多重化された免疫組織化学染色およびマルチスペクトルイメージングを用いたタンパク質発現と共局在の定量

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

免疫組織化学（IHC）は、組織内のタンパク質の検出のための標準的な実験室の技術であり、IHCは、まだ広く研究および診断病理学の両方で使用されています。 IHC染色の評価は、結果の解釈に潜在的なバイアスを導入、多くの場合、半定量的です。多くの半定量的アプローチは、最終的な診断^1-4に染色強度および染色程度の両方を組み込んだ開発されています。他のシステムは、より良い表現^5をローカライズするために、スコアリング強度と細胞内局在を含みます。複数の視聴者からの平均スコアの組み込みは、多くの場合、単一のビューアバイアス⁶の影響を最小限にするために利用されます。 ^7染色の程度を評価する際に、これらの努力にもかかわらず、分析中の主観性はまだ特に、残っています。プロトコルの標準化と人間の入力から主観性を最小限に抑えるには、正確で再現性のIHCの結果を作成するための最も重要です。

自動計算病理プラットフォームは病理染色^12-15のより客観的な定量化のための有望な方向です。組織マイクロアレイを用いてマルチスペクトルイメージングを組み合わせます大きなサンプルサイズのタンパク質発現のハイスループット分析を容易にします。カテゴリ形式¹⁶ではなく、連続してデータを戻しながら、実質的に、固有のバイアスおよび分析のために必要な時間の両方を低減しながら、これらの技術を用いて、タンパク質の共局在化、染色不均一性、ならびに組織および細胞内局在の解析が可能です。したがって、この研究の目的は、マルチスペクトル画像化ソフトウェアを使用して、分析を多重免疫組織化学を実施するための有用性と方法論を実証することでした。

このプロトコルは、4つの最適化されたモノクローナル抗体を用いた単一の組織切片スライドのマニュアル、多重免疫組織化学染色のために書かれています。代表的な実験として、核抗ウサギエストロゲン受容体α（ERα）​​およびアンドロゲン受容体（AR）は、膜に結合した抗マウスCD147および膜に結合した抗マウスE-カドヘリンと多重化されています。選択した任意の抗体がsubstitutすることができます本明細書に記載された抗体について編が、抗体の各組合せは、別々の最適化を必要とします。すべての抗体のための前処理は同じでなければなりません。 ARとCD147抗体は、カクテルとして個別に、その後、最適化されなければなりません。各抗体は、ビオチンを含まないポリマー系と4ユニークな色原体のいずれかを使用して検出されます。

注：プロトコルは、本明細書に組織マイクロアレイ（TMA）の染色および分析について説明し、以前^12,17,18説明。 4μmの厚さのTMA部分は、標準的なミクロトームを使用して、パラフィンブロックから得ました。

注：4色原体と対比のためのスペクトルライブラリは、画像定量化のために作成する必要があります。これを行うために、各個々の抗体のための最適化されたプロトコルは、1スライドあたりの抗体、マイナス最終的な対比で実行する必要があります。第五のスライドは、スペクトルライブラリを作成するために必要な5画像を生成するためにヘマトキシリン​​で染色されるべきです。

