度まで元の画像の完全性を維持するかを決定しなければならない。

これは重要ではありませんが、ImageJソフトウェアが頻繁に更新されるため、ソフトウェアの更新を維持することが重要です。ここで説明するメソッドは、バージョン1.48vに基づいています。 FIJIとSholl analysisプラグインも定期的に更新され、ここで説明するプロトコルはv3.4.1に基づいています。 ImageJとSholl Analysisプラグインの新しいバージョンで行われた変更は、これらのメソッドに影響を与える可能性があります。 ImageJは自動的にアップデートをチェックしますが、FIJIのアップデートは定期的に行う必要があります。すべてのパラメータはSholl Analysisウェブページ^6の小見出しで定義されています。この手順の中のパラメータ設定は、私たちの研究室で作成された乳腺の全マウントから採取された画像に基づいており、絶対的なものではありません。全マウントの準備は実験室ごとに異なり、これらのパラメータは画像と出力を最適化するように調整することができます。

この研究で利用された乳腺全身マウントは、PND25の雌Sprague Dawleyラット由来であり、この方法は、制限なく、適切に適用された。ラットでは、乳腺上皮密度inc年齢と共に、腺の正確な骨格化画像を生成するのに十分高い分解能で画像を閾値処理することを妨げる点まで回復する。したがって、現在、PND40よりも古いラットの腺にこの方法を使用することは推奨していません。ラットの系統はここに示されているが、この方法の使用を妨げるような系統特異的な乳腺形質は現在のところ著者には知られていないため、無関係である。さらに、上記の方法は雌ラットを用いて行ったが、雄ラットの乳腺に適用することもできる。このアプリケーションは、マウスの全身マウント（Deirdre Tucker、個人的なコミュニケーション）でも効果的に使用されており、マウスの乳腺はラットの乳腺ほど肥大しないので、任意の年齢のマウスに適しているはずです。しかし、マウスでこのアプリケーションを使用するには2つの制限があります：1）若いマウスに有意な差異を検出するために分岐交差が少なすぎる可能性があり、2）この方法はcanno乳房上皮を示さないので、雄マウスに適用される。いずれにしても、この自動化された方法は、分岐交差点を手動で数える方法よりも高速で偏りがなく、労働集約的です。

研究者は、乳腺を他の実験技術、例えば異常構造の切除または免疫組織化学（IHC）のために利用することを望む可能性がある。 Tucker らは、 （2016）は、マウス乳腺全身マウントからヘマトキシリン - エオジン染色切片を調製する方法を記載している^.8一般に、全身マウントを末端プロセスとすることを検討しており、 IHCまたはTUNELアッセイのような、追加の高感度アッセイのための非搭載乳腺である。乳房腺組織を使用する敏感な検体が全マウントと一緒に必要とされる場合は、反対側の乳腺を使用することが推奨される。

乳腺はtを続けるO研究の増加に焦点こと、まだ実験室を横切っての違いは全体マウント調製^{9、10、11、12}及び発達評価^13、14、15の両方に存在します。ここに記載されているSholl分析の改変は、げっ歯類の乳腺における乳腺発達の重要な特徴である分岐密度の客観的定量のための標準化された方法を提供する。この方法は、雄性または雌性のげっ歯類の乳房全体マウントに適用することができ、ラット由来の出生前 - 胎児期の腺からのみの使用が現在推奨されているが、すべての年齢のマウスから乳腺に適用することができる。適用は、この期間が推奨されるように、周脈間齧歯類から採取した乳腺に特に適している試験ガイドライン研究における乳房全体のマウント準備のエンドポイント。成人ラットの高密度乳腺での使用のためのこの方法の最適化が現在検討されている。

著者は何も開示することはない。

著者らは、この方法とTiago Ferreira博士（McGill University、カナダ、ケベック州モントリオール）の継続的な成功のために、Michael Islingling博士（ノースカロライナ州ダーラム）を認めたいと思っています。 Shollアプリケーションのサポート。