成体マウスの脊髄組織からの初代混合グリア培養の調製

神経因性疼痛の発症は、脊髄グリア細胞の病理学的変化を伴います。成人脊髄組織に由来し、 インビトロでこれらの細胞を研究するために設計された信頼性のあるグリア培養システムが欠如しています。したがって、我々は、成体マウスの脊髄組織からの初代混合グリア培養を確立する方法をここに示します。

脊髄グリア応答が神経因性疼痛の発展に大きく寄与することが広く受け入れられてきました。細胞および分子レベルでのグリア活性に関する膨大な情報は、インビトロ細胞培養系を介して得られています。利用インビトロ系は、主に新生児の脳皮質組織に由来する初代グリアを含む、細胞株を不死化。しかしながら、これらのシステムは、 インビボで脊髄グリア細胞の特性を反映しないかもしれません。さらに優れたin vivoでの条件を反映した培養系を用いて、末梢神経損傷誘発性神経障害性疼痛の発達における脊髄グリア細胞の役割を調べるために、我々の研究室から、一次脊髄混合膠細胞培養を確立するための方法を開発しました成体マウス。簡単に言えば、脊髄を成体マウスから収集し、洞穴とミエリン除去しパパイン消化を介して処理されています性勾配の媒体。単一細胞懸濁液は、35.9℃で^O 2-メルカプトエタノール（2-ME）を補充した完全ダルベッコ改変イーグル培地（CDMEM）で培養しますこれらの培養条件は、混合グリア細胞の増殖のために特別に最適化しました。これらの条件下では、細胞は12間の実験のために使用される準備ができている - 14日間の培養の確立（D 0）の後に（細胞は、この時間中対数期に通常ある）、およびD 21までの培養条件で維持することができます。この培養系は、様々な物質および薬剤による刺激の際に脊髄グリア細胞の応答を研究するために使用することができます。神経因性疼痛に加えて、このシステムは、脊髄グリア細胞の病理学的変化を伴う他の疾患におけるグリア細胞の応答を研究するために使用することができます。

慢性疼痛は、最高$ 635 ¹⁰億の推定年間コストで、米国では、約100万人の成人に影響を与える深刻な健康問題です。証拠は、神経因性疼痛、慢性疼痛²の最も破壊的な種類の一つの開発における脊髄グリア細胞の有意な寄与を示しています。適切なインビトロ培養系は、さらに、細胞および分子レベルでのグリア細胞の役割を調査中で有意に役立つだろう。

現在、研究者によって利用されるインビトログリア培養系は、新生仔マウスまたはラットの脳の皮質組織に由来する主としてグリア細胞を含み、新生仔マウスまたはラット初代グリア細胞由来のグリア細胞株を不死化。新生児の細胞は、このように提供し、さらに（主にアストロサイトとミクログリア）グリア細胞に分化させることができる未分化細胞のかなりの数が含まれています実験的な使用方法³ bundant細胞。しかし、我々の以前の研究では、新生児の脳グリア細胞は、リポポリサッカライド（LPS）刺激により、成人の脊髄グリア細胞から大幅に異なって応答することが示されています。例えば、インターロイキン（IL）は-4新生児の脳のグリア⁴に比べて成体ラットの脊髄グリアにおけるLPS誘導性一酸化窒素（NO）産生に対する強化された阻害効果を示しました。さらに、遺伝子関連ペプチド（CGRP）カルシトニン神経ペプチドによる刺激時のケモカイン産生のプロファイルは、（5。参考文献に記載される方法）新生児マウスの脳グリア間でunarguably異なって、成体マウス脊髄グリア（ 図1）。確立された細胞株を使用して、保守が容易であり、短時間で多数の細胞を提供することができます。一般的に、細胞株を生成いずれかの^6,7または下記目（例えば、広く使用されているミクログリア細胞株BV2ように）ウイルス媒介性不死化システムを使用して不死化自発的な転換の電子識別（例えば、アストロサイト細胞株C8-D1Aとミクログリア細胞株C8-B4など^）8、9細胞株を個別にアストロサイトとミクログリアの分子特性を研究する上で優れています。しかし、細胞株から得られた結果は、常にプライマリ細胞またはin vivoの条件にさらなる検証が必要です。また、齧歯類脊髄グリア由来するグリア細胞株の報告がなされていないことに留意すべきです。