1.マルチプレックス免疫組織化学

1. 20分間60℃のオーブンで焼くスライド。化学ヒュームフードを使用して、100％キシレンでスライドを浸します。キシレンの2の変更を繰り返します。 5分間100％エタノールでスライドを浸します。新鮮な100％エタノールで繰り返します。
2. 3分間95％エタノールでスライドを浸します。新鮮で繰り返し95％エタノール。 3分間70％エタノールでスライドを浸します。 3分間蒸留水でスライドを浸します。新鮮な蒸留水で繰り返します。スライドから水を排出するために垂直方向にスライドをタップします。 5分間、すぐに使用できる内因性ペルオキシダーゼブロッカーの200μLを適用します。
3. スライドからペルオキシダーゼブロッカーを排出し、45ミリリットルですぐに使用できる検索緩衝液（pH 7.0未満）を浸します。圧力鍋に入れスライドコンテナおよび起動プログラムは、4分間124℃に設定してください。圧力鍋を20分間冷却してください。開口部の前に。
4. 検索バッファのコンテナを削除し、さらに10分を冷却することができます。 10分間蒸留水でスライドを洗浄します。スライドから水を排出し、慎重に疎水性バリアペンでスライド上の組織の輪郭を描きます。
5. 湿ったガーゼを含む蓋（インキュベーションチャンバー）を有する平坦なコンセントにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）.Transferスライドの200μLを加えます。
6. 50メートルを希釈することによって、トゥイーン20（TBST）で1×Tris緩衝生理食塩水1リットルを準備20Xトリスのlは1％のTween-20と950ミリリットルの蒸留水を含む緩衝生理食塩水。
7. スライドからPBSを排出し、1×TBST200μlのを適用します。 2分間インキュベート。スライドからTBSTを排出し、インキュベーションチャンバーにスライドを返します。すぐに使用できるユニバーサルタンパク質ブロック、閉鎖室の200μLを適用し、7分間インキュベートします。
8. タンパク質ブロックを排出し、インキュベーションチャンバーにスライドを返します。抗体希釈液の239.4μlに抗体の0.6μLを添加することにより、400：抗ERα抗体1を希釈します。スライドさせる希釈した抗体と閉鎖室の200μLを適用します。
9. 2時間室温でスライドをインキュベートします。スライドから抗体を排出し、TBSTで5分間浸漬し、続いてTBSTですすいでください。
10. スライドからTBSTを排出し、インキュベーションチャンバーにスライドを返します。すぐに使用できるヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼポリマー及び閉鎖室の200μLを適用します。 30分間インキュベートします。室温で。 5分間TBSTのコンテナ内のTBSTと場所のスライドで洗い流してスライド。
11. 250μlのDAB基質緩衝液にDAB色素原の8μLを加え、よく混合することにより、色素原茶色の西洋ワサビペルオキシダーゼ3,3'-ジアミノベンジジン（HRP-DAB）を準備します。
12. スライドからTBSTを排出し、インキュベーションチャンバーにスライドを返し、6分間茶色のHRP-DAB色原体を200μlを適用します。徹底的に蒸留水の容器に蒸留水と場所のスライドとスライドをすすぎます。
13. 第2の緩衝試薬150μlで最初の溶出​​試薬50μlのを組み合わせることにより、変性溶液を混ぜます。スライドから水を排出し、3分間スライドに希釈した変性溶液を適用します。室温で。デカントし、TBSTで試薬を変性すすぎます。 5分間TBSTでスライドを浸します。