神経因性疼痛の発達における脊髄グリア細胞の役割を調査するために、成体マウスの脊髄に由来する培養系は成体ラット混合膠細胞培養物^4を生成するために使用される以前に報告された方法を適合させることにより開発された^、5マウス脊髄グリア細胞の培養物は、さらに、最近^10を精製し、この記事に詳細に記載されています。大人脊髄混合膠細胞培養C特定の研究の必要性に合うよう選択された株からのマウスで確立され、そして細胞は、培養の最大21 Dの開始後、培養物中に維持することができます。この方法は、ならびに - 関連筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）の感覚神経障害、および複数のような脊髄内の病理学的変化を伴う様々な神経学的疾患の研究において、神経因性疼痛の研究に使用することができます硬化症（MS）。

以下のプロトコルは、ニューイングランド大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。以下のプロトコルは、4成体マウスの脊髄から膠細胞培養を調製するためのものです。

無菌条件下で培養フードでソリューションの調製

1. 培地を準備しイーグル培地（CDMEM）DMEMを含有する完全ダルベッコ改変、10％ウシ胎児血清（FBS）、2mM L-グルタミン、100 IU / mLペニシリン（4.5グラム/ Lのグルコース）を100mg / mLのストレプトマイシン、250 ngの/ mLのアンホテリシンB、および50μMの2-メルカプトエタノール（2-ME; 1.1.1を参照してください）。混合し、他のすべてのコンポーネントを滅菌フィルタした後、FBSを追加します。 4 ^O℃で培養培地を保存します
   1. 50 mMの2-ME /リン酸緩衝生理食塩水（PBS）原液を準備します（ソリューションは^、4°Cので保存することができる滅菌28.6 1×PBSのミリリットル、およびフィルタに濃縮された2-ME（14.3 M）の100μLを追加数ヶ月）。 U培地の1,000 mLのためのSE 1 mLの2-MEの原液。
2. 密度勾配媒体の調製
   1. 1部の10倍、通常の滅菌PBSおよび9部の滅菌在庫密度勾配媒体（ 例えば、パーコール）から株式等張密度勾配培地溶液（ 例えば、100％パーコール）を準備します。
   2. 20％の密度勾配媒体（ 例えば、1×PBSの40mLの100％の密度勾配培地の10 mL）を作るために定期的な1×滅菌PBSで（1.2.1製）100％の密度勾配媒体を希釈し、4℃で保管し^℃。細胞培養物を調製する前に室温（RT）で20％の密度勾配媒体をもたらします。
3. パパイン解離システムからの溶液の調製
   注： パパイン解離システムは、材料表に特定することができます。 （社内で組み立てられたものを含む）、他の類似の解離キットを使用することもできます。すべてのcompone国税庁は無菌でなければなりません。
   1. オボムコイド阻害剤混合物（粉末）にアールの平衡塩溶液（EBSS）の32ミリリットルを追加します。
   2. 1パパインバイアル（粉末）にEBSSの5ミリリットルを追加します。 10分間またはパパインが溶解するまで37 ^{O Cの}水浴中でパパインバイアルを置きます。
   3. 1のDNaseバイアル（粉末）にEBSSの500μLを追加します。穏やかに混合します。
   4. パパインバイアルにDNase溶液（上記）の250μLを追加します。
   5. （マウス脊髄あたりパパイン/ DNアーゼ混合物の約800μL）に必要以上のパパイン/ DNアーゼ混合物の総量を計算し、組織消化（ステップ3.2）を50 mLのチューブに必要な混合物を移します。少なくとも2週間、4℃で、元のバイアル内の残り物を格納します。
   6. 必要になるまで氷上でキットからすべてのコンポーネントを置かないでください。
4. 脊髄コレクションチューブを準備します。1滅菌15 mLチューブを5 mLのハンクス平衡塩溶液（HBSSのと、パパイン解離システムから、脊髄を収集するための）および1×PBSで1無菌の15 mLチューブ（5 mLシリンジを埋めるために、ステップ2.4を参照のこと）; 0。また、HBSS 5mLで1滅菌ペトリ皿（35ミリメートルまたは60ミリメートル）を作製し、培養フードに保管してください。