14. 抗体希釈液の203μlの抗AR抗体の4.2μlのと抗CD147抗体の2.8μLを希釈することにより、AR / CD147抗体カクテルを準備します。スライドからTBSTを排出し、インキュベーションチャンバーへの戻りスライドとAR / CD147 Cの200μLを適用スライドにocktail。閉鎖室と室温で1時間インキュベートします。 TBSTでスライドを洗浄し、5分間TBSTに浸します。
15. TBST、インキュベーションチャンバーへの戻りスライドを排出し、すぐに使用ヤギ抗ウサギアルカリホスファターゼポリマーの200μLを適用します。閉じる室と30分間インキュベートするスライド。室温で。 TBSTでスライドを洗浄し、5分間TBSTに浸します。
16. 250μlの赤い色素原バッファに赤い色素原の3.2μLを添加することにより、色素原赤アルカリホスファターゼを準備し、よく混ぜます。
17. スライドからTBSTを排出し、インキュベーションチャンバーにスライドを返します。スライド、閉鎖室に希釈赤アルカリホスファターゼ色素原200μlのを適用し、7分間インキュベートします。
18. 色原体を排出し、蒸留水で完全にスライドをすすぎます。 5分間蒸留水の容器にスライドを置きます。 、スライドから水を排出し、TBSTで洗浄し、インキュベーションチャンバーに戻ります。スライドとCLOSに200μlのヤギ抗マウスHRPポリマーを適用しますE室。 30分間インキュベートします。室温で。
19. スライドからポリマーを排出し、TBSTで洗い流してください。 5分間TBSTに入れスライド。バッファの250μlに安定化試薬の3.2μLを添加することにより、紫色のHRP-リンク色素原200μlのを準備し、よく混ぜます。紫色の色素原の3.2μlを添加して、よく混ぜ、過酸化水素試薬の後、3.2μlを、よく混ぜます。
20. TBSTを切るスライドとスライドさせ、7分間インキュベートする準備紫色の色素原200μlのを適用します。室温で。 5分間蒸留水の容器内の蒸留水と場所のスライドとスライドを洗浄します。
21. 第2の緩衝試薬150μlで最初の溶出​​試薬の50μLを混合することにより、変性溶液を混ぜます。スライドから水を排出し、3分間スライドに希釈した変性溶液を適用します。室温で。
22. TBSTで試薬をオフ変性すすぎます。 5分間TBSTのコンテナ内のスライドを置きます。抗E-カドヘリン抗体を希釈1：200 218.9μlの抗体希釈液に1.1μlの抗体を添加することもできます。スライドからTBSTを排出し、インキュベーションチャンバーにスライドを返し、スライドにE-カドヘリンの200μLを適用します。閉鎖室と30分間インキュベートします。室温で。
23. 5分間TBSTのコンテナ内のTBSTと場所のスライドで洗い流してスライド。インキュベーションチャンバーにスライドを戻す、スライドからTBSTを排出し、200μlのヤギ抗マウスHRPポリマーを適用します。室温で30分間インキュベートします。 5分間TBSTのコンテナ内のTBSTと場所のスライドで洗い流してスライド。
24. 250μlのバッファーに色素原の8μLを添加することにより、黒HRP-リンク色原体を準備します。 2分間スライドし、開発する200μlの色原体を適用します。蒸留水で十分にスライドをすすぎ、蒸留水の容器に浸します。
25. 蒸留水200μlに40μlのヘマトキシリン​​を追加することにより、ヘマトキシリン​​を希釈します。スライドから水を排出し、30秒間スライドするように希釈されたヘマトキシリン​​の200μLを適用します。リンススライド完全に2分間水道水、30秒間蒸留水ですすぎます。 15-30分間60℃のオーブンに入れスライド。
26. 、30秒間、新たに調製した100％キシレンでスライドを浸し過剰キシレンを拭き取り、永久封入メディアの一滴を追加します。第1.5カバーガラスでカバースリップ。

2.自動画像取得と解析

1. 自動スライドスキャナーに染色スライドをロードします。直径、分離、およびTMAコアの数に基づいて、製造業者の取扱説明書に従って自動スキャンプロトコルを作成します。
2. 個々の色素原、ヘマトキシリン​​染色スライドで染色した対照スライドからスペクトルライブラリを構築するためのマルチスペクトルイメージングソフトウェアを開きます。制御スライドから取得した画像キューブを開き、光学的にその色素原を定義する4 5に陽性に染色された領域を選択します。完全なスペクトルライブラリrepresentiまで他の制御スライドから画像キューブで繰り返しすべての色素原ngをすることは作成され、スペクトルライブラリを保存されています。
3. マルチスペクトルイメージングソフトウェア内の新しいプロジェクトを開始します。画像フォーマットオプションとサンプルフォーマットのための "明"のための "マルチスペクトル（.im3）」を選択します。 「スコア」、「表現型」、「フィーチャーの検索」、「セグメント組織」と「エクスポート」：まず、必要なオプションを選択して、プロジェクトを構成します。この時点で、画像の解像度は、所望であれば、分析時間を促進するために変更することができます。

3.組織セグメンテーション

1. 以前に作成したスペクトルライブラリをインポートして、分析に含まれるすべての色原体を選択します。
2. 「画像を開くキューブ」オプションを選択することによって、トレーニングデータセットに含まれるオープン画像キューブ。学習精度を確保するために、分析される画像の総数の少なくとも18％を選択します。セグメンテーション精度を高めるために、すべての疾患状態を表す画像を選択します。画像のこの部分は私sが画像のトレーニングセットと呼ばれます。
3. スポイトツールを選択し、白である一つの画像内の領域を選択することで、トレーニングセットにおけるホワイトバランス画像。
4. 組織のセグメンテーションに移動し、「アドバンス」ボタンを選択します。 （ すなわち 「組織」と「非組織」）分析すべき組織の種類を選択するために「組織カテゴリ」パネルを使用します。より正確なタンパク質組織局在化のために、複数の組織の種類（ すなわち 、「上皮」、「間質」と「非組織」）を使用することができます。
5. アルゴリズムを作成し、訓練画像内の細胞のグループの周りに描画することにより、組織カテゴリの定義を開始。 1つの組織のカテゴリが終了したら、他の組織のカテゴリについて繰り返します。その組織のカテゴリ型の特徴である画像内の細胞のグループを選択してください。
6. 画像のトレーニングセット内の全ての画像について、このプロセスを繰り返します。
7. コンポーネントを選択（クロモゲン）はTRAIに含まれます「組織セグメンタ」のためのNing。明視野免疫組織画像の解析を行う場合、すべてのコンポーネントが正常にトレーニング中に含まれています。このステップの間にバイアスを回避するために、トレーニングセットで豊富なネガティブ染色画像を含みます。
8. 組織のセグメント化を訓練するための適切な「パターン・スケール」を選択します。 20X倍率で、大きなパターンの規模は、一般的に適切です。高い倍率で細かいアーキテクチャを持つ組織で作業している場合は、より小さなパターンのスケールがより適切です。
9. 組織のセグメント化の訓練を開始するために「電車組織セグメンタ」ボタンを選択します。適切に分類されているトレーニング領域内の画素の割合を反映した精度を表示するポップアップボックスを確認します。
   注：ソフトウェアが継続的に手動で停止するまで、アルゴリズムの精度を改善しようとします。我々は以前に97％の訓練精度¹²で画像の結果の18％でそのトレーニングを実証しました。
10. 組織のセグメント化が訓練された後、適切なセグメント解像度を選択します。セグメントの分解能は、より少ない時間とより多くの時間を必要とする高分解能を必要と粗い分解能で、セグメントの画像に必要な時間に相当します。
11. セグメント「セグメントイメージ」をクリックして、画像の全体のトレーニングセット。すべてのトレーニング画像にアルゴリズムを適用するためのソフトウェアの十分な時間を許可します。終了したら、現在の学習アルゴリズムを持つ任意の誤分類の組織を見つけるために、トレーニングセットを確認します。
12. 、組織のセグメンテーションプロセスを微調整する追加、編集、または組織のトレーニング領域を削除します。ピクセルが別のものに1つの組織のカテゴリの端に拡張する場合、「トリムエッジ」オプションを使用します。ピクセルの小グループが誤って分類されている場合、最小セグメントサイズにしきい値を調整します。
13. 編集は、選択「セグメント画像」終了すると、これは、組織のセグメンテーションのための新しいアルゴリズムを作成するために、組織のセグメント化を再訓練します。以前のアルゴリズム自動的に保存され、必要な場合に戻すことができます。
14. ときに組織分割アルゴリズムの結果に自信を持って、「アドバンス」ボタンを選択することによって、細胞のセグメンテーションに進みます。