2.脊髄コレクション

注：すべての機器は、無菌でなければなりません。 IACUCによって承認された指定された領域でコレクションを実行します。

1. 収穫マウスの脊髄のための以下のツールを入手：ストレートシャープ/ブラント18-cmの手術用はさみを、12-cmの標準メス（＃3固体）、炭素鋼滅菌メスの刃＃10、小動物decapitator、12-cmの標準曲線状鉗子、および滅菌20Gの針は5-mLシリンジに取り付けました。
2. CO ₂で動物を安楽死させると、70％エタノール（EtOH）中でマウスの頭部と背部を消毒。
3. decapitatorで動物を刎ねます。筋層を露出するために背中の下部の中央の縦切開を行います。作ります無菌ストレート手術用はさみ（19センチ）とヒップレベルで脊椎動物のカラムを通してクリーン離断（また、脊椎動物の列をカバーする筋肉層を切断します）。
4. ワイプ新鮮な使い捨てのシートの上に動物を置きます。慎重に吻側側に脊柱に（滅菌1×PBS（ステップ1.4）を充填した5 mLシリンジに取り付けられた）20 G針を挿入します。しっかりとダウン動物を持って、すぐに注射器を押してください。全体の脊髄は、子宮頸部の端から出てくる必要があります。 HBSSを含む15 mLのチューブに脊髄を収集します。
5. マウスの残りの手順を繰り返し2.4。各動物の間で、70％EtOHですべて使用される器具を消毒します。
   注：一般的に、単一の12ウェルプレートは、すべての4マウス脊髄（4.3を参照）のために確立することができます。

単一細胞懸濁液の調製

注：無菌のすべてを維持するために培養フードに手順3と4を実行します。

1. HBSS含有ペトリ皿（ステップ1.4）に、すべての脊髄を転送します。滅菌はさみやピンセットで多くの素晴らしい、小片に脊髄のそれぞれをカット。これはさらに、調製希釈れるように、滅菌鉗子または10mLのピペットを使用して調製パパイン/ DNアーゼ酵素混合物（ステップ1.3.5）を含む50mLのコニカルチューブに脊髄組織を転送する（酵素混合物にHBSSを追加しません酵素液と酵素のパフォーマンスが低下する場合があります）。
2. 混合するために穏やかにチューブをボルテックス。軌道は、150 rpmで振盪しながらインキュベーター/シェーカーで1時間^、37°Cのでチューブをインキュベートします。
3. ボルテックスチューブを再び激しくさらに解離を促進するために5mLのピペットを用いて組織を有する酵素液を粉砕します。
4. 室温で5分間、300×gで15 mLチューブと遠心分離機に細胞懸濁液を転送します。
5. 遠心分離中に、再構成されたアルブミン - オボムコイドINHの300μLで2.7 mLのEBSSを混ぜます滅菌チューブでibitor溶液（1.3.1）。 DNase溶液（ステップ1.3.3）の150μLを追加します。
6. 遠心分離後、上清を除去し、上記で調製した溶液（ステップ3.5）で細胞ペレットを再懸濁します。ウェル細胞ペレットを破る渦。
7. 細胞懸濁液に再構成されたアルブミン - オボムコイド阻害剤溶液（ステップ1.4.1）の3ミリリットルを追加します。室温で6分間、70×gで遠心分離した細胞。 （膜断片を含んでいる）、上清を取り除きます。