4.セルセグメンテーション

1. 選択した細胞内区画は、細胞分割に含まれます。 「核」はすでに「細胞質」または「膜」を選択するように選択されていることを確認。
   注：膜特異的タンパク質マーカーがIHCに含まれていたとき、「膜」のセグメンテーションは、このようなE-カドヘリンのように、選択すべきです。
2. 「核」タブ内には、いくつかのオプションがあります。核セグメンテーションのための適切な設定を選択することによって開始する（ステップ4.3参照）。個々のまたは全ての組織のカテゴリはセグメンテーションに含まれるかどうかを選択します。
3. 核分割のためのアプローチを選択
   1. 良い得るための簡略化された方法のためのアプローチ対比「ピクセルベース（しきい値）」を選択画像処理の設定について多くを知らなくても結果。
      注：これは、多くの場合、良い第一選択肢となります。アプローチ、「ピクセルベース（しきい値）」を選択した場合は信頼性の高い核対比染色がある場合に、一貫した核対比の不足がある場合は、「ベースのオブジェクト」を使用する必要がありながら、より適切です。
   2. 信頼性の高い核対比がある場合、「ピクセルベース（しきい値）」アプローチを選択します。
      注：このアプローチは、純粋にピクセルベースです。このアプローチはまた、IHC染色について陽性染色組織のカテゴリ内の全ての画素を検出するなどの単純な閾値に満足することができる他の画像解析のニーズのために使用することができます。
   3. 核の対比が核オブジェクトの一貫性と特異的染色を提供していない場合はオブジェクトベースのアプローチを選択して、より高度な形態計測に基づくアプローチは、核を検出するために必要とされています。
   4. 「原子力セグメンテーションのためのコンポーネント」、「NUCLを選択耳のサイズ」、および「クリーンアップ」は、ユーザがさらに核セグメンテーションの設定を定義したい場合。
4. 細胞質形状パラメータを選択します
   1. 細胞質セグメンテーションに移動するには、「アドバンス」ボタンを選択します。
      注：から選択する細胞質セグメンテーション内のいくつかのオプションがあります。 「核への内部の距離」と呼ばれるオプションは、ピクセルベースです。これは、核の外側と細胞質の内側との間の距離を反映しています。この値を大きくすると、核シグナルが細胞質区画に渡って横断する確率を減少させます。
   2. 次に、「核への外側の距離」を選択します。
      注：これはまたピクセルベースです。核への外側の距離は、核の外側とセルの外部との間の距離を反映しています。この値は、必要に応じて、膜の信号を含めるか除外するために十分な大きさまたは小さく設定することができます。
   3. 次に、「最小サイズ」を選択します。
      注：最小サイズ、PIXEベースLは、分析に含まれる最小の細胞質サンプルサイズを反映しています。細胞質のサイズは、細胞が密に一緒にパックされている場合など、特定のセル内の小さい場合には、この細胞質セグメントを分析から除外されています。
   4. 次のオプション、「プライマリ」、「セカンダリ」と「コンポーネント」を選択し、二次的なオプションとして「第三紀」を選択します。
      注：ここに1つは、特定の細胞質マーカーを選択することができます。特定の細胞質IHCマーカーが使用されている場合、核セグメンテーションと同様に、このコンポーネントは、最小閾値を見つけることによって、細胞質を定義するために使用することができます。これは、細胞質を定義するのに役立つが、許容精度のためには必要ではありません。
   5. 3タブ付きのオプションの最後に移動すると、「膜」です。ここでは、ユーザは、タンパク質マーカーを有する膜コンパートメントを画定します。使用する各膜の特定のマーカーのための「プライマリ」、「セカンダリ」、および/または「第三紀」を選択します。 「フルスケールOを調整します細胞膜上の各マーカーについての最小しきい値または正のを見つけるD」。
   6. 「膜」タブの下に継続し、オプション「最大セルサイズ」を選択します。
      注：これは、細胞の最大サイズを指定する、ピクセル単位で、メンブレン値までの距離です。 12の値は、20X倍率で撮影された画像のために、通常適切です。
   7. すべてのオプションを選択した後、「セグメントイメージ」または「セグメントすべて」を選択してください。画像に設定を適用し、「個別」または「ギャラリー」モードでそれらを観察します。
      注：画像のトレーニングセット内のセルの分割結果に満足するまで、必要に応じて設定およびしきい値を調整し、再セグメント。

細胞の表現型5.

注：正確な細胞分割は、正確な細胞表現型を得るために必要な、と表現型の特徴は、トレーニング可能です。

1. 「追加＆使用＃34; 「表現型」リストに表現型を追加するためのボタン。ユーザーは、表現型の色を選択することができます。
2. 細胞に表現型を割り当てるために、「編集表現型」をクリックします。ユーザーが表現型を選択し、上に移動することができ、ドロップダウンメニューを表示するために特定のセルをクリックします。続行するために、各表現型の少なくとも5（5）細胞を同定します。各表現型の25以上のセルを選択することは、最適な結果を達成するために必要とされます。

6.得点IHCと共局在

1. 「IHCスコアまたはIF」のステップに移動するには、「アドバンス」を選択します。スコアに「組織カテゴリ」を選択します。
   注：のみ1つの組織のカテゴリは、特定の分析の間に得点することができますが、別の組織カテゴリの採点結果が所望される場合、分析は異なる設定で、後に繰り返すことができます。
2. 所望の「スコアリング」タイプを選択します。
   注：陽性は、目的のコンポーネントのための（正と負）は、2つのビンを作成し、二重陽性の共局在の分析のために使用されます。他のオプションは4ビン、10ビン、および50-ビンの選択のマーカーの分析が含まれます。
3. スコアリング解析に使用される「コンパートメント」のセルを選択します。
4. 一次核コンポーネントの最小しきい値を見つけると同様に、「ビューコンポーネントデータ」を選択し、目的の成分（複数可）のための陽性細胞についての染色の適切な光学密度の最小しきい値を見つけるために、訓練画像の上にカーソルを移動します。
5. 強く染色された細胞が除外される場合は、適切なレベルに閾値maxを下げます。それ以外の場合は、分析のためのしきい値最大値を選択するために、オートボタンを使用します。
6. しきい値の値を検証するために得点するためにトレーニング画像を選択してください。
   注記：特定のビン内の細胞の割合が返され、目視検査または手動計数によって比較することができます。完了したら、「エクスポート」のステップに進むために「アドバンス」を選択します。

1. トレーニングセットのデータをエクスポートすることにより、組織のセグメンテーション、セル分割、およびスコアリング値を使用して作成アルゴリズムをテストします。エクスポートディレクトリのための新しいフォルダを作成するために、画面の指示に従ってください。画像を選択し、テーブルが作成され、分析に含まれます。 「みんなのエクスポート」を選択して分析を行います。
2. テーブルは、タブ区切りのテキストフ​​ァイルにエクスポートされ、ほとんどのデータ解析プログラムで開くことができます。
3. 分析が完了すると、設定の精度を評価するためにハイとローの両方の染色画像のためのセル分割・スコアリングデータを表示します。
4. 設定が完了したら、バッチ分析を介して画像のセット全体への画像のトレーニングセットから作成されたアルゴリズムを適用します。 「バッチ分析」タブをクリックし、オープンされたアルゴリズムは、アクティブなプロジェクトからコピーされます。
5. 新しいエクスポートディレクトリを選択し、その画像やTABLを選択ESは、分析に含まれるべきです。入力ファイルのオプションでは、「画像を追加」し、バッチ分析に含まれるべきすべての画像を選択]を選択します。
6. 「ファイル名を指定して実行」オプションを選択して分析を行います。トレーニングセットの分析と同様に、このステップは、特定の設定及び分析に含まれる画像の数に応じて、時間の可変量を必要とします。
7. 完了すると、「レビュー/マージ」タブに進みます。バッチ分析からエクスポートディレクトリにバッチディレクトリのデフォルトは、必要に応じて変更することができます。選択して「すべて含む」と分析のための要約データとデータシートを作成するために「マージ」を選択します。

エクスポートされたデータの8解析

1. データ解析ソフトウェアでエクスポートしたテーブルを開き、削除するか、そのような各コンポーネントの最小値と最大値などの解析に無関係なデータ列を、非表示にします。分析に使用される主なデータは、平均光学濃度cでありますすべてのコンポーネントのためのolumn。
2. レビューは、分析から除外されるべきサンプルまたはTMAコアを決定するためにセグメンテーションマップと原画像を輸出しました。組織のパーセント値は、除外基準に最も頻繁に使用される、<5％の任意のカットオフを用いて、サンプルが含まれるべきかどうかを決定するかに役立ちます。
3. 無関係なデータやサンプルを含む行はデータ分析から除外されるように削除します。
4. 病状の変化や病気^12,18-21の臨床病理学的特性との関係を調査するために、タンパク質の定量データを使用してください。

図1において、訓練は、非組織コンパートメントと共に、上皮および間質の部分に分割画像に前立腺組織上で行われます。上皮細胞膜マーカーE-カドヘリンを使用することにより、細胞分割は、 図2に示した核、細胞質、膜部分を分離するために行きました。

1つの実験において、我々は、 図3に示すように、AR、ERα、E-カドヘリン、およびCD147の発現と局在化を調査するために、多重化IHCを使用する。これらの技術を使用して、我々は両方のERαの核発現について陽性の細胞を識別することができると図3Aの緑色の矢印で示すように、比色信号をオーバーラップにもかかわらず- AR（3C 図3B）。私たちは、広報の異なる状態の中の二重陽性間質細胞の割合の著しい違いを発見しましたostate疾患（ 図3D）。我々は、細胞膜に特異的なマーカータンパク質（ 図3Aの赤い矢印）としてE-カドヘリンを使用して、CD147の発現を定量化し、そして我々は、前立腺組織における膜の特定のCD147の発現を調査するための最初のグループでした。私たちは、前立腺癌の進行（ 図3E）に関連してCD147発現の有意な減少を発見し、手術後の予後¹⁹との重要な関連性を発見しました。

貧弱な実験設計は不正確な組織分割につながることができますインスタンスがあります。 図4において、アルゴリズムは、組織のセットに適用しなかった正確セグメント上皮およびストローマの区画（ 図4C）。この実験では、α平滑筋アクチン（α-SMA）は、間質区画をマークするために使用されました。 α-SMAおよび平滑筋は、いくつかの腫瘍において減少または消失したので（Figu）図4（a）再、組織のセグメンテーション（ 図4B）を介して作成されたアルゴリズムは、正確に、単独で形態計測データからの上皮と間質コンパートメントを区別することができませんでした。組織または細胞コンパートメントのためのタンパク質マーカーを選択する際には注意が必要です。