単一細胞懸濁液からのミエリンの4さらなる除去

1. ブレーキなしで RTで30分間、800×gで細胞をペレットを破壊するために優しく、細胞ペレットを含むチューブに渦を（ステップ1.2.2で調製した）20％の密度勾配媒体の8 mLを加え、遠心操作します。慎重に破片のトップ層（主にミエリン）、上清を除去したが、ペレットを保持します。
2. 密度勾配の残骸を削除するには、resuspendiによって細胞を洗浄希釈CDMEM（1部CDMEMと2部HBSS）の8 mLで細胞ペレットをngの。 4 ^O℃で10分間、400×gで細胞を遠心分離上清を除去し、同じように希釈したCDMEM（上記）で再度細胞を洗浄します。それらを播種するまで氷上で細胞を保管してください。
3. 上清を除去し、培養培地中の細胞ペレットを再懸濁（CDMEMは、付属の2-ME（ステップ1.1で調製しました））。 1 12ウェルプレートの場合は、3 mLの×4（使用したマウスの数）+ 2ミリリットル= 14 mLのメディアを使用しています。これは、全体のプレートに十分な細胞懸濁液（12ウェル）があることを確認し、ウェルあたりの平均細胞数と培養のミクログリアの内容を決定することができる余分のウェルのために提供されます。培養容器の他のタイプが使用される場合、比例的に必要とされる培地の総体積を計算します。
4. 12ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液1mlを加えます。
5. 5％CO ₂で^35.9°Cので細胞をインキュベートします。
はD 1上のメディアを（吸引経由古いメディアを削除）を変更し、その後、3。
注：1日目に、培養物を伴う脊髄組織から残留ミエリンへの破片のかなりの量を含んでいてもよいです。このように、1日目にメディアを変更するには、（より多くの情報のための議論を参照してください）をお勧めします。培養物を12 Dとの間で治療のための準備ができている - 14細胞は、通常、D 12で80％コンフルエントであり、典型的には、D 14で100％コンフルエントに近いことができ、D 12で、12ウェルプレート中のウェルあたり約100,000細胞が存在します。

図2：混合グリア文化の確立後の異なる時点での混合グリア細胞の代表的な画像初代脊髄混合グリアは、大人のC57BL / 6マウスから調製しました。代表的な画像めっき後グリア文化の進行状況が表示されます。 1日目に、いくつかの細胞を培養プレートに取り付けられ、彼らはまだほとんどがラウンドされています。多くの浮遊細胞および重要な破片もあります。 4日目に、細胞の大部分は培養プレートに取り付けられています。細胞は、可視プロセスと枝分かれ表示されます。細胞は、散発的に分布しているとの文化は、この時点で約20〜30％コンフルエントです。 8日目に、培養物を50〜60％コンフルエントの間です。文化の一部の地域では、細胞の大規模なパッチを持っています。文化の他の領域は、細胞の疎な成長を持っています。パッチ内のいくつかの細胞は、「正方形状」の外観を取ります。 12日目に、培養物を、80％コンフルエント（ここに示されている画像では約90％コンフルエント）で、または上回っています。セルは、この時点で対数増殖期にあり、12から14日の間は、実験のためにグリア細胞を使用するための最適な時間です。 ご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の拡大版。

7. 抗マウスCD45及び抗マウスのCD11bモノクローナル抗体の組み合わせを使用して、標準的な蛍光活性化セルソーティング（FACS）染色プロトコル^11を介して余分なウェルから細胞を（4.3ステップ）を使用して、ミクログリアの内容を調べます。 CD45 ⁺のCD11b ⁺細胞はミクログリアとして同定されます。

この方法は、マウスおよびラットの両方からの混合グリア細胞を調製するために使用することができます。細胞は、マウス脊髄由来しているときに文化のD 12ポスト開始するときに、12ウェルプレート中のウェルあたりの平均総細胞数はウェルあたり約10万セルで、比較的安定であるべきです。この方法から得られたグリア細胞は、目的の物質および薬剤の投与の際に、成人脊髄グリア細胞応答を調べるために設計されている実験に使用することができる。 図3は、成人の脊髄ミクログリア典型的な一実験からのサイトカインおよびケモカイン応答の例を提供します成体BALB / cマウスから得て、培養物のD 13後開始のLPS（ サルモネラ・ミネソタ Re595）で処理しました。上清を、商業的にご利用できを用いた酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を介してサイトカインおよびケモカインのレベルの決意24時間後にLPS処置を収集しましたルキット。