図1：マルチスペクトルイメージングソフトウェアを使用して組織セグメンテーション 。前立腺組織マイクロアレイは、アンドロゲン受容体（AR）、エストロゲン受容体α（ERα）​​、E-カドヘリン、およびCD147のための多重免疫組織化学を用いて染色しました。トレーニング画像のセットは、組織の種類や画像の全体のセット（A）の疾患状態を表すマルチスペクトル画像化ソフトウェアにインポートしました。組織のカテゴリは間質（緑）、上皮（赤）、および非組織（青）を含む作成された、およびカテゴリを手動で上に描画することによって定義されていましたトレーニング画像（B）の。訓練画像に描画した後、組織のセグメンテーションのためのアルゴリズムが作成され、画像（C）のトレーニングセットに適用される。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2：核、細胞質、および膜コンパートメントへの細胞セグメンテーション 。核コンパートメントはヘマトキシリン対比染色（A）の最小しきい値を設定することにより、細胞分割のために定義されました。細胞質は、ソフトウェア（B）内に予め設定されたアルゴリズムを使用して、核に関連して定義しました。 E-カドヘリンは、膜マーカーとして使用し、最小平均ODの閾値は、膜区画（C）を定義するために適用しました。この技術は、すべてのすべての細胞内区画（D）におけるタンパク質発現の同時定量OWS。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3：共局在および膜特異的タンパク質発現の分析 。多重IHCは、アンドロゲン受容体（AR）、エストロゲン受容体α（ERα）、E-カドヘリン、およびCD147（A）の発現および局在を調べました。 DAB（褐色色素原）は、AR（B）およびERα（C）をマークするために使用される赤色色素原をマークするために使用されました。私たちは、ERαとARの核共局在と細胞の割合（D）、空間的にオーバーラップするバイオマーカー（Aの緑色の矢印）を特定し、定量化することができました前立腺間質内。原形質膜（A赤矢印）を定義するために、E-カドヘリン（黒色素原）を使用して、我々は、前立腺組織^（E）19内CD147の膜特異的発現を定量しました。一元配置分散分析（ANOVA）は統計分析のために使用された、エラーバーは平均の標準誤差を反映し、アスタリスクは、p <0.05を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4：実験計画から得られた不十分な組織セグメンテーション 。 、アンドロゲン受容体（赤色素原）、およびアンドロゲン受容体の変異体7（DAB色素原）、良性と悪性の前立腺組織は、α平滑筋アクチン（緑色色素原α-SMA）について染色しました。 α-SMAを使用しました支質のマーカーとは、前立腺（A）を含む、いくつかの腫瘍において減少します。訓練が行われた（B）と組織の分割アルゴリズムを適用した場合には、間質および上皮区画が原因でα-SMA染色（C）が存在しないために不十分なセグメント化された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

タンパク質の発現を評価するための伝統的な免疫組織化学の使用は、分析^22,23の主観的、半定量的な方法によって制限されます。アドバンス・プラットフォームは、バイオマーカーの発現と局在のハイスループット分析のために作成されています。組織および細胞内区画の両方の詳細なセグメンテーションは、ユーザーが関心のある他のマーカーとバイオマーカーの発現、局在化、および共局在を研究することができます。以前の研究では、我々は同じ細胞区画^18,20,21に局在するタンパク質を研究するために使用される場合は特に、IHCの有用性とマルチスペクトル画像を実証しました。組織マイクロアレイ²⁴と組み合わせると、これらの技術は、病理学者によって手動分析によって許容されるよりも、タンパク質発現のより速く、より客観的な定量化を可能にします。

タンパク質定量のための免疫組織化学を用いた1つの問題はsubjecによる結果の非再現性であります分析と技術および試薬に固有の差異の的性質。タンパク質の発現を測定するためにマルチスペクトル画像のようなプラットフォームを使用することの重要な利点は、結果の再現性です。 ^12,16,25のサイズの連続形式でデータを返すと、実質的に、特に大規模なサンプルで作業する場合、作業時間を削減しながら、コンピュータ病理プラットフォームからのデータは、病理学者によって手動分析と非常に相関しています。研究は、異なるマルチスペクトルプラットフォーム¹⁴と^の間^の結果に高い全体の一致を示しています。さらに、我々は以前に、タンパク質の数は^12を調査の変動があっても、染色結果は、高度に再現可能であることを実証しました。染色および分析の両方のための自動化された病理プラットフォームの使用は、異なるエピトープに向けて作成された抗体に由来するものなどの結果、内のすべての矛盾を解消しませんが、これらのプラットフォームは、バイアスおよびIRを低減し、実質的にありません再現性は、一般的に、免疫組織化学に関連付けられています。