この大人のグリア培養システムが最初に確立されたとき、細胞は^37℃。で、標準的な培養環境中でインキュベートしました。 10％ - この状態では、平均ミクログリアの含有量が5の範囲でした。 （ - ^{20〜15％）10}しかしながら、一貫性のある培養技術の使用にもかかわらず、培養物はいくつかの例のいずれにおいても非常に低いミクログリア含有量（<2％）または比較的高いミクログリア含量を有することが観察されました。実験結果は混合培養物内のミクログリアの応答に依存しているときに非常に少数のミクログリアを持つ文化を得るためにイライラすることができます。博士アレハンドロMSメイヤー（薬理学学科、整骨医学のシカゴ大学^）12の提案に続いて、この方法は^{、35.9℃。}で混合グリア細胞を成長させることによって変更されました40％と大部分はAR残り - これは、より一貫性の高いミクログリアの収率（10の間の範囲をもたらしました文化大部分の内ound 20％）。この改善は、図4に示されている既報の通り、ミクログリアが5補うために推定されている- 。成体マウス^13-15でCNSグリア人口の21％を。両方の培養条件は、インビボで推定されるようにミクログリアの同様の量を含む培養物を提供するが、修正された培養条件（35.9 ^O C）は、星状細胞および小膠細胞の両方からの応答を調べることが重要である実験のために、より適切です。

図1： カルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）の混合グリア細胞によるケモカイン産生を誘発新生児のBALB / cマウスの脳（左）または成体BALB / cマウスの脊髄（右）から調製した混合グリア細胞は、様々な用量で処理しました。 CGRPの。培養上清中のいくつかのケモカインのレベル最適なタイミングで（メーカーによって実行される）多重アッセイによって決定した（平均±SEM、nは2から6）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3：時グリアミックスマウス成体脊髄のサイトカインおよびケモカイン応答LPS刺激成人脊髄混合グリア細胞は、BALB / cマウスから調製し、LPSの種々の用量で刺激しました。 IL-6（A）、腫瘍壊死因子（TNF） -アルファ（B）、インターフェロンγ誘導タンパク質10（IP-10、また、CXCL10としても知られている）、（C）、及び単球走化性タンパク質1のレベル（MCP-培養上清中にもCCL2としても知られている1）（D）は、24時間後のLPS処理でのELISAにより測定しました。ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54801/54801fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4： 大人混合グリア培養におけるミクログリアのコンテンツミックスグリア細胞は、成人のC57B6 / Lマウスから生成され^{、37°Cの 35.9℃。}のいずれかで培養しました。各培養物からのミクログリアのコンテンツは、APC抗マウスCD45（クローン30-F11）およびFITC抗マウスのCD11b（クローンM1 / 70）を用いてフローサイトメトリーによって分析しました。フローサイトメトリー分析からの代表的なプロットが示されています。培養物からの総細胞集団のプロット（37 ^O℃）およびC（35.9 ^入出力 C）、およびミクログリアの集団で同定された（CD45 +のCD11b +細胞）、さらにBの各全細胞集団から単離した（37C）およびD（35.9 ^{入出力 C）O。}フローサイトメトリー分析を行った、と以前に^5を説明したように、すべてのデータを分析した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

全ての工程、を含む、実験間の再現性のある結果を得るためにスケジュールで一貫した方法を変更するメディアを行うことが重要です。次の手順では、優れた品質の大人混合グリアを得る上で特に重要です。

酵素消化は、このプロトコルの重要な側面です。組織片は、単一細胞懸濁液を得るために十分に消化されることが重要です。しかし、過剰消化が有意に少ない細胞になります。各LABは、インキュベーションのために使用バイアルの種類に基づいて正確な消化時間を決定するためにパイロット試験を行う必要があり、平均組織量は毎回使用し、シェーカーのタイプ（オービタルシェーカーに対して回転します）。また、関係なく、選択されたパパイン解離システムの、部品の時折の置換が収量の大幅な変動につながる可能性として、一貫して同じソースから同じコンポーネントを使用することが不可欠です細胞の総数の。

このプロトコルでは、ミエリンは、密度勾配培地を用いて除去されます。これらのソリューションの密度は温度に敏感であるため、室温での密度勾配溶液を作製し、使用することが重要です。密度勾配溶液は、通常、4 ^O℃で保存されています必要に応じて、密度勾配溶液を一晩培養物を設定する日前RTに保つことができます。また、20％の密度勾配中の細胞の30分間の遠心分離後、細胞がずれる破片の大部分を予防するために遠心分離機から直ちに除去されるべきである（ すなわち、離れた溶液の上から移動する;ステップ4.1参照）。

文化のD 1開始後に破片を除去することが重要です。細胞が生存し、増殖する培養培地は、毎3〜4 dは変更された場合には、D 1のメディアを変更すると、後でより「静止」と「クリーナー」文化を提供します。が、この細胞はあまり動揺環境で増殖することができ、そして細胞は、培養の21 Dポスト開始まで維持することができます。

各実験のミクログリアの含有量は、混合グリアを使用する前に検査することができます。最も一貫性のある技術では、ミクログリアのコンテンツはまだ実験間で大きく異なる可能性があります。一部の細胞効果は、ミクログリアコンテンツ^4、10に依存しています。従って、確立された培養物の各セットのミクログリアコンテンツを監視するために重要です。この実践から得られたデータは、実験間の変動を解釈するのを助けることができるだけでなく、特定の実験条件の下でミクログリア対アストロサイトの寄与に関する小説（時には予期しない）の知識を提供します。また、ミクログリアコンテンツの季節変動が観察されています。これは、実験の大規模なセットを計画する際に考慮すべき追加的な因子である可能性があります。さらに、ニューロンは通常、私たちの培養条件の下で生存しないであろうが、NeuN（neuronal-マーカー）陽性細胞は、免疫組織化学染色した後、私たちのグリア培養で観察されなかったとして、文化は（これは日常的に定量化されていない）オリゴデンドロサイトの限られた数を含んでいてもよいです。一つは、この集団は、特定の実験条件に応じて検討する必要があるかどうかを決定する必要があります。

多くの実験方法と同様に、この方法は、個々の研究者のニーズに応じて変更することができます。完全に日常的にそれらを使用する前に特定の変更をテストするために、パイロット実験を行うことが不可欠です。さらに、以前に新生児混合グリア細胞³に記載のように混合グリアは、特定の刺激後のアストロサイト優性ミクログリア優勢細胞対の応答を研究するためにミクログリア枯渇及びミクログリア富化培養物を得るために使用することができることに留意すべきです^4。しかし、ミクログリアに富んだ細胞の収量は、脊椎の多数のない限り制限されますコードは、最初に培養を確立するために使用されます。これは、マウスを使用している場合は特に、この方法の制限です。ラットの脊髄が使用される場合、（代わりに4マウスの脊髄の）1個々の脊髄を1 12ウェルプレートを設定するために使用することができます。最後に、ミクログリアの含有量が^5、4マウスおよびラット成体脊髄グリアの文化の間で有意差があるようには見えないの両方のマウスとラットの大人の脊髄グリア培養はサイトカイン産生の点でLPS刺激に対して強い応答を生成します。代替的な刺激が使用される場合しかし、差動応答が観察され得ます。

要するに、このげっ歯類成体グリア細胞培養系は、in vitroでグリア細胞を研究するための代替方法を提供します。この培養系から得られた結果は、より密接に新生児の培養物または細胞株から得られた結果と比較して、インビボ条件下で観察されるものを反映しています。現在の方法では、グリア細胞は、cです新生児グリア^4（ 図1）と比較した場合、成人のグリア応答が非常に異なる刺激にとして、大人のげっ歯類からollected。細胞は、細胞株を生成し、維持するために使用される不死化手順を通じて有意に操作されていません。この方法は、最初に、神経因性疼痛の研究において使用されるように開発されたが、ALSおよびMSなどの脊髄内の病理学的変化を伴う他の神経疾患を研究するために使用することができます。

The authors have nothing to disclose.

Adult spinal cord mixed cultures were first developed using rats with grant support from an NIH/NIDA R01 award (PI De Leo) and an NIH T32 training grant (PI Green). These methods were further adapted for mouse spinal cords with support from the following grants: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao), and NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). The authors would also like to thank Dr. Alejandro M. S. Mayer, Department of Pharmacology, Chicago College of Osteopathic Medicine, for his technical help in obtaining microglia-rich mixed glial cells.