正確な、再現性のある結果を返すために不可欠なプロトコル内の特定のステップがあります。組織または細胞内マーカーとして含まれるべきタンパク質を選択することで、適切な実験デザインは、正確なセグメンテーションのために重要です。陽性の分析を行う場合、陽性染色のための下限閾値の選択は、最終結果に大きく影響します。このような核内転写因子のような "オン/オフ"タンパク質のしきい値を選択すると、かなり単純ですが、より不均一に発現されたタンパク質のための閾値を見つけることは困難です。これは、理想的には、ボード認定泌尿生殖器の病理学者または分析のための理想的な閾値を見つけるために、複数の観察者全体の平均スコアと協力して行われるべきです。

この技術の現在のバージョンのいくつかの限界を認識することが重要です。解除するとき細胞質コンパートメント清澄、3つのアプローチを使用することができる：（1）（2）膜の特異的マーカーで染色し、細胞質に特異的なマーカーで染色し、核から膜、細胞質などのマーカーの距離を使用して、そして（3）使用します手動での核に関連して、細胞質の境界を定義するための図でアプローチ。私たちの経験から、膜特異的マーカーを使用すると、最も正確な手法です。核は中央に配置されている場合、または関心のバイオマーカーが均一に細胞質全体に分散されている場合、手動描画アプローチは、通常、正確です。正確に線維芽細胞および平滑筋細胞などの間質細胞の細胞質を定義することは難しいままであり、実験を設計する際に考慮されるべきです。

技術の別の制限は、細胞分割の核に依存しています。セクションの平面は、特定の細胞の核を除外した場合、このセルは、分析には含まれません。ある場合はありません隣接する核や核の塊の間に目に見える細胞質は、これらは多くの場合、むしろ明確な核よりも、一つの大きな核の塊として認識されています。一般的に言えば、ヘマトキシリン​​対比は、例えば、核セグメンテーションとほとんどの問題を修正することができ、核サイズの最大閾値として許容可能な核のセグメンテーション、およびソフトウェア設定の操作のため、通常十分です。

自動化された病理プラットフォームの最終的な制限は、貧しい実験設計に起因する組織の信頼性の低いセグメント化です。関心の質問に答えるための適切な組織および細胞バイオマーカーを選択することの重要性は誇張することはできません。私たちは私たちの代表的な結果で実証されているように、組織のセグメンテーションのためのアルゴリズムを作成する際に、大幅に疾患状態との間で発現が変化する上皮または間質マーカーは、問題を提起することができます。このような困難な分析が発生した場合の代替オプションがあることは注目に値します。例えば、個々のIMAGESは手動で全ての組織区画を描画することによってではなく、画像のトレーニングセットからアルゴリズムを適用することによって分析することができます。これは、完全にユーザが希望するものと一致している分割の利点を提供するが、それはまた、主観を導入し、大幅に分析を完了するために必要な時間を増加させることができます。適切な実験計画は、分析を促進し、組織および細胞のセグメンテーションの精度を最大化する最も簡単な方法です。

この技術およびプロトコルは、多くの将来のアプリケーションを持っています。特定の疾患状態のための多数のバイオマーカーが同定されたが、検証されませんされています。マルチスペクトルプラットフォームとハイスループット客観的な分析は、これらのバイオマーカーの検証を容易にします。さらに、発現および複数のタンパク質の共局在の評価は不十分な理解シグナル伝達経路への洞察を提供することができます。確かに、免疫組織化学的stainiの分析に関連する固有の主観性を減らしますngのタンパク質マーカーの広い範囲の発現と局在を理解するための貴重なものです。

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

著者は、その設備とサービスの利用のために、病理検査医学のUW省によってサポートされている部分とUWCCCグラントP30のCA014520で、病理検査室にウィスコンシントランスレーショナルリサーチの取り組みの大学に感謝します。